Fremstilling af mikromønstret chip med kontrolleret tykkelse til kryogen elektronmikroskopi med høj kapacitet

Summary

En nyudviklet mikromønstret chip med grafenoxidvinduer fremstilles ved anvendelse af mikroelektromekaniske systemteknikker, der muliggør effektiv og høj kapacitet kryogen elektronmikroskopibilleddannelse af forskellige biomolekyler og nanomaterialer.

Abstract

En væsentlig begrænsning for effektiv og højkapacitetsstrukturanalyse af biomolekyler ved hjælp af kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) er vanskeligheden ved at forberede kryo-EM-prøver med kontrolleret istykkelse på nanoskala. Den silicium (Si) -baserede chip, som har et regelmæssigt udvalg af mikrohuller med grafenoxid (GO) vindue mønstret på en tykkelsesstyret siliciumnitrid (Si_xN_y) film, er udviklet ved at anvende mikroelektromekaniske system (MEMS) teknikker. UV-fotolitografi, kemisk dampaflejring, våd og tør ætsning af tyndfilmen og dropstøbning af 2D nanoarkmaterialer blev brugt til masseproduktion af de mikromønstrede chips med GO-vinduer. Dybden af mikrohullerne reguleres for at kontrollere istykkelsen efter behov, afhængigt af størrelsen på prøven til kryo-EM-analyse. Den gunstige affinitet af GO mod biomolekyler koncentrerer biomolekylerne af interesse i mikrohullet under kryo-EM-prøveforberedelse. Den mikromønstrede chip med GO-vinduer muliggør cryo-EM-billeddannelse med høj kapacitet af forskellige biologiske molekyler såvel som uorganiske nanomaterialer.

Introduction

Kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) er udviklet til at løse den tredimensionelle (3D) struktur af proteiner i deres oprindelige tilstand 1,2,3,4. Teknikken indebærer fastgørelse af proteiner i et tyndt lag (10-100 nm) glasagtig is og erhvervelse af projektionsbilleder af tilfældigt orienterede proteiner ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop (TEM), hvor prøven opretholdes ved flydende nitrogentemperatur. Tusinder til millioner af projektionsbilleder erhverves og bruges til at rekonstruere en 3D-struktur af proteinet ved hjælp af beregningsalgoritmer ^5,6. For en vellykket analyse med cryo-EM er kryoprøveforberedelsen blevet automatiseret ved at fastfryse det udstyr, der styrer blottingforholdene, fugtigheden og temperaturen. Prøveopløsningen lægges på et TEM-gitter med en hullet carbonmembran, der successivt blottes for at fjerne overskydende opløsning, og derefter dyppes med flydende ethan for at producere tynd glasagtig is ^1,5,6. Med fremskridtene inden for cryo-EM og automatiseringen af prøveforberedelse⁷ er cryo-EM i stigende grad blevet brugt til at løse strukturen af proteiner, herunder kuvertproteiner til vira og ionkanalproteiner i cellemembranen ^8,9,10. Strukturen af kuvertproteiner af patogene viruspartikler er vigtig for at forstå virusinfektionspatologi samt udvikle diagnosesystemet og vaccinerne, f.eks. SARS-CoV-2¹¹, som forårsagede COVID-19-pandemien. Desuden er cryo-EM-teknikker for nylig blevet anvendt til materialevidenskab, såsom til billeddannelse af strålefølsomme materialer, der anvendes i batteri 12,13,14 og katalytiske systemer^14,15 og analyse af uorganiske materialers struktur i opløsningstilstand¹⁶.

På trods af mærkbar udvikling inden for cryo-EM og relevante teknikker findes der begrænsninger i kryoprøveforberedelse, hvilket forhindrer 3D-strukturanalyse med høj kapacitet. Forberedelse af en glasagtig isfilm med optimal tykkelse er især vigtig for at opnå 3D-strukturen af biologiske materialer med atomopløsning. Isen skal være tynd nok til at minimere baggrundsstøj fra elektroner spredt af isen og til at forhindre overlapninger af biomolekyler langs elektronstrålevejen ^1,17. Men hvis isen er for tynd, kan det få proteinmolekyler til at justere i foretrukne retninger eller denaturere 18,19,20. Derfor bør tykkelsen af glasagtig is optimeres afhængigt af størrelsen af det materiale, der er af interesse. Desuden er der typisk behov for en omfattende indsats for prøveforberedelse og manuel screening af is- og proteinintegritet på de forberedte TEM-net. Denne proces er ekstremt tidskrævende, hvilket hindrer dens effektivitet til 3D-strukturanalyse med høj kapacitet. Derfor vil forbedringer i pålideligheden og reproducerbarheden af kryo-EM-prøveforberedelse forbedre udnyttelsen af cryo-EM i strukturel biologi og kommerciel lægemiddelopdagelse samt til materialevidenskab.

Heri introducerer vi mikrofabrikationsprocesser til fremstilling af en mikromønstret chip med grafenoxid (GO) vinduer designet til cryo-EM med høj kapacitet med kontrolleret istykkelse²¹. Den mikromønstrede chip blev fremstillet ved hjælp af mikroelektromekaniske systemteknikker (MEMS), som kan manipulere chippens struktur og dimensioner afhængigt af billeddannelsesformålene. Den mikromønstrede chip med GO-vinduer har en mikrobrøndstruktur, der kan fyldes med prøveopløsningen, og dybden af mikrobrønden kan reguleres for at kontrollere tykkelsen af glaslegemeisen. Den stærke affinitet af GO for biomolekyler forbedrer koncentrationen af biomolekyler til visualisering, hvilket forbedrer effektiviteten af strukturanalysen. Desuden består den mikromønstrede chip af en Si-ramme, som giver høj mekanisk stabilitet for gitteret¹⁹, hvilket gør den ideel til håndtering af chippen under prøveforberedelsesprocedurer og cryo-EM-billeddannelse. Derfor giver en mikromønstret chip med GO-vinduer fremstillet af MEMS-teknikker pålidelighed og reproducerbarhed af kryo-EM-prøveforberedelse, som kan muliggøre effektiv og højkapacitetsstrukturanalyse baseret på cryo-EM.

Protocol

1. Fremstilling af mikromønstret chip med GO-vinduer (figur 1) Aflejr siliciumnitrid.Aflejring af siliciumnitrid med lav spænding (SixNy) på begge sider af Si-waferen (4 tommer diameter og 100 μm tykkelse) ved hjælp af kemisk dampaflejring ved lavt tryk (LPCVD) ved 830 ° C og et tryk på 150 mTorr under en strøm på 170 sccm dichlorsilan (SiH2Cl2, DCS) og 38 sccm ammoniak (NH3).<…

Representative Results

En mikromønstret chip med GO-vinduer blev fremstillet af MEMS-fabrikation og 2D GO nanoarkoverførsel. Chips til mikromønstre blev masseproduceret, med ca. 500 chips fremstillet af en 4 i wafer (figur 1B og figur 2A, B). Designet af de mikromønstrede chips kan manipuleres ved hjælp af forskellige designs af krommasken (figur 2) under fotolitografiproceduren. De fremstillede mikromønstrede chips havde kontroller…

Discussion

Mikrofabrikationsprocesserne til fremstilling af mikromønstrede chips med GO-vinduer introduceres her. Den fremstillede mikromønstrede chip er designet til at regulere tykkelsen af det glasagtige islag ved at kontrollere dybden af mikrohullet med GO-vinduer afhængigt af størrelsen på det materiale, der skal analyseres. En mikromønstret chip med GO-vinduer blev fremstillet ved hjælp af en række MEMS-teknikker og en 2D nanoarkoverførselsmetode (figur 1). Den største fordel ved at bru…

Materials

1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP)	Sigma Aldrich, USA	443778
Acetone
AFM	Park Systems, South Korea	NX-10
Aligner	Midas System, South Korea	MDA-600S
AZ 300 MIF developer	AZ Electronic Materials USA Corp., USA	184411
Cryo-EM holder	Gatan, USA	626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine	Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA	Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM)	FEI Company, USA	Helios NanoLab 650
Glow discharger	Ted Pella Inc., USA	PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution	Sigma Aldrich, USA	763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%	Alfa Aesar, USA	10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD)	Centrotherm, Germany	LPCVD E1200
maP1205 positive PR	Micro resist technology, Germany	A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake	DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea	6597-4400
Raman Spectrometer	NOST, South Korea	Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE)	Scientific Engineering, South Korea	Lab-built
SEM	Carl Zeiss, Germany	SUPRA 55VP
Si wafer	JP COMMERCE, South Korea		4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater	Dong Ah Trade Corp., South Korea	ACE-200
TEM	JEOL, Japan	JEM-2100F