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Bioengineering

Inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi in luce visibile della riboflavina-5′-fosfato

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63531
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

Summary

Qui presentiamo un protocollo per inattivare i batteri patogeni con specie reattive dell'ossigeno prodotte durante la fotolisi del mononucleotide flavina (FMN) sotto irradiazione di luce blu e viola di bassa intensità. La fotolisi FMN ha dimostrato di essere un metodo semplice e sicuro per i processi sanitari.

Abstract

Riboflavina-5'-fosfato (o flavina mononucleotide; FMN) è sensibile alla luce visibile. Vari composti, comprese le specie reattive dell'ossigeno (ROS), possono essere generati dalla fotolisi FMN dopo irradiazione con luce visibile. I ROS generati dalla fotolisi FMN sono dannosi per i microrganismi, compresi i batteri patogeni come lo Staphylococcus aureus (S. aureus). Questo articolo presenta un protocollo per disattivare S. aureus, ad esempio, attraverso reazioni fotochimiche che coinvolgono FMN sotto irradiazione di luce visibile. L'anione radicale superossido () generato durante la fotolisi FMN viene valutato mediante riduzione del tetrazolio nitro blu (Equation 1NBT). La vitalità microbica di S. aureus attribuita alle specie reattive Equation 1 è stata utilizzata per determinare l'efficacia del processo. Il tasso di inattivazione batterica è proporzionale alla concentrazione di FMN. La luce viola è più efficiente nell'inattivare S. aureus rispetto all'irradiazione di luce blu, mentre la luce rossa o verde non guida la fotolisi FMN. Il presente articolo dimostra la fotolisi FMN come metodo semplice e sicuro per i processi sanitari.

Introduction

La riboflavina-5′-fosfato (FMN) è formata dalla fosforilazione nella posizione della riboflavina 5' della catena laterale del ribitil ed è richiesta da tutte le flavoproteine per numerosi processi cellulari per generare energia. Svolge anche il ruolo di vitamina per alcune funzioni nel corpo umano1. FMN è circa 200 volte più solubile in acqua rispetto alla riboflavina2.

L'inattivazione fotodinamica antibatterica (aPDI) dei batteri è un modo efficace per controllare la resistenza ai batteri 3,4 perché non dipende dalla modalità di resistenza batterica. Clinicamente, aPDI è usato per trattare le infezioni dei tessuti molli al fine di ridurre l'infezione della pelle nosocomiale dovuta a batteri multi-resistenti 5,6,7,8,9. aPDI produce anche morte cellulare generando specie reattive dell'ossigeno (ROS). I ROS, come i radicali superossido (), l'ossigeno singoletto, i radicali ossidrilici (Equation 1•OH) e i radicali perossilici, sono radicali liberi o molecole che contengono ossigeno reattivo 10,11,12 e sono normalmente reattivi 13. Simile al danno al DNA causato dai ROS, la perossidazione della membrana e la distruzione delle cellule endoteliali sono anche reazioni biochimiche avverse che sono attribuite ai ROS nelle cellule12.

L'uso di aPDI per batteri patogeni coinvolge una sorgente di luce visibile o UV per inattivare i microrganismi in presenza di composti chimici, come il cloruro di metiltioninio 14, PEI-ce6 coniugato 15, porfirina 16, biossido di titanio17, blu di toluidina O 18 e nanoparticelle di ossido di zinco 19. Il blu di toluidina O e il blu di metilene sono coloranti fenotiazinici e il blu di metilene ha proprietà tossiche. Le nanoparticelle di ossido di zinco e l'irradiazione UV sono collegate a effetti negativi sulla salute e sull'ambiente. Pertanto, lo sfruttamento di un fotosensibilizzatore affidabile, sicuro e semplice tramite fotolisi sotto irradiazione visibile merita ulteriori studi.

Il micronutriente, riboflavina o FMN, non è tossico ed è infatti utilizzato per la produzione o l'alimentazione alimentare20. Sia l'FMN che la riboflavina sono altamente sensibili all'irradiazione luminosa2. Sotto UV 1,2,21,22,23 e irradiazione di luce blu10,24, questi due composti raggiungono uno stato eccitato. La riboflavina attivata o FMN prodotta dalla fotolisi viene promossa al suo stato di tripletto e i ROS vengono generati simultaneamente 2,25. Kumar et al. hanno riferito che la riboflavina attivata dalla luce UV provoca selettivamente un aumento delle lesioni alla porzione guanina del DNA nei microrganismi patogeni26. Sotto irradiazione mediante luce UV, è stato dimostrato che la riboflavina attivata fotodinamicamente promuove la generazione di 8-OH-dG, che è un biomarcatore per lo stress ossidativo, nel DNA27 a doppio filamento. È stato riportato che S. aureus ed E. coli sono disattivati da ROS durante la riboflavina o la fotolisi FMN10,24,28. Uno studio precedente degli autori ha dimostrato che le reazioni fotolitiche che coinvolgono riboflavina e FMN riducono il viola cristallino, un colorante triarilmetano e un agente antibatterico che genera Equation 1ed eliminano la maggior parte della capacità antimicrobica del viola cristallino28. Quando la flavina adenina dinucleotide o FMN viene irradiata dalla luce blu, i ROS risultanti producono apoptosi nelle cellule HeLa per il loro avvelenamento in vitro29. Utilizzando il trattamento fotochimico in presenza di riboflavina, Cui et al. inattivano i linfociti inibendo la loro proliferazione e produzione di citochine30.

La fotolisi della riboflavina viene utilizzata per l'inattivazione dell'agente patogeno del sangue da UV 10,24, ma i componenti del sangue possono essere compromessi sotto irradiazione di luce UV30. È stato anche riportato che le piastrine esposte ai raggi UV migliorano progressivamente le prestazioni dei marcatori di attivazione P-selectina e LIMP-CD63 sulle loro membrane. La citotossicità dei raggi UV e dell'irradiazione ad alta intensità deve essere studiata e un fotosensibilizzatore che sia semplice e sicuro durante una fotoreazione FMN che coinvolge la luce visibile sarebbe di grande utilità.

La luce di lunghezze d'onda più corte ha più energia ed è molto più probabile che causi gravi danni alle cellule. Tuttavia, in presenza di un fotosensibilizzatore adatto, l'irradiazione con luce viola a bassa intensità può inibire i microrganismi patogeni. La fotosensibilizzazione e la generazione di FMN quando irradiato con luce violetta è quindi importante da studiare, al fine di Equation 1 determinare la via attraverso la quale i ROS da fotolisi FMN aumentano l'inattivazione dei batteri.

Il controllo antimicrobico è un problema comune e lo sviluppo di nuovi antibiotici richiede spesso decenni. Dopo l'irradiazione con luce viola, la fotoinattivazione intermediata dalla FMN può annientare i batteri patogeni ambientali. Questo studio presenta un efficace protocollo antimicrobico in vitro che utilizza la luce viola per guidare la fotolisi FMN e quindi generare Equation 1 aPDI. La vitalità microbica di S. aureus viene utilizzata per determinare la fattibilità dell'aPDI indotta da FMN.

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Protocol

1. Configurazione del sistema di fotolisi

  1. Montare sei diodi emettitori di luce (LED) (DC 12 V) all'interno di un bicchiere di plastica opaca (8 cm x 7 cm) come mostrato nella Figura 1 per stabilire un sistema di fotolisi31.
  2. Aggiungere i reagenti (vedi sotto) nelle provette di vetro (13 mm di diametro e 100 mm di altezza) e fissare le provette nella parte superiore della tazza come mostrato nella figura 1. Posizionare la configurazione sperimentale in una stanza con una temperatura costante di 25 ± 3 °C.
  3. Monitorare e registrare la temperatura delle unità di prova durante le reazioni fotolitiche mediante un termometro a infrarossi.
    NOTA: La Figura 2 mostra gli spettri di emissione per le luci blu, verdi, rosse e viola, registrate utilizzando uno spettrometro ottico UV-Vis calibrato. Le lunghezze d'onda corrispondenti al massimo di assorbanza per le luci LED blu, verdi, rosse e viola utilizzate nello studio sono rispettivamente 465, 529, 632 e 405 nm. I chip LED possono riscaldare l'apparecchio durante gli esperimenti di irradiazione. L'intero sistema di fotoreazione in ogni esperimento è stato quindi collocato in una stanza dove la temperatura è stata mantenuta costante a 25 ± 3 °C.

2. L'effetto della lunghezza d'onda della luce sulla fotolisi della FMN (Figura 3)

  1. Preparare una soluzione di 0,1 mM FMN in tampone fosfato di potassio (PB) da 100 mM (pH 7,8). Esporre campioni FMN (3 ml ciascuno) a luce blu, verde, rossa o viola ad un'intensità di 10 W/m2 per 5 minuti. Tenere 3 mL di soluzione FMN al buio come controllo.
  2. Registrare l'assorbanza dei campioni FMN irradiati nell'intervallo 250-750 nm utilizzando uno spettrofotometro UV/visibile.

3. Metodo di riduzione del tetrazolio blu nitro (NBT) da rilevare Equation 1 (Figura 4).

NOTA: Il metodo di riduzione NBT utilizzato qui è stato leggermente modificato dal test per la fotoreazione della riboflavina. Il metodo di riduzione NBT viene utilizzato per valutare il livello generato Equation 1 dalla fotolisi FMN. L'FMN fotochimicamente eccitato viene prima ridotto dalla L-metionina in un semichinone, che poi dona un elettrone all'ossigeno dando origine a Equation 131. L'as-generato Equation 1 riduce NBT a formazan, che ha una caratteristica assorbanza a 560 nm32.

  1. Aggiungere 109,3 mg di L-metionina a 73,3 ml di PB (100 mM; pH 7,8). Vortex la soluzione per sciogliere la L-metionina.
  2. Dopo che la L-metionina è completamente sciolta, aggiungere 10 mg di polvere NBT e 1,53 ml di 0,117 mM FMN alla soluzione. Per ogni 1 mL della soluzione di reazione (cioè una miscela di FMN, L-metionina e NBT) applicata, le concentrazioni finali di FMN, metionina e NBT sono rispettivamente 2,4 x 10-6 M, 1,0 x 10-2 M e 1,6 x 10-4 M.
  3. Esporre la soluzione di reazione (1 ml) all'irradiazione luminosa LED blu o viola a 10 W/m2 per 1-5 minuti.
  4. Rilevare la Equation 1 specie (dall'assorbanza a 560 nm) prodotta dalla reazione fotochimica, che riduce NBT e produce formazan.

4. Vitalità di S. aureus dopo fotolisi FMN (Figura 5)

  1. Trasmettere una colonia di S. aureus (BCRC 10451) da una piastra coltivata in 10 ml di brodo lisogenico prelevato in una provetta con tappo a vite da 15 ml. Coltura in agitatore a 37 °C per 16 h.
  2. Trasferire 0,5 mL di coltura in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Aggiungere acqua sterilizzata nel tubo della centrifuga per diluire la coltura a una densità ottica di 0,5 a 600 nm (OD600) (~6 x 107 CFU/mL).
  3. Trasferire 0,5 mL di coltura in una provetta da centrifuga da 1,5 ml, centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e decantare il surnatante per ottenere un pellet cellulare.
  4. Aggiungere 1 mL di soluzione tamponata FMN (30, 60 e 120 μM FMN in PB) ai pellet cellulari ottenuti come al punto 4.3 e al vortice. Per il controllo irradiato, aggiungere 1 mL di PB da solo.
  5. Trasferire 1 mL ciascuna di soluzioni cellulari batteriche vitali contenenti 30 μM FMN e PB da sole in tubi di vetro e irradiarle con luce violetta a 10 W/m2 per 30 minuti.
  6. Trasferire 1 ml ciascuno di soluzioni cellulari batteriche vitali contenenti 30, 60 e 120 μM FMN e PB da soli in tubi di vetro e irradiarli con luce blu a 20 W / m2 per 120 minuti. Installare un altro tubo di vetro con 1 mL di soluzione di cellule batteriche vitali contenente 120 μM FMN e irradiarlo con luce blu a 20 W / m2 per 60 minuti.
  7. Installare le provette come descritto nei passaggi 4.5 e 4.6 e coprirle con fogli di alluminio spessi. Questi tubi fungono da controlli oscuri.
  8. Conservare la camera di irradiazione (così come i controlli di oscurità) in una cella frigorifera a 9 ± 1 °C durante il periodo di irradiazione di 30-120 minuti.
    NOTA: Il calore rilasciato dalle luci a LED non può essere ignorato in quanto i chip LED posti all'interno della tazza possono riscaldare il sistema di fotoreazione durante gli esperimenti di irradiazione. Gli esperimenti sono stati quindi condotti in una cella frigorifera mantenuta a 9 ± 1 °C.
  9. Dopo irradiazione, trasferire 0,2 mL da ciascuna delle soluzioni di reazione su una piastra di agar Luria (LA). Distribuire i batteri sulla piastra con una bacchetta di vetro a forma di L e incubare per una notte a 37 °C.
  10. Calcolare il conteggio delle piastre vitali e i tassi di inattivazione di S. aureus dopo la crescita durante la notte.
    NOTA: Il tasso di inattivazione di S. aureus è calcolato come riduzione percentuale, che è pari a [1 -I / D] ×100%, dove I e D denotano, rispettivamente, il numero di CFU nel campione irradiato e il controllo di oscurità. La riduzione percentuale è definita come un valore negativo del tasso di inattivazione.

5. Rilevamento di Equation 1 in S. aureus (Figura 6)

  1. Preparare i campioni di S. aureus come descritto al punto 4.
  2. Diluire la densità batterica dei campioni con acqua sterilizzata ad una densità ottica di 0,5 a 600 nm (OD600, ~6 x 106 CFU/mL). Trasferire 0,5 mL di coltura in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e decantare il surnatante per ottenere un pellet cellulare.
  3. Aggiungere 0,1093 g di L-metionina, 0,1 g di NBT e 25 ml di FMN (400, 240 o 120 μM) a 75 ml di PB. Per ogni 1 mL del reagente applicato, le concentrazioni finali di FMN, metionina e NBT sono rispettivamente 100 (60 o 30) x 10-6 M, 7,3 x 10-3 M e 1,2 x 10-3 M.
  4. Aggiungere 1 mL di ciascuna soluzione di reagente (cioè con concentrazioni di FMN variabili) ai pellet cellulari ottenuti come al punto 5.2. Irradiare le soluzioni mediante luce violetta a 10 W/m2 per 10 min.
  5. Centrifugare la miscela a 14.000 x g per 10 minuti e decantare il surnatante. Risospendere il pellet in 1 mL di dimetilsolfossido (DMSO) per estrarre l'NBT ridotto. Rilevare le specie prodotte Equation 1 dall'assorbanza a 560 nm.

6. Analisi statistica

  1. Esprimere i dati come media ± deviazione standard (SD) di tre test indipendenti.
  2. Applicare un t-test omoscedasticostico, a due campioni, per valutare se due misurazioni sono diverse. Valori p < 0,05 sono considerati statisticamente significativi.

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Representative Results

Effetto della lunghezza d'onda della luce sulla FMN
Gli spettri di assorbanza di 0,1 mM FMN irradiati utilizzando LED blu, verdi, rossi e viola sono mostrati nella Figura 3. Ci sono due picchi per FMN (372 nm e 444 nm) per il controllo scuro. La luce verde e rossa non ha alcun effetto perché i cambiamenti negli spettri sono insignificanti. D'altra parte, la rispettiva assorbanza di FMN a 444 nm è ridotta di circa il 19% e il 34%, rispettivamente, dopo irradiazione di luce blu e violetta a 10 W / m2 per 5 minuti, suggerendo che l'irradiazione con luce blu / viola aumenta la fotolisi FMN.

Rilevamento di Equation 10 da FMN che viene irradiato utilizzando luce blu o viola
La riduzione NBT è stata utilizzata per determinare la formazione di Equation 132. FMN è altamente sensibile alla luce visibile e UV anche per brevi periodi di radiazioni. Equation 1 è formato dalle reazioni fotochimiche intermedie durante la fotolisi di FMN. La figura 4 mostra che l'effetto fotochimico dell'FMN sulla riduzione della NBT dipende dal tempo di irradiazione, come Equation 1 si forma dall'FMN esposto all'irradiazione di luce blu o violetta in modo dipendente dal tempo. L'effetto fotolitico medio della luce blu e della luce viola è, tuttavia, simile a quello mostrato nella Figura 4.

Effetto della fotolisi FMN sulla vitalità di S. aureus
È stato determinato l'effetto dell'FMN esposto all'irradiazione di luce violetta o blu sulla vitalità di S. aureus. La fotolisi FMN mediante irradiazione di luce blu o viola provoca una significativa inattivazione di S. aureus. Maggiore è la concentrazione di FMN, maggiore è il tasso di inattivazione di S. aureus esposto all'irradiazione di luce blu a 20 W/m2 per 120 minuti, come mostrato nella figura 5A. Tassi di inattivazione del 26%, 39%, 43% e 97% sono stati raggiunti per S. aureus utilizzando 0, 30, 60 e 120 μM FMN, rispettivamente, sotto 20 W / m2 irradiazione di luce blu per 120 minuti. Come mostrato nella figura 5A, non vi è alcuna differenza significativa (valore p = 0,20) nel tasso di inattivazione per S. aureus utilizzando l'irradiazione di luce blu con 60 μM FMN a 20 W/m 2 per 120 minuti (dose energetica, 14,4 J/cm 2) o 120 μM FMN a 20 W/m 2 per 60 minuti (dose energetica, 7,2 J/cm2). D'altra parte, come mostrato nella figura 5B, tassi di inattivazione del 53% e del 96% sono stati raggiunti per S. aureus senza e con 30 μM FMN, rispettivamente, sotto irradiazione di luce violetta a 10 W / m 2 per 30 minuti (dose energetica di 1,8 J / cm2). Pertanto, l'FMN esposto all'irradiazione di luce blu o viola ha un effetto maggiore sulla vitalità di S. aureus aumentando l'inattivazione batterica. L'FMN trattato con irradiazione a luce violetta è più efficiente nell'inattivazione di S. aureus.

Rilevamento di Equation 10 in S. aureus trattato con FMN sotto irradiazione di luce violetta
La produzione di S. aureus trattato con FMN sotto irradiazione di luce violetta è stata determinata utilizzando il metodo di Equation 1 riduzione NBT. Il valore di assorbanza a 560 nm è stato utilizzato per valutare l'entità della Equation 1 produzione. L'effetto fotochimico della FMN sulla Equation 1 generazione in S. aureus è proporzionale alla concentrazione di FMN (Figura 6). I valori di assorbanza di 560 nm per S. aureus senza trattamento con FMN sono 0,31 e 0,07 sotto irradiazione di luce violetta di 10 W/m2 per 10 minuti e al buio, rispettivamente (Figura 6). Ciò suggerisce che poco Equation 1 è stato prodotto in S. aureus non trattato dopo l'irradiazione di luce violetta. I rispettivi valori di assorbanza di 560 nm per S. aureus trattato con 100 μM FMN sono 1,36 e 0,08 sotto irradiazione di luce violetta di 10 W/m2 per 10 minuti e al buio, rispettivamente. Pertanto, l'effetto fotochimico sulla riduzione NBT di S. aureus trattato con FMN aumenta sotto irradiazione violetta, come Equation 1 viene prodotto abbondantemente.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica del sistema di fotoreazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Gli spettri di emissione delle luci LED blu, verdi, rosse e viola in questo studio. I massimi di emissione per le luci blu, verde, rossa e viola sono rispettivamente a 465, 529, 632 e 405 nm, e le larghezze spettrali a mezza altezza (W1/2) sono rispettivamente 26, 31, 14 e 12 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Spettri di assorbanza di FMN trattati con LED di varie lunghezze d'onda a 10 W/m2 per 5 min. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Riduzione NBT per determinare l'effetto dell'irradiazione di luce blu e viola a 10 W/m2 per 1-5 minuti sulla fotolisi FMN. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Effetto della fotolisi FMN sulla vitalità di S. aureus. La riduzione percentuale è definita come un valore negativo del tasso di inattivazione per S. aureus trattato con (A) FMN sotto irradiazione di luce blu a 20 W/m 2 per 120 min e (B) FMN sotto irradiazione di luce violetta a 10 W/m2 per 30 min. Le concentrazioni di FMN e i tempi di irradiazione sono indicati nella parte superiore della figura. Si noti che non vi è alcuna differenza significativa (p = 0,20) nel tasso di inattivazione per S. aureus utilizzando 60 μM FMN a 20 W / m 2 irradiazione di luce blu per 120 min o 120 μM FMN a 20 W / m2 irradiazione di luce blu per 60 min (A). I risultati sono espressi come media ± DS, dove n = 3. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Effetto della concentrazione di FMN sulla Equation 10 generazione in S. aureus sottoposta ad irradiazione di luce violetta a 10 W/m2 per 10 min. Nel complesso, poco Equation 1 è prodotto in S. aureus in assenza di FMN, sebbene l'irradiazione di luce violetta aumenti Equation 1 leggermente nel campione irradiato (PB (luce viola)) rispetto al controllo scuro (PB (scuro)). I risultati sono espressi come media ± DS, dove n = 3. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Un fotosensibilizzatore aumenta la reazione fotochimica dei composti chimici per generare ROS. I microrganismi patogeni possono essere inattivati dall'irradiazione luminosa in presenza di fotosensibilizzatori. Questo studio determina l'aPDI di S. aureus a causa di ROS generati dall'irradiazione di luce violetta di un fotosensibilizzatore esogeno, FMN.

Come mostrato nella figura 3, per FMN, l'assorbanza a 444 nm si riduce significativamente dopo 5 minuti di irradiazione utilizzando luce viola o blu e non vi è alcuna variazione significativa nell'assorbanza FMN sotto irradiazione con luce verde o rossa. La riduzione NBT viene utilizzata per determinare la formazione di tramite un processo di trasferimento di Equation 1 carica10,33. Uno studio precedente degli autori ha utilizzato FMN sotto irradiazione blu, verde o a luce rossa per determinare la formazione dell'utilizzo della riduzione NBTEquation 1. L'irradiazione della luce blu produce un'enorme quantità di mentre l'efficienza fotolitica della luce verde e rossa è inferiore al 3% di Equation 1 quella raggiunta dalla luce blu10. Questi risultati mostrano che un processo di trasferimento di carica viene prodotto quando FMN è esposto all'irradiazione di luce blu o viola e che non vi è alcun cambiamento significativo dopo l'irradiazione con luce verde o rossa.

Uno studio precedente degli autori34 ha dimostrato che il meccanismo per la fotolisi FMN può essere descritto con reazioni fotolitiche FMN primarie (Equazione 1):

Equation 2 (1),

dove 1FMN* e 3FMN* sono rispettivamente gli stati singoletto e tripletto dell'FMN eccitato. I meccanismi di reazione fotolitica per questi FMN fotoindotti sono probabilmente iniziati da un annichilamento tripletto-tripletto o da un processo di tempra dello stato fondamentale tripletto35,36,37,38. Lo stato fondamentale di FMN (FMN0) è un donatore di elettroni che fornisce un elettrone a 3FMN* e genera le forme semi-ridotte (FMN•-) e semi-ossidate (FMN•+), come mostrato nell'equazione 2

Equation 3 (2)

I percorsi di fotodegradazione per FMN derivano dalla fotosensibilizzazione. FMN è promosso allo stato eccitato elettronicamente, FMN•, attraverso una reazione fotolitica e quindi, un FMN neutro viene ridotto quando FMN• perde un elettrone, come mostrato nelle equazioni 3-8 di seguito:

Equation 4 (3)

Equation 5 (4)

Equation 6 (5),

dove FMN•+ è una specie di catione radicale.

L'interazione di FMN•- con O2 (3Σg-) produce il radicale superossido reattivo, seguito dal radicale idroperossile, HOO•, Equation 1che viene generato nella reazione tra Equation 1 e un protone e alla fine porta alla degradazione di FMN0:

Equation 7 (6)

Equation 8 (7)

Equation 9 (8),

dove FMN•- è un anione radicale.

Nel presente studio, in assenza di FMN, il tasso di inattivazione nel caso di S. aureus è del 53% sotto irradiazione di luce violetta a 10 W/m 2 per 30 min e del 26% sotto irradiazione di luce blu a 20 W/m2 per 120 min, suggerendo che l'irradiazione di luce blu disattiva meno batteri della luce violetta (Figura 5). È stato riportato in precedenza che l'irradiazione a lunghezze d'onda superiori a 430 nm senza un fotosensibilizzatore esogeno non inattiva le cellule di S. aureus, sebbene le porfirine in S. aureus abbiano un'assorbanza massima a 405 ± 5 nm e causino inattivazione batterica dopo irradiazione39.

Uno studio precedente degli autori presenti ha dimostrato che E. coli e S. aureus sono disattivati dalla scissione del DNA che è indotta dalla formazione di attraverso la fotolisi di riboflavina o FMN10,24,40. I rispettivi tassi di inattivazione per S. aureus sono rispettivamente del 97% e del 96%, utilizzando 120 μM di FMN sotto 20 W/m 2 di irradiazione di luce blu (dose di energia di 14,4 J/cm 2) per 120 min e 30 μM di FMN sotto 10 W/m 2 di irradiazione di luce violetta (dose di energia di 1,8 J/cm 2) per 30 minuti (Figura 5). Pertanto, l'irradiazione della luce viola è più efficace nel disattivare S. aureus poiché dosi a bassa energia di luce viola possono disattivare S. aureus in presenza di concentrazioni FMN più basse e periodi di illuminazione più brevi rispetto alla luce blu. Sebbene l'estensione della fotolisi FMN ottenuta dalla luce violetta sia più elevata rispetto alla luce blu (Figura 3), gli effetti fotolitici medi dell'FMN sulla riduzione della NBT sotto irradiazione di luce blu e viola sono simili (Figura 4).

E. coli è un comune batterio Gram-negativo. La riboflavina o fotolisi FMN mediante irradiazione con luce blu inattiva E. coli tramite ROS 10,24,41 con un tasso di inattivazione del 96% quando si utilizza FMN10,24. S. aureus, d'altra parte, è un batterio Gram-positivo, che è efficacemente inattivato dalla fotolisi FMN sotto irradiazione di luce violetta, come dimostrato qui (Figura 5). Pertanto, la reazione fotolitica FMN sotto irradiazione di luce blu o viola può produrre ROS e inattivare sia i batteri Gram-negativi che Gram-positivi.

In assenza di FMN, tuttavia, poco Equation 1 viene prodotto in S. aureus che è esposto all'irradiazione di luce violetta (Figura 6); pertanto, i fotosensibilizzatori endogeni riducono solo leggermente la vitalità di S. aureus sotto irradiazione di luce violetta, rispetto all'effetto in presenza di fotosensibilizzatori esogeni come FMN. Nelle stesse condizioni, l'FMN esposto all'irradiazione di luce violetta diminuisce la vitalità di S. aureus con un tasso di inattivazione del 96%, che è molto più alto di quello dei fotosensibilizzatori intracellulari endogeni da soli. La produzione di Equation 1 S. aureus trattato con FMN sotto irradiazione di luce violetta è aumentata significativamente, come mostrato nella figura 6. Questi risultati mostrano che l'FMN quando esposto all'irradiazione di luce violetta provoca un elevato livello di inattivazione batterica.

FMN può raggiungere uno stato fotoeccitato quando irradiato utilizzando UV 1,2,21,22,23, blu 10,24 e luce viola 31; tuttavia, la citotossicità causata dalle radiazioni UV e dall'irradiazione a lunghezza d'onda corta ad alta intensità deve essere considerata42. D'altra parte, le radiazioni rosse e verdi con lunghezze d'onda più lunghe non producono quantità significative di ROS durante la fotolisi FMN10. Pertanto, l'aPDI indotta da ROS di S. aureus richiede l'irradiazione di FMN con luce viola che ha una lunghezza d'onda intermedia. La larghezza spettrale a mezza altezza (W1/2) per la luce violetta deve essere stretta per evitare qualsiasi sovrapposizione con l'assorbimento UV e inibire il rischio dovuto alla radiazione UV31. Il micronutriente, FMN, è in quanto tale innocuo, essendo una vitamina essenziale per il corpo umano. Utilizzando un fotosensibilizzatore appropriato come FMN, l'irradiazione a luce violetta a bassa energia può sopprimere i batteri patogeni, fornendo un mezzo sicuro ed efficace del processo sanitario. Oltre alla reazione fotolitica di FMN su S. aureus, altre questioni meritano ulteriori indagini, come la fototossicità di FMN sui microbi, derivante dallo stress causato da Equation 1 , che può essere studiata utilizzando una tecnica RNA-seq insieme alla qPCR.

La fotolisi FMN tramite irradiazione a luce violetta porta all'ossidazione fotochimica mediante la quale viene generato ROS e, a sua volta, migliora l'inattivazione dei batteri patogeni. L'uso della luce viola è considerato un passo critico nella fotodecomposizione FMN. Il limite della tecnica attuale è che l'intervallo di lunghezza d'onda della luce viola deve essere piuttosto stretto per evitare il rischio dovuto all'irradiazione UV. Il metodo attuale ha il potenziale per future applicazioni mediche, come il trattamento delle infezioni della pelle superficiale insieme ai tessuti sottocutanei profondi o ai muscoli inserendo una fibra ottica per dirigere la luce viola verso le aree infette. Il trattamento fotochimico con FMN è quindi un modo sicuro e semplice per garantire pratiche igieniche efficaci.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori sono grati al Dr. Tak-Wah Wong e al Sig. Zong-Jhe Hsieh per il loro sostegno agli esperimenti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blue, green and red LED lights Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan DC 12 V 5050
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 190186
Infrared thermometer Raytek Co. Santa Cruz, CA MT4
LB broth Difco Co., NJ
L-Methionine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 1.05707
NBT Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Power supply China tech Co., New Taipei City, Taiwan YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R7774
RNase New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solar power meter Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan 10451
UV-Vis optical spectrometer Ocean Optics, Dunedin, FL USB4000
UV-Vis spectrophotometer Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan U-2900
Violet LED Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China

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Bioingegneria Numero 182 FMN fotolisi ROS S. aureus luce viola
Inattivazione di agenti patogeni <em>tramite</em> fotolisi in luce visibile della riboflavina-5′-fosfato
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