Inactivación de patógenos mediante fotólisis con luz visible de riboflavina-5′-fosfato
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para inactivar bacterias patógenas con especies reactivas de oxígeno producidas durante la fotólisis del mononucleótido de flavina (FMN) bajo irradiación de luz azul y violeta de baja intensidad. Se ha demostrado que la fotólisis FMN es un método simple y seguro para procesos sanitarios.
Abstract
Riboflavina-5′-fosfato (o mononucleótido de flavina; FMN) es sensible a la luz visible. Se pueden generar varios compuestos, incluidas las especies reactivas de oxígeno (ROS), a partir de la fotólisis FMN tras la irradiación con luz visible. Las ROS generadas a partir de la fotólisis FMN son perjudiciales para los microorganismos, incluidas las bacterias patógenas como Staphylococcus aureus (S. aureus). Este artículo presenta un protocolo para desactivar S. aureus, como ejemplo, a través de reacciones fotoquímicas que involucran FMN bajo irradiación de luz visible. El anión radical superóxido () generado durante la fotólisis FMN se evalúa mediante la reducción de nitro azul tetrazolio (
NBT). La viabilidad microbiana de S. aureus que se atribuye a especies reactivas se utilizó para determinar la efectividad del proceso. La tasa de inactivación bacteriana es proporcional a la concentración de FMN. La luz violeta es más eficiente para inactivar S. aureus que la irradiación de luz azul, mientras que la luz roja o verde no impulsa la fotólisis FMN. El presente artículo demuestra la fotólisis FMN como un método simple y seguro para procesos sanitarios.
Introduction
La riboflavina-5′-fosfato (FMN) se forma por fosforilación en la posición de riboflavina 5′ de la cadena lateral ribitil y es requerida por todas las flavoproteínas para numerosos procesos celulares para generar energía. También desempeña el papel de vitamina para algunas funciones en el cuerpo humano1. FMN es aproximadamente 200 veces más soluble en agua que la riboflavina2.
La inactivación fotodinámica antibacteriana (aPDI) de las bacterias es una forma eficiente de controlar la resistencia a las bacterias 3,4 porque no depende del modo de resistencia bacteriana. Clínicamente, aPDI se utiliza para tratar infecciones de tejidos blandos con el fin de disminuir la infección de la piel nosocomial debido a bacterias multirresistentes 5,6,7,8,9. aPDI también produce muerte celular mediante la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Las ROS, como los radicales superóxido (), el oxígeno singlete, los radicales hidroxilo (
•OH) y los radicales peroxilo, son radicales libres o moléculas que contienen oxígeno reactivo 10,11,12 y normalmente son reactivas 13. Al igual que el daño del ADN causado por ROS, la peroxidación de la membrana y la destrucción de las células endoteliales también son reacciones bioquímicas adversas que se atribuyen a ROS en las células12.
El uso de aPDI para bacterias patógenas implica una fuente de luz visible o UV para inactivar microorganismos en presencia de compuestos químicos, como cloruro de metiltioninio 14, PEI-ce6 conjugado 15, porfirina 16, dióxido de titanio17, azul de toluidina O 18 y nanopartículas de óxido de zinc 19. El azul de toluidina O y el azul de metileno son colorantes de fenotiazinio y el azul de metileno tiene propiedades tóxicas. Las nanopartículas de óxido de zinc y la irradiación UV están relacionadas con efectos adversos para la salud y el medio ambiente. Como tal, la explotación de un fotosensibilizador confiable, seguro y simple a través de fotólisis bajo irradiación visible merece un estudio más profundo.
El micronutriente, riboflavina o FMN, no es tóxico y de hecho se utiliza para la fabricación de alimentos o la alimentación20. Tanto la FMN como la riboflavina son altamente sensibles a la irradiación lumínica2. Bajo UV 1,2,21,22,23 e irradiación de luz azul10,24, estos dos compuestos alcanzan un estado excitado. La riboflavina activada o FMN que se produce por fotólisis es promovida a su estado triplete y se generan ROS simultáneamente 2,25. Kumar et al. informaron que la riboflavina activada por la luz UV selectivamente causa un aumento de la lesión a la fracción guanina del ADN en microorganismos patógenos26. Bajo irradiación por luz UV, se ha demostrado que la riboflavina activada fotodinámicamente promueve la generación de 8-OH-dG, que es un biomarcador para el estrés oxidativo, en el ADN bicatenario27. Se reporta que S. aureus y E. coli son desactivadas por ROS durante la fotólisis de riboflavina o FMN 10,24,28. Un estudio previo realizado por los autores mostró que las reacciones fotolíticas que involucran riboflavina y FMN reducen el cristal violeta, un colorante triarilmetano y un agente antibacteriano que genera, y eliminan la mayor parte de la capacidad antimicrobiana del cristal violeta28. Cuando el dinucleótido de flavina adenina o FMN es irradiado por luz azul, los ROS resultantes producen apoptosis en las células HeLa para su envenenamiento in vitro29. Utilizando tratamiento fotoquímico en presencia de riboflavina, Cui et al. inactivaron linfocitos inhibiendo su proliferación y producción de citoquinas30.
La fotólisis de la riboflavina se utiliza para la inactivación del patógeno sanguíneo por UV 10,24, pero los componentes sanguíneos pueden verse afectados bajo la irradiación de luz UV30. También se informa que las plaquetas expuestas a UV mejoran progresivamente el rendimiento de los marcadores de activación P-selectina y LIMP-CD63 en sus membranas. Es necesario investigar la citotoxicidad de la radiación UV y de alta intensidad y sería de gran utilidad un fotosensibilizador que no sea complicado y seguro durante una fotorreacción FMN que involucre luz visible.
La luz de longitudes de onda más cortas tiene más energía y es mucho más probable que cause daños graves a las células. Sin embargo, en presencia de un fotosensibilizador adecuado, la irradiación con luz violeta de baja intensidad puede inhibir los microorganismos patógenos. Por lo tanto, es importante estudiar la fotosensibilización y la generación de FMN cuando se irradia con luz violeta, para determinar la vía por la cual las ROS de la fotólisis de FMN aumentan la inactivación de las bacterias.
El control antimicrobiano es un problema común y el desarrollo de nuevos antibióticos con frecuencia lleva décadas. Después de la irradiación con luz violeta, la fotoinactivación intermediada por FMN puede aniquilar bacterias patógenas ambientales. Este estudio presenta un protocolo antimicrobiano efectivo in vitro utilizando luz violeta para conducir la fotólisis FMN y así generar para aPDI. La viabilidad microbiana de S. aureus se utiliza para determinar la viabilidad de la aPDI inducida por FMN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un fotosensibilizador aumenta la reacción fotoquímica de los compuestos químicos para generar ROS. Los microorganismos patógenos pueden ser inactivados por irradiación de luz en presencia de fotosensibilizadores. Este estudio determina la aPDI de S. aureus debido a ROS generadas por irradiación de luz violeta de un fotosensibilizador exógeno, FMN.
Como se muestra en la Figura 3, para FMN, la absorbancia a 444 nm se reduce significativamente despué…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Dr. Tak-Wah Wong y al Sr. Zong-Jhe Hsieh por su apoyo con los experimentos.
Materials
| Blue, green and red LED lights | Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan | DC 12 V 5050 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 190186 | |
| Infrared thermometer | Raytek Co. Santa Cruz, CA | MT4 | |
| LB broth | Difco Co., NJ | ||
| L-Methionine | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 1.05707 | |
| NBT | Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada | ||
| Power supply | China tech Co., New Taipei City, Taiwan | YP30-3-2 | |
| Riboflavin 5′-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | R7774 | |
| RNase | New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA | ||
| Solar power meter | Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan | TM-207 | |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus | Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan | 10451 | |
| UV-Vis optical spectrometer | Ocean Optics, Dunedin, FL | USB4000 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan | U-2900 | |
| Violet LED | Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China |
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