En nyudviklet mikromønstret chip med grafenoxidvinduer fremstilles ved anvendelse af mikroelektromekaniske systemteknikker, der muliggør effektiv og høj kapacitet kryogen elektronmikroskopibilleddannelse af forskellige biomolekyler og nanomaterialer.
En væsentlig begrænsning for effektiv og højkapacitetsstrukturanalyse af biomolekyler ved hjælp af kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) er vanskeligheden ved at forberede kryo-EM-prøver med kontrolleret istykkelse på nanoskala. Den silicium (Si) -baserede chip, som har et regelmæssigt udvalg af mikrohuller med grafenoxid (GO) vindue mønstret på en tykkelsesstyret siliciumnitrid (SixNy) film, er udviklet ved at anvende mikroelektromekaniske system (MEMS) teknikker. UV-fotolitografi, kemisk dampaflejring, våd og tør ætsning af tyndfilmen og dropstøbning af 2D nanoarkmaterialer blev brugt til masseproduktion af de mikromønstrede chips med GO-vinduer. Dybden af mikrohullerne reguleres for at kontrollere istykkelsen efter behov, afhængigt af størrelsen på prøven til kryo-EM-analyse. Den gunstige affinitet af GO mod biomolekyler koncentrerer biomolekylerne af interesse i mikrohullet under kryo-EM-prøveforberedelse. Den mikromønstrede chip med GO-vinduer muliggør cryo-EM-billeddannelse med høj kapacitet af forskellige biologiske molekyler såvel som uorganiske nanomaterialer.
Kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) er udviklet til at løse den tredimensionelle (3D) struktur af proteiner i deres oprindelige tilstand 1,2,3,4. Teknikken indebærer fastgørelse af proteiner i et tyndt lag (10-100 nm) glasagtig is og erhvervelse af projektionsbilleder af tilfældigt orienterede proteiner ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop (TEM), hvor prøven opretholdes ved flydende nitrogentemperatur. Tusinder til millioner af projektionsbilleder erhverves og bruges til at rekonstruere en 3D-struktur af proteinet ved hjælp af beregningsalgoritmer 5,6. For en vellykket analyse med cryo-EM er kryoprøveforberedelsen blevet automatiseret ved at fastfryse det udstyr, der styrer blottingforholdene, fugtigheden og temperaturen. Prøveopløsningen lægges på et TEM-gitter med en hullet carbonmembran, der successivt blottes for at fjerne overskydende opløsning, og derefter dyppes med flydende ethan for at producere tynd glasagtig is 1,5,6. Med fremskridtene inden for cryo-EM og automatiseringen af prøveforberedelse7 er cryo-EM i stigende grad blevet brugt til at løse strukturen af proteiner, herunder kuvertproteiner til vira og ionkanalproteiner i cellemembranen 8,9,10. Strukturen af kuvertproteiner af patogene viruspartikler er vigtig for at forstå virusinfektionspatologi samt udvikle diagnosesystemet og vaccinerne, f.eks. SARS-CoV-211, som forårsagede COVID-19-pandemien. Desuden er cryo-EM-teknikker for nylig blevet anvendt til materialevidenskab, såsom til billeddannelse af strålefølsomme materialer, der anvendes i batteri 12,13,14 og katalytiske systemer14,15 og analyse af uorganiske materialers struktur i opløsningstilstand16.
På trods af mærkbar udvikling inden for cryo-EM og relevante teknikker findes der begrænsninger i kryoprøveforberedelse, hvilket forhindrer 3D-strukturanalyse med høj kapacitet. Forberedelse af en glasagtig isfilm med optimal tykkelse er især vigtig for at opnå 3D-strukturen af biologiske materialer med atomopløsning. Isen skal være tynd nok til at minimere baggrundsstøj fra elektroner spredt af isen og til at forhindre overlapninger af biomolekyler langs elektronstrålevejen 1,17. Men hvis isen er for tynd, kan det få proteinmolekyler til at justere i foretrukne retninger eller denaturere 18,19,20. Derfor bør tykkelsen af glasagtig is optimeres afhængigt af størrelsen af det materiale, der er af interesse. Desuden er der typisk behov for en omfattende indsats for prøveforberedelse og manuel screening af is- og proteinintegritet på de forberedte TEM-net. Denne proces er ekstremt tidskrævende, hvilket hindrer dens effektivitet til 3D-strukturanalyse med høj kapacitet. Derfor vil forbedringer i pålideligheden og reproducerbarheden af kryo-EM-prøveforberedelse forbedre udnyttelsen af cryo-EM i strukturel biologi og kommerciel lægemiddelopdagelse samt til materialevidenskab.
Heri introducerer vi mikrofabrikationsprocesser til fremstilling af en mikromønstret chip med grafenoxid (GO) vinduer designet til cryo-EM med høj kapacitet med kontrolleret istykkelse21. Den mikromønstrede chip blev fremstillet ved hjælp af mikroelektromekaniske systemteknikker (MEMS), som kan manipulere chippens struktur og dimensioner afhængigt af billeddannelsesformålene. Den mikromønstrede chip med GO-vinduer har en mikrobrøndstruktur, der kan fyldes med prøveopløsningen, og dybden af mikrobrønden kan reguleres for at kontrollere tykkelsen af glaslegemeisen. Den stærke affinitet af GO for biomolekyler forbedrer koncentrationen af biomolekyler til visualisering, hvilket forbedrer effektiviteten af strukturanalysen. Desuden består den mikromønstrede chip af en Si-ramme, som giver høj mekanisk stabilitet for gitteret19, hvilket gør den ideel til håndtering af chippen under prøveforberedelsesprocedurer og cryo-EM-billeddannelse. Derfor giver en mikromønstret chip med GO-vinduer fremstillet af MEMS-teknikker pålidelighed og reproducerbarhed af kryo-EM-prøveforberedelse, som kan muliggøre effektiv og højkapacitetsstrukturanalyse baseret på cryo-EM.
Mikrofabrikationsprocesserne til fremstilling af mikromønstrede chips med GO-vinduer introduceres her. Den fremstillede mikromønstrede chip er designet til at regulere tykkelsen af det glasagtige islag ved at kontrollere dybden af mikrohullet med GO-vinduer afhængigt af størrelsen på det materiale, der skal analyseres. En mikromønstret chip med GO-vinduer blev fremstillet ved hjælp af en række MEMS-teknikker og en 2D nanoarkoverførselsmetode (figur 1). Den største fordel ved at bru…
The authors have nothing to disclose.
M.-H.K., S.K., M.L. og J.P. anerkender den økonomiske støtte fra Institut for Grundvidenskab (bevillingsnr. IBS-R006-D1). S.K., M.L. og J.P. anerkender den økonomiske støtte fra Creative-Pioneering Researchers Program gennem Seoul National University (2021) og NRF-tilskuddet finansieret af den koreanske regering (MSIT; Tilskud nr. NRF-2020R1A2C2101871 og NRF-2021M3A9I4022936). M.L. og J.P. anerkender den økonomiske støtte fra POSCO Science Fellowship fra POSCO TJ Park Foundation og NRF-tilskuddet finansieret af den koreanske regering (MSIT; Tilskud nr. NRF-2017R1A5A1015365). J.P. anerkender den økonomiske støtte fra NRF-tilskuddet finansieret af den koreanske regering (MSIT; Tilskud nr. NRF-2020R1A6C101A183) og de tværfaglige forskningsinitiativer programmer fra College of Engineering og College of Medicine, Seoul National University (2021). M.-H.K. anerkender den økonomiske støtte fra NRF-tilskuddet finansieret af den koreanske regering (MSIT; Tilskud nr. NRF-2020R1I1A1A0107416612). Forfatterne takker personalet og besætningen på Seoul National University Center for Macromolecular and Cell Imaging (SNU CMCI) for deres utrættelige indsats og udholdenhed med cryo-EM-eksperimenterne. Forfatterne takker S. J. Kim fra National Center for Inter-university Research Facilities for hjælp med FIB-SEM-eksperimenterne.
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
Acetone | |||
AFM | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
Aligner | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
AZ 300 MIF developer | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
Cryo-EM holder | Gatan, USA | 626 single tilt cryo-EM holder | |
Cryo-plunging machine | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
Glow discharger | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
Graphene oxide (GO) solution | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
maP1205 positive PR | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
Potassium hydroxide (KOH), flake | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
Raman Spectrometer | NOST, South Korea | Confocal Micro Raman System HEDA | |
Reactive ion etcher (RIE) | Scientific Engineering, South Korea | Lab-built | |
SEM | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
Si wafer | JP COMMERCE, South Korea | 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um | |
Spin coater | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
TEM | JEOL, Japan | JEM-2100F |