Test génétique préimplantatoire pour l’aneuploïdie sur une plateforme de séquençage de nouvelle génération à base de semi-conducteurs
Summary
Le protocole présente l’ensemble des procédures en laboratoire requises pour les tests génétiques préimplantatoires pour l’aneuploïdie sur une plate-forme de séquençage de nouvelle génération à base de semi-conducteurs. Nous présentons ici les étapes détaillées de l’amplification du génome entier, de la sélection des fragments d’ADN, de la construction de la bibliothèque, de la préparation du modèle et du flux de travail de séquençage avec des résultats représentatifs.
Abstract
Le séquençage de nouvelle génération a acquis une importance croissante dans l’application clinique dans la détermination des variantes génétiques. Dans le test génétique préimplantatoire, cette technique présente des avantages uniques en termes d’évolutivité, de débit et de coût. Pour le test génétique préimplantatoire pour l’analyse aneuploïdique, le système de séquençage de nouvelle génération (NGS) à base de semi-conducteurs présenté ici fournit une approche globale pour déterminer les variantes génétiques structurelles à une résolution minimale de 8 Mb. De l’acquisition de l’échantillon au rapport final, le processus de travail nécessite plusieurs étapes dans le respect strict des protocoles. Étant donné que diverses étapes critiques pourraient déterminer le résultat de l’amplification, la qualité de la bibliothèque, la couverture des lectures et la sortie des données, des informations descriptives avec une démonstration visuelle autre que des mots pourraient offrir plus de détails sur l’opération et la manipulation, ce qui peut avoir un impact important sur les résultats de toutes les étapes critiques. Les méthodes présentées ici présenteront les procédures impliquées dans l’amplification du génome entier (WGA) des cellules trophectodermiques biopsiées (TE), la construction de la bibliothèque génomique, la gestion du séquenceur et, enfin, la génération de rapports de variantes de nombre de copies.
Introduction
L’aneuploïdie est l’anomalie du nombre de chromosomes par la présence d’un ou plusieurs chromosomes supplémentaires ou l’absence d’un ou plusieurs chromosomes. Les embryons porteurs d’un certain type d’aneuploïdie, comme la perte d’un chromosome X (syndrome de Turner), des copies supplémentaires d’autosomes, comme les trisomies de l’autosome 21 (syndrome de Down), 13 (syndrome de Patau) et 18 (syndrome d’Edwards), ou des chromosomes sexuels supplémentaires tels que 47, XXY (syndrome de Klinefelter) et 47, XXX (syndrome Triple X), peuvent survivre à terme avec des malformations congénitales1. L’aneuploïdie est la principale cause des fausses couches du premier trimestre et de l’échec de la fécondation in vitro (FIV)2. Il est rapporté que le taux d’aneuploïdie pourrait varier de 25,4% à 84,5% à travers les différentes couches d’âge du cycle naturel et du groupe témoin médicamenteux dans la pratique de FIV3.
La technologie de séquençage de nouvelle génération est de plus en plus largement appliquée dans la détermination clinique de l’information génétique; Il fournit un accès pratique à la séquence du génome avec efficacité et un débit élevé. En particulier, le séquençage de nouvelle génération a également révolutionné le diagnostic des troubles avec des facteurs génétiques et les tests d’anomalie dans le génome4. Utilisant la technologie de séquençage des semi-conducteurs pour transférer directement les signaux chimiques dans le séquençage de la bioréaction en données numériques, le système de séquençage à base de semi-conducteurs fournit une détection directe et en temps réel pour séquencer les données en 3-7 h 5,6.
Dans une procédure de FIV, le test génétique préimplantatoire (PGT) étudie le profil génétique de l’embryon avant d’être transféré dans l’utérus afin d’améliorer les résultats de la FIV et de réduire le risque de troubles génétiques chez les nouveau-nés 1,7. Dans le PGT combiné avec les techniques NGS, le matériel génétique extrait de moins de 10 cellules est amplifié avec des kits d’amplification du génome entier ou un réactif d’amplification du génome entier développé indépendamment. Cela ne nécessite qu’une seule étape dans la phase d’amplification et ne nécessite pas de pré-amplification, pour obtenir des produits d’amplification du génome entier. Des amorces ou des panneaux pour la variante du nombre de copies et le séquençage spécial des loci géniques sont conçus et appliqués dans la bibliothèque construite.
Un flux de travail typique de tests génétiques préimplantatoires aneuploïdie (PGT-A) dans NGS implique des procédures en série et nécessite une charge de travail intense de personnel de laboratoire8. Une mauvaise opération a entraîné l’annulation de la procédure peut entraîner une perte indésirable de temps et de ressources du laboratoire. Une procédure opérationnelle normalisée (PON) concise et claire pour le flux de travail PGS-NGS est utile; Toutefois, les protocoles au format Word ne peuvent pas présenter d’informations plus détaillées sur le traitement des échantillons, la manipulation des périphériques et les paramètres des instruments, qui peuvent être visualisées dans un protocole vidéo. Dans cet article, un flux de travail validé combiné à une démonstration visualisée des détails de fonctionnement pourrait offrir des protocoles de référence plus directs et intuitifs dans la pratique du PGT sur une plate-forme de séquençage de semi-conducteurs.
Le protocole décrit ici une méthode qui prend en charge le dosage de jusqu’à 16 biopsies embryonnaires en parallèle. Pour les lots plus importants, il est recommandé d’utiliser un protocole commercial basé sur un kit pour le séquençage des semi-conducteurs, tel que Reproes-PGS.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’aneuploïdie chromosomique des embryons est à l’origine d’une grande partie des pertes de grossesse, qu’elles soient conçues naturellement ou par fécondation in vitro (FIV). Dans la pratique clinique de la FIV, il est proposé que le dépistage de l’aneuploïdie embryonnaire et le transfert de l’embryon euploïdie pourraient améliorer les résultats de la FIV. L’hybridation in situ par fluorescence est la première technique adoptée pour la sélection du sexe et la PGT-A; Cependant,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Zhangyong Ming et M. Rongji Hou pour leurs conseils sur l’application élargie du LIMS. Cette étude est soutenue par les projets de recherche spéciaux de l’APL pour la planification familiale (17JS008, 20JSZ08), le Fonds du Laboratoire clé de recherche sur les maladies métaboliques du Guangxi (n ° 20-065-76) et le Projet de recherche sur les sciences et technologies de la santé citoyenne de Guangzhou (201803010034).
Materials
| 0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
| DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
| OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
| PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
| Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |
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