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Bioengineering

Inactivación de patógenos mediante fotólisis con luz visible de riboflavina-5′-fosfato

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63531
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para inactivar bacterias patógenas con especies reactivas de oxígeno producidas durante la fotólisis del mononucleótido de flavina (FMN) bajo irradiación de luz azul y violeta de baja intensidad. Se ha demostrado que la fotólisis FMN es un método simple y seguro para procesos sanitarios.

Abstract

Riboflavina-5'-fosfato (o mononucleótido de flavina; FMN) es sensible a la luz visible. Se pueden generar varios compuestos, incluidas las especies reactivas de oxígeno (ROS), a partir de la fotólisis FMN tras la irradiación con luz visible. Las ROS generadas a partir de la fotólisis FMN son perjudiciales para los microorganismos, incluidas las bacterias patógenas como Staphylococcus aureus (S. aureus). Este artículo presenta un protocolo para desactivar S. aureus, como ejemplo, a través de reacciones fotoquímicas que involucran FMN bajo irradiación de luz visible. El anión radical superóxido () generado durante la fotólisis FMN se evalúa mediante la reducción de nitro azul tetrazolio (Equation 1NBT). La viabilidad microbiana de S. aureus que se atribuye a especies reactivas Equation 1 se utilizó para determinar la efectividad del proceso. La tasa de inactivación bacteriana es proporcional a la concentración de FMN. La luz violeta es más eficiente para inactivar S. aureus que la irradiación de luz azul, mientras que la luz roja o verde no impulsa la fotólisis FMN. El presente artículo demuestra la fotólisis FMN como un método simple y seguro para procesos sanitarios.

Introduction

La riboflavina-5′-fosfato (FMN) se forma por fosforilación en la posición de riboflavina 5′ de la cadena lateral ribitil y es requerida por todas las flavoproteínas para numerosos procesos celulares para generar energía. También desempeña el papel de vitamina para algunas funciones en el cuerpo humano1. FMN es aproximadamente 200 veces más soluble en agua que la riboflavina2.

La inactivación fotodinámica antibacteriana (aPDI) de las bacterias es una forma eficiente de controlar la resistencia a las bacterias 3,4 porque no depende del modo de resistencia bacteriana. Clínicamente, aPDI se utiliza para tratar infecciones de tejidos blandos con el fin de disminuir la infección de la piel nosocomial debido a bacterias multirresistentes 5,6,7,8,9. aPDI también produce muerte celular mediante la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Las ROS, como los radicales superóxido (), el oxígeno singlete, los radicales hidroxilo (Equation 1•OH) y los radicales peroxilo, son radicales libres o moléculas que contienen oxígeno reactivo 10,11,12 y normalmente son reactivas 13. Al igual que el daño del ADN causado por ROS, la peroxidación de la membrana y la destrucción de las células endoteliales también son reacciones bioquímicas adversas que se atribuyen a ROS en las células12.

El uso de aPDI para bacterias patógenas implica una fuente de luz visible o UV para inactivar microorganismos en presencia de compuestos químicos, como cloruro de metiltioninio 14, PEI-ce6 conjugado 15, porfirina 16, dióxido de titanio17, azul de toluidina O 18 y nanopartículas de óxido de zinc 19. El azul de toluidina O y el azul de metileno son colorantes de fenotiazinio y el azul de metileno tiene propiedades tóxicas. Las nanopartículas de óxido de zinc y la irradiación UV están relacionadas con efectos adversos para la salud y el medio ambiente. Como tal, la explotación de un fotosensibilizador confiable, seguro y simple a través de fotólisis bajo irradiación visible merece un estudio más profundo.

El micronutriente, riboflavina o FMN, no es tóxico y de hecho se utiliza para la fabricación de alimentos o la alimentación20. Tanto la FMN como la riboflavina son altamente sensibles a la irradiación lumínica2. Bajo UV 1,2,21,22,23 e irradiación de luz azul10,24, estos dos compuestos alcanzan un estado excitado. La riboflavina activada o FMN que se produce por fotólisis es promovida a su estado triplete y se generan ROS simultáneamente 2,25. Kumar et al. informaron que la riboflavina activada por la luz UV selectivamente causa un aumento de la lesión a la fracción guanina del ADN en microorganismos patógenos26. Bajo irradiación por luz UV, se ha demostrado que la riboflavina activada fotodinámicamente promueve la generación de 8-OH-dG, que es un biomarcador para el estrés oxidativo, en el ADN bicatenario27. Se reporta que S. aureus y E. coli son desactivadas por ROS durante la fotólisis de riboflavina o FMN 10,24,28. Un estudio previo realizado por los autores mostró que las reacciones fotolíticas que involucran riboflavina y FMN reducen el cristal violeta, un colorante triarilmetano y un agente antibacteriano que generaEquation 1, y eliminan la mayor parte de la capacidad antimicrobiana del cristal violeta28. Cuando el dinucleótido de flavina adenina o FMN es irradiado por luz azul, los ROS resultantes producen apoptosis en las células HeLa para su envenenamiento in vitro29. Utilizando tratamiento fotoquímico en presencia de riboflavina, Cui et al. inactivaron linfocitos inhibiendo su proliferación y producción de citoquinas30.

La fotólisis de la riboflavina se utiliza para la inactivación del patógeno sanguíneo por UV 10,24, pero los componentes sanguíneos pueden verse afectados bajo la irradiación de luz UV30. También se informa que las plaquetas expuestas a UV mejoran progresivamente el rendimiento de los marcadores de activación P-selectina y LIMP-CD63 en sus membranas. Es necesario investigar la citotoxicidad de la radiación UV y de alta intensidad y sería de gran utilidad un fotosensibilizador que no sea complicado y seguro durante una fotorreacción FMN que involucre luz visible.

La luz de longitudes de onda más cortas tiene más energía y es mucho más probable que cause daños graves a las células. Sin embargo, en presencia de un fotosensibilizador adecuado, la irradiación con luz violeta de baja intensidad puede inhibir los microorganismos patógenos. Por lo tanto, es importante estudiar la fotosensibilización y la generación de FMN cuando se irradia con luz violeta, para determinar la vía por la cual las ROS de la fotólisis de FMN aumentan la inactivación de Equation 1 las bacterias.

El control antimicrobiano es un problema común y el desarrollo de nuevos antibióticos con frecuencia lleva décadas. Después de la irradiación con luz violeta, la fotoinactivación intermediada por FMN puede aniquilar bacterias patógenas ambientales. Este estudio presenta un protocolo antimicrobiano efectivo in vitro utilizando luz violeta para conducir la fotólisis FMN y así generar Equation 1 para aPDI. La viabilidad microbiana de S. aureus se utiliza para determinar la viabilidad de la aPDI inducida por FMN.

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Protocol

1. Configuración del sistema de fotólisis

  1. Monte seis diodos emisores de luz (LED) (DC 12 V) en el interior de un vaso de plástico opaco (8 cm x 7 cm) como se muestra en la Figura 1 para establecer un sistema de fotólisis31.
  2. Agregue reactivos (ver más abajo) en los tubos de ensayo de vidrio (13 mm de diámetro y 100 mm de altura) y asegure los tubos en la parte superior de la copa como se muestra en la Figura 1. Coloque la configuración experimental en una habitación con una temperatura constante de 25 ± 3 °C.
  3. Monitoree y registre la temperatura de las unidades de prueba a lo largo de las reacciones fotolíticas mediante un termómetro infrarrojo.
    NOTA: La Figura 2 muestra los espectros de emisión para luces azules, verdes, rojas y violetas, tal como se registran con un espectrómetro óptico UV-Vis calibrado. Las longitudes de onda correspondientes al máximo de absorbancia para las luces LED azules, verdes, rojas y violetas utilizadas en el estudio son 465, 529, 632 y 405 nm, respectivamente. Los chips LED pueden calentar el aparato durante los experimentos de irradiación. Por lo tanto, todo el sistema de fotorreacción en cada experimento se colocó en una habitación donde la temperatura se mantuvo constante a 25 ± 3 ° C.

2. El efecto de la longitud de onda de la luz en la fotólisis de FMN (Figura 3)

  1. Preparar una solución de FMN 0,1 mM en tampón fosfato de potasio (PB) de 100 mM (pH 7,8). Exponga muestras de FMN (3 ml cada una) a luz azul, verde, roja o violeta a una intensidad de 10 W/m2 durante 5 min. Mantenga 3 ml de solución de FMN en la oscuridad como control.
  2. Registrar la absorbancia de muestras de FMN irradiadas en el rango de 250-750 nm utilizando un espectrofotómetro UV/Visible.

3. Método de reducción de tetrazolio azul nitro (NBT) para detectar Equation 1 (Figura 4).

NOTA: El método de reducción de NBT utilizado aquí se modificó ligeramente del ensayo para la fotorreacción de riboflavina. El método de reducción de NBT se utiliza para evaluar el nivel de electrografía generada a partir de Equation 1 la fotólisis FMN. El FMN excitado fotoquímicamente es primero reducido por L-metionina en una semiquinona, que luego dona un electrón al oxígeno dando lugar a Equation 131. El as-generated Equation 1 reduce NBT a formazan, que tiene una absorbancia característica a 560 nm32.

  1. Añadir 109,3 mg de L-metionina a 73,3 ml de PB (100 mM; pH 7,8). Vortex la solución para disolver la L-metionina.
  2. Después de que la L-metionina esté completamente disuelta, agregue 10 mg de polvo de NBT y 1.53 ml de 0.117 mM FMN a la solución. Por cada 1 ml de la solución de reacción (es decir, una mezcla de FMN, L-metionina y NBT) aplicada, las concentraciones finales de FMN, metionina y NBT son 2.4 x 10-6 M, 1.0 x 10-2 M y 1.6 x 10-4 M, respectivamente.
  3. Exponer la solución de reacción (1 ml) a la irradiación de luz LED azul o violeta a 10 W/m2 durante 1-5 min.
  4. Detectar la especie (a partir de la absorbancia a 560 nm) producida por la Equation 1 reacción fotoquímica, que reduce NBT y produce formazan.

4. Viabilidad de S. aureus después de la fotólisis FMN (Figura 5)

  1. Transmitir una colonia de S. aureus (BCRC 10451) de una placa cultivada a 10 ml de caldo de lisogenia tomada en un tubo de ensayo con tapón de rosca de 15 ml. Cultivar en una coctelera a 37 °C durante 16 h.
  2. Transfiera 0,5 ml del cultivo a un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Agregue agua esterilizada en el tubo de centrífuga para diluir el cultivo a una densidad óptica de 0.5 a 600 nm (OD600) (~ 6 x 107 UFC/ml).
  3. Transfiera 0,5 ml del cultivo a un tubo centrífugo de 1,5 ml, centrifugar a 14.000 x g durante 10 min y decantar el sobrenadante para obtener un pellet celular.
  4. Añadir 1 ml de solución tamponada con FMN (30, 60 y 120 μM de FMN en PB) a los gránulos celulares obtenidos como en el paso 4.3, y vórtice. Para el control irradiado, añadir 1 ml de PB solo.
  5. Transfiera 1 ml de soluciones celulares bacterianas viables que contengan 30 μM de FMN y PB solas en tubos de vidrio, e irradiarlas con luz violeta a 10 W / m2 durante 30 min.
  6. Transfiera 1 ml de soluciones celulares bacterianas viables que contengan 30, 60 y 120 μM FMN y PB solos en tubos de vidrio e irradie con luz azul a 20 W / m2 durante 120 min. Coloque otro tubo de vidrio con 1 ml de solución celular bacteriana viable que contenga 120 μM de FMN e irradie con luz azul a 20 W / m2 durante 60 min.
  7. Coloque tubos de ensayo como se describe en los pasos 4.5 y 4.6 y cúbralos con láminas gruesas de aluminio. Estos tubos sirven como controles oscuros.
  8. Mantener la cámara de irradiación (así como los controles oscuros) en una cámara frigorífica a 9 ± 1 °C durante el período de irradiación de 30-120 minutos.
    NOTA: El calor liberado por las luces LED no se puede ignorar ya que los chips LED colocados dentro de la taza pueden calentar el sistema de fotorreacción durante los experimentos de irradiación. Por lo tanto, los experimentos se llevaron a cabo en una cámara frigorífica mantenida a 9 ± 1 °C.
  9. Después de la irradiación, transferir 0,2 ml de cada una de las soluciones de reacción a una placa de agar Luria (LA). Extienda las bacterias sobre la placa con una varilla de vidrio en forma de L e incube durante la noche a 37 °C.
  10. Calcule el recuento viable de placas y las tasas de inactivación de S. aureus después del crecimiento nocturno.
    NOTA: La tasa de inactivación de S. aureus se calcula como el porcentaje de reducción, que es igual a [1 -I / D] ×100%, donde I y D denotan, respectivamente, el número de UFC en la muestra irradiada y el control oscuro. El porcentaje de reducción se define como un valor negativo de la tasa de inactivación.

5. Detección de Equation 1 en S. aureus (Figura 6)

  1. Prepare las muestras de S. aureus como se describe en el paso 4.
  2. Diluir la densidad bacteriana de las muestras con agua esterilizada a una densidad óptica de 0,5 a 600 nm (OD600, ~6 x 106 UFC/ml). Transfiera 0,5 ml del cultivo a un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min y decantar el sobrenadante para obtener un pellet celular.
  3. Agregue 0.1093 g de L-metionina, 0.1 g de NBT y 25 ml de FMN (400, 240 o 120 μM) a 75 ml de PB. Por cada 1 ml del reactivo aplicado, las concentraciones finales de FMN, metionina y NBT son 100 (60 o 30) x 10-6 M, 7.3 x 10-3 M y 1.2 x 10-3 M, respectivamente.
  4. Añadir 1 ml de cada solución reactiva (es decir, con concentraciones variables de FMN) a los gránulos celulares obtenidos como en la etapa 5.2. Irradiar las soluciones con luz violeta a 10 W/m2 durante 10 min.
  5. Centrifugar la mezcla a 14.000 x g durante 10 min y decantar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) para extraer el NBT reducido. Detectar las especies producidas Equation 1 a partir de la absorbancia a 560 nm.

6. Análisis estadístico

  1. Expresar los datos como media ± desviación estándar (DE) de tres pruebas independientes.
  2. Aplique una prueba t homocedástica de dos muestras para evaluar si dos mediciones son diferentes. Los valores de p < 0,05 se consideran estadísticamente significativos.

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Representative Results

Efecto de la longitud de onda de la luz en FMN
Los espectros de absorbancia de 0,1 mM FMN que se irradian utilizando LED azules, verdes, rojos y violetas se muestran en la Figura 3. Hay dos picos para FMN (372 nm y 444 nm) para el control oscuro. La luz verde y roja no tienen ningún efecto porque los cambios en los espectros son insignificantes. Por otro lado, la absorbancia respectiva de FMN a 444 nm se reduce en aproximadamente un 19% y 34%, respectivamente, después de la irradiación de luz azul y violeta a 10 W / m2 durante 5 min, lo que sugiere que la irradiación con luz azul / violeta aumenta la fotólisis de FMN.

Detección de Equation 10 de FMN que se irradia con luz azul o violeta
La reducción de NBT se utilizó para determinar la formación de Equation 132. FMN es altamente sensible a la luz visible y UV incluso durante cortos períodos de radiación. Equation 1 se forma a partir de las reacciones fotoquímicas intermedias durante la fotólisis de FMN. La Figura 4 muestra que el efecto fotoquímico de la FMN en la reducción de NBT depende del tiempo de irradiación, ya que Equation 1 se forma a partir de FMN expuesto a la irradiación de luz azul o violeta de una manera dependiente del tiempo. Sin embargo, el efecto fotolítico promedio de la luz azul y la luz violeta es similar como se muestra en la Figura 4.

Efecto de la fotólisis FMN sobre la viabilidad de S. aureus
Se determinó el efecto de la FMN expuesta a irradiación de luz violeta o azul sobre la viabilidad de S. aureus. La fotólisis FMN utilizando irradiación de luz azul o violeta da como resultado una inactivación significativa de S. aureus. Cuanto mayor sea la concentración de FMN, mayor será la tasa de inactivación de S. aureus que se expone a la irradiación de luz azul a 20 W / m2 durante 120 minutos, como se muestra en la Figura 5A. Se lograron tasas de inactivación de 26%, 39%, 43% y 97% para S. aureus utilizando FMN de 0, 30, 60 y 120 μM, respectivamente, bajo irradiación de luz azul de 20 W / m2 durante 120 min. Como se muestra en la Figura 5A, no hay diferencia significativa (valor p = 0,20) en la tasa de inactivación de S. aureus utilizando irradiación con luz azul con FMN de 60 μM a 20 W/m2 durante 120 min (dosis de energía, 14,4 J/cm2) o 120 μM FMN a 20 W/m2 durante 60 min (dosis de energía, 7,2 J/cm2). Por otro lado, como se muestra en la Figura 5B, se alcanzaron tasas de inactivación del 53% y 96% para S. aureus sin y con 30 μM FMN, respectivamente, bajo irradiación de luz violeta a 10 W/m2 durante 30 min (dosis de energía de 1,8 J/cm2). Por lo tanto, FMN expuesto a la irradiación de luz azul o violeta tiene un mayor efecto sobre la viabilidad de S. aureus al aumentar la inactivación bacteriana. La FMN tratada con irradiación de luz violeta es más eficiente en la inactivación de S. aureus.

Detección de Equation 10 en S. aureus tratada con FMN bajo irradiación de luz violeta
La producción de S. aureus tratada con FMN bajo irradiación de luz violeta se determinó utilizando el método de reducción de Equation 1 NBT. El valor de absorbancia a 560 nm se utilizó para evaluar el grado de Equation 1 producción. El efecto fotoquímico de la FMN en la generación en Equation 1 S. aureus es proporcional a la concentración de FMN (Figura 6). Los valores de absorbancia de 560 nm para S. aureus sin tratamiento con FMN son 0,31 y 0,07 bajo irradiación de luz violetade 10 W/m2 durante 10 min y en la oscuridad, respectivamente (Figura 6). Esto sugiere que se produjo poco Equation 1 en S. aureus no tratado después de la irradiación de luz violeta. Los valores respectivos de absorbancia de 560 nm para S. aureus tratado con FMN de 100 μM son 1.36 y 0.08 bajo irradiación de luz violeta de 10 W / m2 durante 10 min y en la oscuridad, respectivamente. Por lo tanto, el efecto fotoquímico sobre la reducción de NBT en S. aureus tratado con FMN aumenta bajo irradiación violeta, ya que Equation 1 se produce abundantemente.

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática del sistema de fotorreacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Los espectros de emisión de luces LED azules, verdes, rojas y violetas en este estudio. Los máximos de emisión para las luces azul, verde, roja y violeta son de 465, 529, 632 y 405 nm, respectivamente, y los anchos espectrales a media altura (W1/2) son 26, 31, 14 y 12 nm, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Espectros de absorbancia de FMN tratados con LEDs de varias longitudes de onda a 10 W/m2 durante 5 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Reducción de NBT para determinar el efecto de la irradiación de luz azul y violeta a 10 W/m2 durante 1-5 min sobre la fotólisis FMN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Efecto de la fotólisis FMN sobre la viabilidad de S. aureus. El porcentaje de reducción se define como un valor negativo de la tasa de inactivación para S. aureus tratado con (A) FMN bajo irradiación de luz azul a 20 W/m2 durante 120 min y (B) FMN bajo irradiación de luz violeta a 10 W/m2 durante 30 min. Las concentraciones de FMN y los tiempos de irradiación se indican en la parte superior de la figura. Nótese que no hay diferencia significativa (p = 0,20) en la tasa de inactivación para S. aureus utilizando 60 μM FMN a 20 W/m 2 de irradiación de luz azul durante 120 min o 120 μM FMN a 20 W/m2 irradiación de luz azul durante 60 min (A). Los resultados se expresan como media ± DE, donde n = 3. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Efecto de la concentración de FMN sobre la Equation 10 generación en S. aureus sometido a irradiación de luz violeta a 10 W/m2 durante 10 min. En general, se produce poco Equation 1 en S. aureus en ausencia de FMN, aunque la irradiación de luz violeta aumenta Equation 1 ligeramente en la muestra irradiada (PB (luz violeta)) en relación con el control oscuro (PB (oscuro)). Los resultados se expresan como media ± DE, donde n = 3. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Un fotosensibilizador aumenta la reacción fotoquímica de los compuestos químicos para generar ROS. Los microorganismos patógenos pueden ser inactivados por irradiación de luz en presencia de fotosensibilizadores. Este estudio determina la aPDI de S. aureus debido a ROS generadas por irradiación de luz violeta de un fotosensibilizador exógeno, FMN.

Como se muestra en la Figura 3, para FMN, la absorbancia a 444 nm se reduce significativamente después de 5 min de irradiación usando luz violeta o azul y no hay cambios significativos en la absorbancia de FMN bajo irradiación con luz verde o roja. La reducción de NBT se utiliza para determinar la formación de a través de un proceso de transferencia de Equation 1 carga10,33. Un estudio previo realizado por los autores utilizó FMN bajo irradiación de luz azul, verde o roja para determinar la formación del uso de la reducción de Equation 1 NBT. La irradiación de luz azul produce una enorme cantidad de mientras que la eficiencia fotolítica de la luz verde y roja es inferior al 3% de Equation 1 la alcanzada por la luz azul10. Estos resultados muestran que se produce un proceso de transferencia de carga cuando la FMN se expone a la irradiación de luz azul o violeta y que no hay cambios significativos en la irradiación por luz verde o roja.

Un estudio previo realizado por los autores34 mostró que el mecanismo para la fotólisis de FMN puede describirse con reacciones fotolíticas primarias de FMN (Ecuación 1):

Equation 2 (1),

donde 1FMN* y 3FMN* son los estados singlete y triplete del FMN excitado, respectivamente. Los mecanismos de reacción fotolítica para estos FMN fotoinducidos son posiblemente iniciados por una aniquilación triple-triplete o un proceso de enfriamiento del estado de trillizo-suelo35,36,37,38. El estado fundamental de FMN (FMN0) es un donante de electrones que proporciona un electrón a 3FMN* y genera las formas semi-reducida (FMN•-) y semi-oxidada (FMN•+), como se muestra en la Ecuación 2

Equation 3 (2)

Las vías de fotodegradación para FMN resultan de la fotosensibilización. FMN se promueve al estado excitado electrónicamente, FMN•, a través de una reacción fotolítica y luego, un FMN neutro se reduce cuando FMN• pierde un electrón, como se muestra en las ecuaciones 3-8 a continuación:

Equation 4 (3)

Equation 5 (4)

Equation 6 (5),

donde FMN•+ es una especie cationaria radical.

La interacción de FMN•- conO2 (3Σg-) produce el radical superóxido reactivo, , seguido del radical hidroperoxilo, HOO•, Equation 1que se genera en la reacción entre Equation 1 y un protón y finalmente conduce a la degradación de FMN0:

Equation 7 (6)

Equation 8 (7)

Equation 9 (8),

donde FMN•- es un anión radical.

En el presente estudio, en ausencia de FMN, la tasa de inactivación en el caso de S. aureus es del 53% bajo irradiación de luz violeta a 10 W/m2 durante 30 min y del 26% bajo irradiación de luz azul a 20 W/m2 durante 120 min, lo que sugiere que la irradiación de luz azul desactiva menos bacterias que la luz violeta (Figura 5). Se ha informado anteriormente que la irradiación en longitudes de onda mayores de 430 nm sin un fotosensibilizador exógeno no inactiva las células de S. aureus, aunque las porfirinas en S. aureus tienen una absorbancia máxima a 405 ± 5 nm y causan inactivación bacteriana después de la irradiación39.

Un estudio previo realizado por los presentes autores mostró que E. coli y S. aureus se desactivan por escisión del ADN que es inducida por la formación de a través de fotólisis de riboflavina o FMN10,24,40. Las tasas de inactivación respectivas para S. aureus son 97% y 96%, respectivamente, utilizando 120 μM FMN bajo irradiación de luz azul20 W/m 2 (dosis de energía de 14.4 J/cm 2) durante 120 min y 30 μM FMN bajo 10 W/m 2 irradiación de luz violeta (dosis de energía de 1.8 J/cm 2) durante 30 min (Figura 5). Por lo tanto, la irradiación de luz violeta es más efectiva para desactivar S. aureus ya que las dosis bajas de energía de luz violeta pueden desactivar S. aureus en presencia de concentraciones más bajas de FMN y períodos de iluminación más cortos en comparación con la luz azul. Aunque el grado de fotólisis de FMN logrado por la luz violeta es mayor en comparación con la luz azul (Figura 3), los efectos fotolíticos promedio de FMN en la reducción de NBT bajo irradiación de luz azul y violeta son similares (Figura 4).

E. coli es una bacteria gramnegativa común. La fotólisis de riboflavina o FMN por irradiación con luz azul inactiva E. coli a través de ROS 10,24,41 con una tasa de inactivación del 96% cuando se usa FMN 10,24. S. aureus, por otro lado, es una bacteria Gram-positiva, que es efectivamente inactivada por fotólisis FMN bajo irradiación de luz violeta, como se demuestra aquí (Figura 5). Por lo tanto, la reacción fotolítica FMN bajo irradiación de luz azul o violeta puede producir ROS e inactivar bacterias Gram-negativas y Gram-positivas.

Sin embargo, en ausencia de FMN, se produce poco Equation 1 en S. aureus que está expuesto a la irradiación de luz violeta (Figura 6); por lo tanto, los fotosensibilizadores endógenos solo disminuyen ligeramente la viabilidad de S. aureus bajo irradiación de luz violeta, en comparación con el efecto en presencia de fotosensibilizadores exógenos como FMN. En las mismas condiciones, la FMN que se expone a la irradiación de luz violeta disminuye la viabilidad de S. aureus para dar lugar a una tasa de inactivación del 96%, que es mucho más alta que la de los fotosensibilizadores intracelulares endógenos solos. La producción de Equation 1 S. aureus tratada con FMN bajo irradiación de luz violeta ha aumentado significativamente, como se muestra en la Figura 6. Estos resultados muestran que la FMN cuando se expone a la irradiación de luz violeta causa un nivel elevado de inactivación bacteriana.

FMN puede alcanzar un estado fotoexcitado cuando se irradia usando UV 1,2,21,22,23, azul 10,24 y luz violeta 31; sin embargo, la citotoxicidad causada por la radiación UV y la irradiación de longitud de onda corta de alta intensidad debe ser considerada42. Por otro lado, las radiaciones rojas y verdes con longitudes de onda más largas no producen cantidades significativas de ROS durante la fotólisis FMN10. Por lo tanto, la aPDI inducida por ROS de S. aureus requiere irradiar FMN con luz violeta que tiene una longitud de onda intermedia. La anchura espectral a media altura (W1/2) para la luz violeta debe ser estrecha para evitar cualquier superposición con la absorción UV e inhibir el riesgo debido a la radiación UV31. El micronutriente, FMN, es como tal inofensivo, siendo una vitamina esencial para el cuerpo humano. Usando un fotosensibilizador apropiado como FMN, la irradiación de luz violeta de baja energía puede suprimir las bacterias patógenas, proporcionando un medio seguro y efectivo del proceso sanitario. Además de la reacción fotolítica de FMN en S. aureus, otras cuestiones merecen una mayor investigación, como la fototoxicidad de FMN en microbios, derivada del estrés causado por Equation 1 , que puede estudiarse mediante una técnica de RNA-seq junto con qPCR.

La fotólisis FMN a través de la irradiación de luz violeta conduce a la oxidación fotoquímica por la cual se generan ROS y, a su vez, mejora la inactivación de bacterias patógenas. El uso de la luz violeta se considera un paso crítico en la fotodescomposición FMN. La limitación de la técnica actual es que el intervalo de longitud de onda de la luz violeta debe ser bastante estrecho para evitar el riesgo debido a la irradiación UV. El método actual tiene el potencial para futuras aplicaciones médicas, como el tratamiento de infecciones de la piel superficial junto con tejidos o músculos subcutáneos profundos mediante la inserción de una fibra óptica para dirigir la luz violeta a las áreas infectadas. El tratamiento fotoquímico con FMN es, por lo tanto, una forma segura y sencilla de garantizar prácticas de higiene efectivas.

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Disclosures

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acknowledgments

Los autores agradecen al Dr. Tak-Wah Wong y al Sr. Zong-Jhe Hsieh por su apoyo con los experimentos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blue, green and red LED lights Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan DC 12 V 5050
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 190186
Infrared thermometer Raytek Co. Santa Cruz, CA MT4
LB broth Difco Co., NJ
L-Methionine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 1.05707
NBT Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Power supply China tech Co., New Taipei City, Taiwan YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R7774
RNase New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solar power meter Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan 10451
UV-Vis optical spectrometer Ocean Optics, Dunedin, FL USB4000
UV-Vis spectrophotometer Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan U-2900
Violet LED Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China

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References

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