パインウッド線虫、ブルサフェレンコス・キシロフィルスにおけるRNA干渉の応用
Summary
ここでは、遺伝子機能の研究を容易にするために、 ブルサフェレンコス・キシロフィルス におけるRNA干渉の詳細な浸漬方法を紹介します。
Abstract
マツノザイセンチュウ、Bursaphelenchus xylophilusは、世界で最も破壊的な侵入種の1つであり、松の木のしおれと最終的な死を引き起こします。経済的・環境的意義は認識されているものの、植物寄生線虫(PPN)の詳細な遺伝子機能を従来の順遺伝学やトランスジェニック法を用いて研究することは、これまで不可能であった。しかし、逆遺伝学技術として、RNA干渉(RNAi)は、B. xylophilusを含む線虫の機能遺伝子の研究を容易にする。
この論文では、他の病原性線虫の発生と繁殖に重要な役割を果たすことが報告されているB. xylophilusのppm-1遺伝子のRNAiの新しいプロトコルを概説する。RNAiについては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により標的断片の5’末端にT7プロモーターを連結し、インビトロ転写により二本鎖RNA(dsRNA)を合成した。続いて、dsRNA送達は、合成神経刺激剤と混合したdsRNA溶液に線虫を浸すことによって達成された。B. xylophilusの同期幼体(約20,000個体)を洗浄し、25°Cの暗所で24時間、浸漬バッファー中のdsRNA(0.8μg/mL)に浸した。
同量の線虫を、対照としてdsRNAを含まない浸漬緩衝液に入れた。一方、別の同量の線虫を、対照として緑色蛍光タンパク質(gfp)遺伝子dsRNAを含む浸漬緩衝液に入れた。浸漬後、標的転写産物の発現量を、リアルタイム定量PCRを用いて決定した。RNAiの効果は、表現型の顕微鏡観察および群間の成人の体の大きさの比較を用いて確認された。現在のプロトコルは、 B. xylophilus および他の寄生線虫の遺伝子の機能をよりよく理解するための研究を、遺伝子工学による制御戦略の開発に向けて進めるのに役立つ可能性がある。
Introduction
植物寄生性線虫(PPN)は、食料安全保障と森林生態系に対する継続的な脅威です。彼らは毎年推定1,000億米ドルの経済的損失を引き起こし、そのうち最も問題となるのは主に根結び線虫、嚢胞線虫、および松林線虫です。マツノザイセンチュウ、 Bursaphelenchus xylophilusは、渡り鳥、内寄生性線虫であり、これはマツ材線虫病2の原因病原体である。それは世界中の松林に大きな害を及ぼしています3.Van Megen et al.4の用語を使用すると、 B. xylophilus はParasitaphelenchidaeのメンバーであり、クレード10に属していますが、他のほとんどの主要な植物寄生虫はクレード12に属しています。
独立した最近進化した植物寄生虫として、 B. xylophilus は比較研究のための魅力的なモデルです。今日まで、クレード12に属する根結び線虫および嚢胞線虫に関する実質的な研究があり、これらは義務的で座りがちな内部寄生虫であり、最も激しく研究された線虫のいくつかである。しかし、この重要な分野でさらなる研究を行うことには、寄生遺伝子の機能が研究のボトルネックであるという大きな課題が伴います。機能研究には、一般に、異所性発現およびノックダウン/アウト実験が含まれるが、線虫の効果的な遺伝的形質転換プロトコルに依存する。その結果、PPNにおける逆遺伝学は、RNAiによる遺伝子サイレンシングにほぼ独占的に依存している。
RNAiは、真核細胞に広く存在するメカニズムで、二本鎖RNA(dsRNA)を導入することで遺伝子発現をサイレンシングします5。現在までに、dsRNAによって誘導される転写後遺伝子サイレンシング機構は、研究されたすべての真核生物において見出されており、RNAi技術は、機能ゲノミクス研究およびその他の応用のツールとして、多くの生物において急速に発展してきた。1998年に カエノラブディティス・エレガンス でRNAi機構が発見されて以来6、RNAi技術は線虫の遺伝子機能を同定するための有効な方法となり、病原性線虫を効果的に防除する新しい方法として提案されている7。
RNAiは技術的に容易にdsRNAに幼体を浸すのに十分である。しかしながら、このアプローチの有効性および再現性は、線虫種および標的遺伝子8によって大きく異なる。根結び線虫 Meloidogyne incognitaのRNAi経路に関与する20の遺伝子のサイレンシングを、長いdsRNAをトリガーとして用いて調査し、その結果、いくつかの遺伝子の発現の増加および変化なしを含む多様な応答をもたらした9。これらの結果は、標的遺伝子がRNAiノックダウンに対して異なる反応を示す可能性があり、RNAiを介した線虫防除の標的としての適合性の徹底的な評価を必要とすることを示している。しかし、現在、 B. xylophilusの発生および生殖生物学に関する研究は不足しています。
以前の研究10、11、12、13の続きとして、dsRNAの合成、合成神経刺激剤浸漬、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)検出を含む、B. xylophilusのppm-1遺伝子の機能を研究するためにRNAiを適用するためのプロトコルをここで説明する。この実験的アプローチから得られた知識は、基本的な生物学的システムの理解と松枯れ症の予防に著しく貢献する可能性が高い。
Protocol
Representative Results
Discussion
B. xylophilusの生活史や寄生環境は他の線虫の生活史や寄生環境は異なりますが、この植物病原菌の分子病因に関する研究は限られてきました。 C. elegansおよび他の線虫におけるCRISPR/Cas9ゲノム編集技術の適用において大きな進歩があったにもかかわらず、B. xylophilusに適用されたRNAi技術のみが現在までに公開されている17。RNAiは線虫の遺伝子機能を研究する…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(31870637、31200487)から資金提供を受け、浙江省主要研究計画(2019C02024、LGN22C160004)によって共同出資されました。
Materials
| Baermann funnel | n/a | n/a | to isolate nematodes |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai kangyusheng information technology co. | n/a | to design qPCR primers |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | as food for nematodes |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China. |
| constant temperature incubator | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | to cultur nematodes |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | to achieve electrophoretic analysis |
| Ethanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | to extract RNA |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR030A | for PCR |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR390A | for PCR |
| Gel imager | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | to make nucleic acid bands visible |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | to analyze the data and make figurs |
| High Speed Centrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | centrifug |
| High-flux tissue grinder | Bertin | to extract RNA | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | n/a | to measure the body lengths |
| isopropyl alcohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | to extract RNA |
| Leica DM4B microscope | Leica Microsystems Inc. | to observe nematodes | |
| magnetic beads | Aoran science technology co. | 150010C | to extract RNA |
| MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | to synthesize dsRNA in vitro |
| NanoDrop ND-2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | to analyze the quality of the dsRNA |
| PCR Amplifier | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | to amplify nucleic acid sequence |
| Petri dishes | n/a | n/a | to cultur nematodes |
| pGEM-T Easy vector | Promega Corporation | A1360 | for cloning |
| Potato Dextrose Agar (Medium) | n/a | n/a | to cultur Botrytis cinerea |
| Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio Inc. | RR047B | to synthetic cDNA |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | to design PCR primers |
| primers:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | for qPCR | |
| shaking table | Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. | to soak nematodes | |
| stereoscopic microscope | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | to observe nematodes |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7 promoter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit | Takara Bio Inc. | 9762 | to recover DNA |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | for qPCR |
| trichloroethane | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | to extract RNA | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | total RNA extraction reagent,to extract RNA |
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