Fabricação de chip micro-padronizado com espessura controlada para microscopia eletrônica criogênica de alta produtividade
Summary
Um chip micro-padronizado recém-desenvolvido com janelas de óxido de grafeno é fabricado aplicando técnicas de sistema microeletromecânico, permitindo imagens eficientes e de microscopia criogênica de elétrons de vários biomoléculas e nanomateriais.
Abstract
Uma grande limitação para a análise eficiente e de estrutura de alto rendimento de biomoléculas usando microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) é a dificuldade de preparar amostras crio-EM com espessura de gelo controlada na nanoescala. O chip à base de silício (Si), que tem uma matriz regular de micro-buracos com janela de óxido de grafeno (GO) padronizado em um filme de nitreto de silício controlado pela espessura (SixNy), foi desenvolvido aplicando técnicas de sistema microeletrocrânico (MEMS). Fotolitografia UV, deposição de vapor químico, gravura molhada e seca do filme fino e lançamento de materiais de nanofolha 2D foram usados para a produção em massa dos chips micro-padronizados com janelas GO. A profundidade dos micro-buracos é regulada para controlar a espessura do gelo sob demanda, dependendo do tamanho do espécime para análise crio-EM. A afinidade favorável do GO em relação às biomoléculas concentra as biomoléculas de interesse dentro do microrifício durante a preparação da amostra crio-EM. O chip micro-padronizado com janelas GO permite imagens crio-EM de alto rendimento de várias moléculas biológicas, bem como nanomateriais inorgânicos.
Introduction
A microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) foi desenvolvida para resolver a estrutura tridimensional (3D) de proteínas em seu estado natal 1,2,3,4. A técnica envolve a fixação de proteínas em uma camada fina (10-100 nm) de gelo vítreo e a aquisição de imagens de projeção de proteínas orientadas aleatoriamente usando um microscópio eletrônico de transmissão (TEM), com a amostra mantida à temperatura de nitrogênio líquido. Milhares a milhões de imagens de projeção são adquiridas e usadas para reconstruir uma estrutura 3D da proteína por algoritmos computacionais 5,6. Para uma análise bem-sucedida com crio-EM, a preparação crio-amostra foi automatizada por meio do congelamento do equipamento que controla as condições de mancha, umidade e temperatura. A solução amostral é carregada em uma grade TEM com uma membrana de carbono furada, sucessivamente borrada para remover a solução em excesso, e, em seguida, mergulha-congelada com etano líquido para produzir gelo fino e vítreo 1,5,6. Com os avanços da crio-EM e a automação da preparação da amostra7, a crio-EM tem sido cada vez mais utilizada para resolver a estrutura de proteínas, incluindo proteínas envelope para vírus e proteínas do canal de íons na membrana celular 8,9,10. A estrutura das proteínas envelope de partículas virais patogênicas é importante para a compreensão da patologia da infecção viral, bem como para o desenvolvimento do sistema de diagnóstico e vacinas, por exemplo, SARS-CoV-211, que causou a pandemia COVID-19. Além disso, técnicas crio-EM foram recentemente aplicadas às ciências materiais, como para materiais sensíveis ao feixe de imagem utilizados na bateria 12,13,14 e sistemas catalíticos 14,15 e análise da estrutura de materiais inorgânicos em estado de solução16.
Apesar dos desenvolvimentos perceptíveis em crio-EM e técnicas relevantes, existem limitações na preparação da criom amostra, dificultando a análise da estrutura 3D de alto rendimento. Preparar um filme de gelo vítreo com espessura ideal é especialmente importante para a obtenção da estrutura 3D de materiais biológicos com resolução atômica. O gelo deve ser fino o suficiente para minimizar o ruído de fundo de elétrons espalhados pelo gelo e proibir sobreposições de biomoléculas ao longo do caminhodo feixe de elétrons 1,17. No entanto, se o gelo é muito fino, pode fazer com que moléculas de proteínas se alinhem em orientações preferenciais ou desnaturais 18,19,20. Portanto, a espessura do gelo vítreo deve ser otimizada dependendo do tamanho do material de interesse. Além disso, um esforço extensivo é normalmente necessário para a preparação da amostra e a triagem manual da integridade do gelo e da proteína nas grades TEM preparadas. Esse processo é extremamente demorado, o que dificulta sua eficiência para análise de estrutura 3D de alto rendimento. Portanto, melhorias na confiabilidade e reprodutibilidade da preparação da amostra crio-EM aumentariam a utilização da crio-EM na biologia estrutural e na descoberta de medicamentos comerciais, bem como na ciência material.
Aqui, introduzimos processos de microfabização para a fabricação de um chip micro-padronizado com janelas de óxido de grafeno (GO) projetados para crio-EM de alta produtividade com espessura de gelo controlada21. O chip micro-padronizado foi fabricado usando técnicas de sistema microeletromecânico (MEMS), que podem manipular a estrutura e as dimensões do chip dependendo dos propósitos de imagem. O chip micro-padronizado com janelas GO tem uma estrutura de microwell que pode ser preenchida com a solução de amostra, e a profundidade da microwell pode ser regulada para controlar a espessura do gelo vítreo. A forte afinidade do GO com as biomoléculas aumenta a concentração de biomoléculas para visualização, melhorando a eficiência da análise da estrutura. Além disso, o chip micro-padronizado é composto por um quadro Si, que proporciona alta estabilidade mecânica para a grade19, tornando-o ideal para manusear o chip durante os procedimentos de preparação da amostra e imagens crio-EM. Portanto, um chip micro-padronizado com janelas GO fabricadas por técnicas MEMS fornece confiabilidade e reprodutibilidade da preparação da amostra crio-EM, que pode permitir uma análise eficiente e de estrutura de alto rendimento com base no crio-EM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os processos de microfabização para a produção de chips micro-padronizados com janelas GO são introduzidos aqui. O chip micro-padronizado fabricado foi projetado para regular a espessura da camada de gelo vítreo, controlando a profundidade do micro-buraco com janelas GO, dependendo do tamanho do material a ser analisado. Um chip micro-padronizado com janelas GO foi fabricado usando uma série de técnicas MEMS e um método de transferência de nanofolha 2D (Figura 1). A maior vantagem …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-H.K., S.K., M.L., e J.P. reconhecem o apoio financeiro do Instituto de Ciência Básica (Grant No. IBS-R006-D1). S.K., M.L., e J.P. reconhecem o apoio financeiro do Programa de Pesquisadores Pioneiros criativos através da Universidade Nacional de Seul (2021) e da bolsa NRF financiada pelo governo coreano (MSIT; Grant Nos. NRF-2020R1A2C2101871 e NRF-2021M3A9I4022936). M.L. e J.P. reconhecem o apoio financeiro da Posco Science Fellowship da POSCO TJ Park Foundation e da bolsa NRF financiada pelo governo coreano (MSIT; Grant No. NRF-2017R1A5A1015365). J.P. reconhece o apoio financeiro da subvenção da NRF financiada pelo governo coreano (MSIT; Grant No. NRF-2020R1A6C10183), e os Programas de Iniciativas Interdisciplinares de Pesquisa pela Faculdade de Engenharia e Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Seul (2021). M.-H.K. reconhece o apoio financeiro da subvenção da NRF financiada pelo governo coreano (MSIT; Grant No. NRF-2020R1I1A0107416612). Os autores agradecem à equipe e à equipe do Centro Nacional universitário de Seul para Imagens Macromoleculares e Celulares (SNU CMCI) por seus esforços incansáveis e perseverança com os experimentos crio-EM. Os autores agradecem a S. J. Kim, do Centro Nacional de Instalações inter universitárias de Pesquisa, pela assistência aos experimentos fib-SEM.
Materials
| 1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
| Acetone | |||
| AFM | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
| Aligner | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
| AZ 300 MIF developer | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
| Cryo-EM holder | Gatan, USA | 626 single tilt cryo-EM holder | |
| Cryo-plunging machine | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
| Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
| Glow discharger | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
| Graphene oxide (GO) solution | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
| Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
| Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
| maP1205 positive PR | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
| Potassium hydroxide (KOH), flake | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
| Raman Spectrometer | NOST, South Korea | Confocal Micro Raman System HEDA | |
| Reactive ion etcher (RIE) | Scientific Engineering, South Korea | Lab-built | |
| SEM | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
| Si wafer | JP COMMERCE, South Korea | 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um | |
| Spin coater | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
| TEM | JEOL, Japan | JEM-2100F |
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