Herstellung eines mikrostrukturierten Chips mit kontrollierter Dicke für die kryogene Elektronenmikroskopie mit hohem Durchsatz
Summary
Ein neu entwickelter mikrostrukturierter Chip mit Graphenoxidfenstern wird unter Anwendung mikroelektromechanischer Systemtechniken hergestellt, die eine effiziente und kryogene Elektronenmikroskopie-Bildgebung verschiedener Biomoleküle und Nanomaterialien mit hohem Durchsatz ermöglichen.
Abstract
Eine wesentliche Einschränkung für die effiziente und hochdurchlässige Strukturanalyse von Biomolekülen mittels kryogener Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) ist die Schwierigkeit, Kryo-EM-Proben mit kontrollierter Eisdicke auf der Nanoskala herzustellen. Der auf Silizium (Si) basierende Chip, der über eine regelmäßige Anordnung von Mikrolöchern mit Graphenoxid (GO) -Fenster verfügt, die auf einem dickengesteuerten Siliziumnitridfilm (SixNy) strukturiert sind, wurde unter Anwendung von MEMS-Techniken (Mikroelektromechanik) entwickelt. UV-Photolithographie, chemische Gasphasenabscheidung, nasses und trockenes Ätzen des dünnen Films und Tropfenguss von 2D-Nanoblattmaterialien wurden für die Massenproduktion der mikrostrukturierten Chips mit GO-Fenstern verwendet. Die Tiefe der Mikrolöcher wird reguliert, um die Eisdicke bei Bedarf zu kontrollieren, abhängig von der Größe der Probe für die Kryo-EM-Analyse. Die günstige Affinität von GO zu Biomolekülen konzentriert die interessierenden Biomoleküle während der Kryo-EM-Probenvorbereitung im Mikroloch. Der mikrostrukturierte Chip mit GO-Fenstern ermöglicht eine Kryo-EM-Bildgebung verschiedener biologischer Moleküle sowie anorganischer Nanomaterialien mit hohem Durchsatz.
Introduction
Die kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) wurde entwickelt, um die dreidimensionale (3D) Struktur von Proteinen in ihrem nativen Zustand 1,2,3,4 aufzulösen. Die Technik beinhaltet das Fixieren von Proteinen in einer dünnen Schicht (10-100 nm) aus Glaseis und das Aufnehmen von Projektionsbildern von zufällig orientierten Proteinen mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM), wobei die Probe bei flüssiger Stickstofftemperatur gehalten wird. Tausende bis Millionen von Projektionsbildern werden aufgenommen und verwendet, um eine 3D-Struktur des Proteins durch Rechenalgorithmen 5,6 zu rekonstruieren. Für eine erfolgreiche Analyse mit Kryo-EM wurde die Kryoprobenvorbereitung automatisiert, indem die Ausrüstung, die die Löschbedingungen, die Feuchtigkeit und die Temperatur steuert, eingefroren wurde. Die Probenlösung wird mit einer löchrigen Kohlenstoffmembran in ein TEM-Gitter geladen, nacheinander getupft, um die überschüssige Lösung zu entfernen, und dann mit flüssigem Ethan eingefroren, um dünnes, glasiges Eis 1,5,6 zu erzeugen. Mit den Fortschritten in der Kryo-EM und der Automatisierung der Probenvorbereitung7 wurde Kryo-EM zunehmend verwendet, um die Struktur von Proteinen zu lösen, einschließlich Hüllproteinen für Viren und Ionenkanalproteinen in der Zellmembran8,9,10. Die Struktur der Hüllproteine pathogener Viruspartikel ist wichtig für das Verständnis der Virusinfektionspathologie sowie für die Entwicklung des Diagnosesystems und der Impfstoffe, z. B. SARS-CoV-2 11, die dieCOVID-19-Pandemie verursacht haben. Darüber hinaus wurden Kryo-EM-Techniken in jüngster Zeit in den Materialwissenschaften angewendet, z. B. für die Abbildung strahlempfindlicher Materialien, die in Batterien 12,13,14 und katalytischen Systemen14,15 verwendet werden, und für die Analyse der Struktur anorganischer Materialien im Lösungszustand 16.
Trotz spürbarer Entwicklungen in der Kryo-EM und relevanten Techniken gibt es Einschränkungen in der Kryoprobenvorbereitung, die die Hochdurchsatz-3D-Strukturanalyse behindern. Die Herstellung eines glasigen Eisfilms mit optimaler Dicke ist besonders wichtig, um die 3D-Struktur biologischer Materialien mit atomarer Auflösung zu erhalten. Das Eis muss dünn genug sein, um Hintergrundgeräusche von Elektronen, die vom Eis gestreut werden, zu minimieren und Überlappungen von Biomolekülen entlang des Elektronenstrahlweges 1,17 zu verbieten. Wenn das Eis jedoch zu dünn ist, kann dies dazu führen, dass sich Proteinmoleküle in bevorzugten Orientierungen ausrichten oderdenaturieren 18,19,20. Daher sollte die Dicke des Glaseises in Abhängigkeit von der Größe des interessierenden Materials optimiert werden. Darüber hinaus ist in der Regel ein umfangreicher Aufwand für die Probenvorbereitung und das manuelle Screening der Eis- und Proteinintegrität auf den vorbereiteten TEM-Gittern erforderlich. Dieser Prozess ist extrem zeitaufwendig, was seine Effizienz für die 3D-Strukturanalyse mit hohem Durchsatz beeinträchtigt. Daher würden Verbesserungen der Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Kryo-EM-Probenvorbereitung den Einsatz von Kryo-EM in der Strukturbiologie und kommerziellen Arzneimittelforschung sowie in der Materialwissenschaft verbessern.
Hierin stellen wir Mikrofabrikationsprozesse zur Herstellung eines mikrostrukturierten Chips mit Graphenoxid (GO) -Fenstern vor, die für Kryo-EM mit hohem Durchsatz mit kontrollierter Eisdicke21 ausgelegt sind. Der mikrostrukturierte Chip wurde mit mikroelektromechanischen Systemtechniken (MEMS) hergestellt, die die Struktur und Abmessungen des Chips in Abhängigkeit von den Bildgebungszwecken manipulieren können. Der mikrostrukturierte Chip mit GO-Fenstern hat eine Mikrowellenstruktur, die mit der Probenlösung gefüllt werden kann, und die Tiefe der Mikrovertiefung kann reguliert werden, um die Dicke des Glaseises zu kontrollieren. Die starke Affinität von GO für Biomoleküle erhöht die Konzentration von Biomolekülen für die Visualisierung und verbessert die Effizienz der Strukturanalyse. Darüber hinaus besteht der mikrostrukturierte Chip aus einem Si-Rahmen, der eine hohe mechanische Stabilität für das Gitter19 bietet, was ihn ideal für die Handhabung des Chips während der Probenvorbereitung und der Kryo-EM-Bildgebung macht. Daher bietet ein mikrostrukturierter Chip mit GO-Fenstern, der mit MEMS-Techniken hergestellt wird, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Kryo-EM-Probenvorbereitung, die eine effiziente und hochdurchsatzbasierte Strukturanalyse auf der Grundlage von Kryo-EM ermöglichen kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier werden die Mikrofabrikationsverfahren zur Herstellung von mikrogemusterten Chips mit GO-Fenstern vorgestellt. Der hergestellte mikrostrukturierte Chip wurde entwickelt, um die Dicke der Glaskörpereisschicht zu regulieren, indem er die Tiefe des Mikrolochs mit GO-Fenstern in Abhängigkeit von der Größe des zu analysierenden Materials steuert. Ein mikrogemusterter Chip mit GO-Fenstern wurde unter Verwendung einer Reihe von MEMS-Techniken und einer 2D-Nanoblatttransfermethode hergestellt (Abbild…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-H.K., S.K., M.L. und J.P. würdigen die finanzielle Unterstützung durch das Institute for Basic Science (Grant No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. und J.P. würdigen die finanzielle Unterstützung durch das Creative-Pioneering Researchers Program der Seoul National University (2021) und den von der koreanischen Regierung finanzierten NRF-Zuschuss (MSIT; Grant Nr. NRF-2020R1A2C2101871 und NRF-2021M3A9I4022936). M.L. und J.P. würdigen die finanzielle Unterstützung durch das POSCO Science Fellowship der POSCO TJ Park Foundation und den von der koreanischen Regierung finanzierten NRF-Zuschuss (MSIT; Grant-Nr. NRF-2017R1A5A1015365). J.P. würdigt die finanzielle Unterstützung aus dem NRF-Zuschuss, der von der koreanischen Regierung (MSIT; Grant-Nr. NRF-2020R1A6C101A183) und die interdisziplinären Forschungsinitiativen Programme des College of Engineering und des College of Medicine, Seoul National University (2021). M.-H.K. erkennt die finanzielle Unterstützung aus dem NRF-Zuschuss an, der von der koreanischen Regierung (MSIT; Grant-Nr. NRF-2020R1I1A1A0107416612). Die Autoren danken den Mitarbeitern und der Crew des Seoul National University Center for Macromolecular and Cell Imaging (SNU CMCI) für ihren unermüdlichen Einsatz und ihre Ausdauer bei den Kryo-EM-Experimenten. Die Autoren danken S. J. Kim vom National Center for Inter-university Research Facilities für die Unterstützung bei den FIB-SEM-Experimenten.
Materials
| 1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
| Acetone | |||
| AFM | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
| Aligner | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
| AZ 300 MIF developer | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
| Cryo-EM holder | Gatan, USA | 626 single tilt cryo-EM holder | |
| Cryo-plunging machine | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
| Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
| Glow discharger | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
| Graphene oxide (GO) solution | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
| Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
| Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
| maP1205 positive PR | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
| Potassium hydroxide (KOH), flake | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
| Raman Spectrometer | NOST, South Korea | Confocal Micro Raman System HEDA | |
| Reactive ion etcher (RIE) | Scientific Engineering, South Korea | Lab-built | |
| SEM | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
| Si wafer | JP COMMERCE, South Korea | 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um | |
| Spin coater | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
| TEM | JEOL, Japan | JEM-2100F |
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