반도체 기반 차세대 시퀀싱 플랫폼에서 Aneuploidy에 대한 이식 전 유전자 검사
1Centre for Women, Children, and Reproduction,Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology,Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory,Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.
Summary
이 프로토콜은 반도체 기반 차세대 시퀀싱 플랫폼에서 이수성에 대한 이식 전 유전자 검사에 필요한 전체 실험실 내 절차를 제시합니다. 여기에서는 전체 게놈 증폭, DNA 단편 선택, 라이브러리 구축, 템플릿 준비 및 대표적인 결과와 함께 시퀀싱 작업 흐름의 자세한 단계를 제시합니다.
Abstract
차세대 시퀀싱은 유전자 변이의 결정에서 임상 적용에서 점점 더 중요해지고 있다. 이식 전 유전자 검사에서이 기술은 확장 성, 처리량 및 비용면에서 고유 한 이점을 가지고 있습니다. 이수성 분석을 위한 이식 전 유전자 검사의 경우, 여기에 제시된 반도체 기반 차세대 염기서열 분석(NGS) 시스템은 최소 8Mb의 분해능으로 구조적 유전 변이를 결정하는 포괄적인 접근법을 제공합니다. 샘플 수집에서 최종 보고서에 이르기까지 작업 프로세스에는 프로토콜을 밀접하게 준수하는 여러 단계가 필요합니다. 다양한 중요한 단계가 증폭의 결과, 라이브러리의 품질, 읽기 범위 및 데이터 출력을 결정할 수 있기 때문에 단어 이외의 시각적 데모를 통한 설명 정보는 모든 중요한 단계의 결과에 큰 영향을 줄 수있는 작업 및 조작에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다. 본원에 제시된 방법은 생검된 트로피오배엽 (TE) 세포의 전체 게놈 증폭 (WGA), 게놈 라이브러리 구축, 시퀀서 관리, 및 마지막으로 카피 번호 변이체 생성 보고에 관여하는 절차를 디스플레이할 것이다.
Introduction
Aneuploidy는 하나 이상의 여분의 염색체의 존재 또는 하나 이상의 염색체의 부재에 의한 염색체 수의 이상이다. 하나의 X 염색체 손실 (터너 증후군), 상염색체 21 (다운 증후군), 13 (파타우 증후군) 및 18 (에드워즈 증후군)의 트리솜과 같은 상염색체의 여분의 사본 또는 47, XXY (Klinefelter syndrome) 및 47, XXX (트리플 X 증후군)와 같은 여분의 성 염색체와 같은 일부 유형의 이수성을 지닌 배아는 출생 결함1과 함께 용어까지 생존 할 수 있습니다. Aneuploidy는 첫 번째 삼 분기 유산 및 체외 수정 (IVF) 실패의 주요 원인입니다2. 이수성 비율은 IVF 연습3에서 자연주기와 약용 대조군의 다른 연령층을 통해 25.4 % -84.5 %의 범위 일 수 있다고보고되었습니다.
차세대 염기서열 분석 기술은 임상적으로 유전 정보의 결정에 격렬하게 적용되고있다; 그것은 효율성과 높은 처리량으로 게놈 서열에 대한 실질적인 접근을 제공합니다. 특히, 차세대 시퀀싱은 유전 적 요인을 가진 장애의 진단과 게놈 4의 비정상성에 대한 검사에 혁명을일으켰습니다. 반도체 시퀀싱 기술을 사용하여 시퀀싱 바이오 반응의 화학 신호를 디지털 데이터로 직접 전송하는 반도체 기반 시퀀스 시스템은 3-7 h 5,6의 시퀀스 데이터에 대한 직접적이고 실시간 감지를 제공합니다.
IVF 절차에서 이식 전 유전자 검사 (PGT)는 IVF 결과를 개선하고 신생아의 유전 질환의 위험을 줄이기 위해 자궁으로 옮겨지기 전에 배아의 유전 적 프로파일을 조사합니다 1,7. NGS 기술과 결합된 PGT에서, 10개 미만의 세포로부터 추출된 유전 물질은 전체 게놈 증폭 키트 또는 독립적으로 개발된 전체 게놈 증폭 시약으로 증폭된다. 이것은 증폭 단계에서 단 한 단계만을 필요로 하며, 전체 게놈 증폭 산물을 얻기 위해 사전 증폭을 필요로 하지 않는다. 카피 수 변이체 및 특수 유전자 유전자좌 시퀀싱을 위한 프라이머 또는 패널은 구축된 라이브러리에 설계되고 적용된다.
NGS에서 이식 전 유전자 검사-이수성(PGT-A)의 전형적인 워크플로우는 일련의 절차를 포함하며, 실험실 인력의 집중적인 작업량을 필요로 한다8. 일부 오작동으로 인해 절차 롤백이 발생하면 실험실의 시간과 자원이 바람직하지 않게 손실 될 수 있습니다. PGS-NGS 워크플로우를 위한 간결하고 명확한 표준 운영 절차(SOP)가 도움이 됩니다. 그러나 단어 형식 프로토콜은 비디오 프로토콜에서 시각화할 수 있는 샘플 처리, 장치 조작 및 계측기 설정에 대한 자세한 정보를 제공할 수 없습니다. 이 기사에서는 검증된 워크플로우와 작동 세부 사항에 대한 시각화된 데모가 결합되어 반도체 시퀀싱 플랫폼의 PGT 관행에서 보다 직접적이고 직관적인 참조 프로토콜을 제공할 수 있습니다.
여기의 프로토콜은 최대 16 개의 배아 생검을 병렬로 일괄 처리하는 것을 지원하는 방법을 설명합니다. 더 큰 배치의 경우 Reproes-PGS와 같은 반도체 시퀀싱을 위한 상용 키트 기반 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다.
Protocol
본 연구에 적용된 모든 프로토콜과 트로피코더럴(TE) 생검(1.1.1.1 섹션)은 2017년 9월 18일 제924호 병원의 인간 연구 윤리위원회에 의해 검토되고 승인되었다(NO: PLA924-2017-59). 환자 / 참가자는이 연구에 참여하기 위해 서면 정보에 입각 한 동의서를 제공했습니다. 1. 인간 배아 생검 및 전체 게놈 증폭으로부터의 DNA 분리 전체 게놈 증폭을 위한 프로토콜<sup class="…
Representative Results
시퀀스 계획이 머신에서 실행 중인 프로세스 후에 완료되면 시퀀스 서버 시스템은 그림 2와 같이 생성된 데이터, 칩 상태, ISP 로딩 속도 및 라이브러리 품질에 대한 설명 정보와 함께 요약을 보고합니다. 이 결과 데모에서 총 베이스에서 17.6G 데이터가 얻어졌으며 ISP의 전체 로딩 속도는 칩의 총 웰에서 88 %였습니다. 히트 맵은 샘플이 칩의 전체 면적에 고르게 로딩되었음을 ?…
Discussion
배아의 염색체 이수성은 자연적으로 임신하든 체외 수정 (IVF)이든 임신 손실의 큰 비율의 원인입니다. IVF의 임상 실습에서, 배아 이수성을 스크리닝하고 유플로이드 배아를 옮기는 것이 IVF의 결과를 향상시킬 수 있다고 제안된다. 계내 형광 혼성화는 PGT-A성 선택 및 PGT-A를 위해 채택된 최초의 기술이다; 그러나이 기술은 실험실 직원으로부터보다 기술적 인 전문 지식이 필요하며 상?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 LIMS 확장 응용 프로그램에 대한 조언에 대해 Zhangyong Ming 박사와 Rongji Hou 씨에게 감사드립니다. 이 연구는 PLA 가족 계획 특별 연구 프로젝트 (17JS008, 20JSZ08), 광시 대사 질환 연구 연구소 기금 (No.20-065-76) 및 광저우 시민 건강 과학 기술 연구 프로젝트 (201803010034)가 지원합니다.
Materials
| 0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
| DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
| OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
| PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
| Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |
References
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Citer Cet Article
Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L., Wang, L., Li, D., Den, H., Qin, W., Wen, P., Liu, Y., Wu, Y., Ma, Q., Duan, J. Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (186), e63493, doi:10.3791/63493 (2022).