उच्च थ्रूपुट क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नियंत्रित मोटाई के साथ माइक्रो-पैटर्न वाली चिप का निर्माण
Summary
ग्राफीन ऑक्साइड खिड़कियों के साथ एक नव विकसित माइक्रो-पैटर्न वाली चिप को माइक्रोइलेक्ट्रोमैकेनिकल सिस्टम तकनीकों को लागू करके बनाया जाता है, जो विभिन्न बायोमोलेक्यूल्स और नैनोमैटेरियल्स के कुशल और उच्च-थ्रूपुट क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग को सक्षम करता है।
Abstract
क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) का उपयोग करके बायोमोलेक्यूल्स के कुशल और उच्च-थ्रूपुट संरचना विश्लेषण के लिए एक प्रमुख सीमा नैनोस्केल पर नियंत्रित बर्फ की मोटाई के साथ क्रायो-ईएम नमूने तैयार करने में कठिनाई है। सिलिकॉन (एसआई) आधारित चिप, जिसमें मोटाई-नियंत्रित सिलिकॉन नाइट्राइड (एसआईएक्सएन वाई) फिल्म पर पैटर्न वाले ग्राफीन ऑक्साइड (जीओ) विंडो के साथ सूक्ष्म-छेदकी एक नियमित सरणी है, माइक्रोइलेक्ट्रोमैकेनिकल सिस्टम (एमईएमएस) तकनीकों को लागू करके विकसित किया गया है। यूवी फोटोलिथोग्राफी, रासायनिक वाष्प जमाव, पतली फिल्म की गीली और सूखी नक़्क़ाशी, और 2 डी नैनोशीट सामग्री की ड्रॉप-कास्टिंग का उपयोग जीओ खिड़कियों के साथ सूक्ष्म पैटर्न वाले चिप्स के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए किया गया था। क्रायो-ईएम विश्लेषण के लिए नमूने के आकार के आधार पर, सूक्ष्म-छेद की गहराई को मांग पर बर्फ की मोटाई को नियंत्रित करने के लिए विनियमित किया जाता है। बायोमोलेक्यूल्स की ओर जीओ की अनुकूल आत्मीयता क्रायो-ईएम नमूना तैयारी के दौरान माइक्रो-होल के भीतर ब्याज के बायोमोलेक्यूल्स को केंद्रित करती है। जीओ खिड़कियों के साथ सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप विभिन्न जैविक अणुओं के साथ-साथ अकार्बनिक नैनोमैटेरियल्स के उच्च-थ्रूपुट क्रायो-ईएम इमेजिंग को सक्षम बनाती है।
Introduction
क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) को उनके मूल राज्य 1,2,3,4 में प्रोटीन की त्रि-आयामी (3 डी) संरचना को हल करने के लिए विकसित किया गया है। तकनीक में कांच की बर्फ की एक पतली परत (10-100 एनएम) में प्रोटीन को ठीक करना और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) का उपयोग करके यादृच्छिक रूप से उन्मुख प्रोटीन की प्रक्षेपण छवियों को प्राप्त करना शामिल है, जिसमें नमूना तरल नाइट्रोजन तापमान पर बनाए रखा जाता है। हजारों से लाखों प्रक्षेपण छवियों का अधिग्रहण किया जाता है और कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम 5,6 द्वारा प्रोटीन की 3 डी संरचना के पुनर्निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है। क्रायो-ईएम के साथ सफल विश्लेषण के लिए, क्रायो-नमूना तैयारी को सोख्ता की स्थिति, आर्द्रता और तापमान को नियंत्रित करने वाले उपकरणों को डुबकी-फ्रीज करके स्वचालित किया गया है। नमूना समाधान एक छेद कार्बन झिल्ली के साथ एक टेम ग्रिड पर लोड किया जाता है, अतिरिक्त समाधान को हटाने के लिए क्रमिक रूप से धब्बा लगाया जाता है, और फिर पतली, कांच की बर्फ 1,5,6 का उत्पादन करने के लिए तरल ईथेन के साथ डुबकी-जमे हुए। क्रायो-ईएम में प्रगति और नमूना तैयारी7 के स्वचालन के साथ, क्रायो-ईएम का उपयोग प्रोटीन की संरचना को हल करने के लिए तेजी से किया गया है, जिसमें कोशिका झिल्ली 8,9,10 में वायरस और आयन चैनल प्रोटीन के लिए लिफाफा प्रोटीन शामिल हैं। रोगजनक वायरल कणों के लिफाफा प्रोटीन की संरचना वायरल संक्रमण विकृति को समझने के साथ-साथ निदान प्रणाली और टीकों जैसे सार्स-सीओवी-211 को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जो कोविड-19 महामारी का कारण बनी। इसके अलावा, क्रायो-ईएम तकनीकों को हाल ही में सामग्री विज्ञान पर लागू किया गया है, जैसे कि बैटरी 12,13,14 और उत्प्रेरक प्रणालियों 14,15 में उपयोग की जाने वाली इमेजिंग बीम-संवेदनशील सामग्रियों के लिए और समाधान-राज्य16 में अकार्बनिक सामग्रियों की संरचना का विश्लेषण करना।
क्रायो-ईएम और प्रासंगिक तकनीकों में ध्यान देने योग्य विकास के बावजूद, क्रायो-नमूना तैयारी में सीमाएं मौजूद हैं, जो उच्च-थ्रूपुट 3 डी संरचना विश्लेषण में बाधा डालती हैं। परमाणु संकल्प के साथ जैविक सामग्रियों की 3 डी संरचना प्राप्त करने के लिए इष्टतम मोटाई के साथ एक कांच की बर्फ की फिल्म तैयार करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। बर्फ द्वारा बिखरे हुए इलेक्ट्रॉनों से पृष्ठभूमि शोर को कम करने और इलेक्ट्रॉन बीम पथ1,17 के साथ बायोमोलेक्यूल्स के ओवरलैप को प्रतिबंधित करने के लिए बर्फ पर्याप्त पतली होनी चाहिए। हालांकि, यदि बर्फ बहुत पतली है, तो यह प्रोटीन अणुओं को पसंदीदा झुकाव याविकृत 18,19,20 में संरेखित करने का कारण बन सकता है। इसलिए, कांच की बर्फ की मोटाई को ब्याज की सामग्री के आकार के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, तैयार टीईएम ग्रिड पर बर्फ और प्रोटीन अखंडता के नमूना तैयार करने और मैनुअल स्क्रीनिंग के लिए आमतौर पर व्यापक प्रयास की आवश्यकता होती है। यह प्रक्रिया बेहद समय लेने वाली है, जो उच्च-थ्रूपुट 3 डी संरचना विश्लेषण के लिए इसकी दक्षता में बाधा डालती है। इसलिए, क्रायो-ईएम नमूना तैयारी की विश्वसनीयता और प्रजनन क्षमता में सुधार संरचनात्मक जीव विज्ञान और वाणिज्यिक दवा की खोज के साथ-साथ सामग्री विज्ञान के लिए क्रायो-ईएम के उपयोग को बढ़ाएगा।
इसमें, हम नियंत्रित बर्फ मोटाई21 के साथ उच्च-थ्रूपुट क्रायो-ईएम के लिए डिज़ाइन की गई ग्राफीन ऑक्साइड (जीओ) खिड़कियों के साथ एक सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप बनाने के लिए माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रियाओं को पेश करते हैं। माइक्रो-पैटर्न वाली चिप को माइक्रोइलेक्ट्रोमैकेनिकल सिस्टम (एमईएमएस) तकनीकों का उपयोग करके बनाया गया था, जो इमेजिंग उद्देश्यों के आधार पर चिप की संरचना और आयामों में हेरफेर कर सकता है। जीओ खिड़कियों के साथ माइक्रो-पैटर्न वाली चिप में एक माइक्रोवेल संरचना होती है जिसे नमूना समाधान से भरा जा सकता है, और कांच की बर्फ की मोटाई को नियंत्रित करने के लिए माइक्रोवेल की गहराई को विनियमित किया जा सकता है। बायोमोलेक्यूल्स के लिए जीओ की मजबूत आत्मीयता विज़ुअलाइज़ेशन के लिए बायोमोलेक्यूल्स की एकाग्रता को बढ़ाती है, जिससे संरचना विश्लेषण की दक्षता में सुधार होता है। इसके अलावा, माइक्रो-पैटर्न वाली चिप एक सी फ्रेम से बना है, जो ग्रिड19 के लिए उच्च यांत्रिक स्थिरता प्रदान करता है, जिससे यह नमूना तैयारी प्रक्रियाओं और क्रायो-ईएम इमेजिंग के दौरान चिप को संभालने के लिए आदर्श है। इसलिए, एमईएमएस तकनीकों द्वारा गढ़ी गई जीओ खिड़कियों के साथ एक सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप क्रायो-ईएम नमूना तैयारी की विश्वसनीयता और प्रजनन क्षमता प्रदान करती है, जो क्रायो-ईएम के आधार पर कुशल और उच्च-थ्रूपुट संरचना विश्लेषण को सक्षम कर सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जीओ खिड़कियों के साथ माइक्रो-पैटर्न वाले चिप्स के उत्पादन के लिए माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रियाएं यहां पेश की जाती हैं। गढ़े हुए सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप को विश्लेषण की जाने वाली सामग्री के आकार के आधार…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एम-एचके, एसके, एमएल, और जेपी बुनियादी विज्ञान संस्थान से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं (अनुदान सं। आईबीएस-आर 006-डी 1)। एसके, एमएल, और जेपी सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी (2021) के माध्यम से क्रिएटिव-पायनियरिंग रिसर्चर्स प्रोग्राम से वित्तीय सहायता और कोरियाई सरकार (एमएसआईटी) द्वारा वित्त पोषित एनआरएफ अनुदान को स्वीकार करते हैं; अनुदान नं. एनआरएफ -2020 आर 1 ए 2 सी 2101871, और एनआरएफ -2021 एम 3 ए 9 आई 4022 9 36)। एमएल और जेपी पोस्को टीजे पार्क फाउंडेशन की पोस्को साइंस फैलोशिप और कोरियाई सरकार (एमएसआईटी) द्वारा वित्त पोषित एनआरएफ अनुदान से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं; अनुदान नं. एनआरएफ -2017 आर 1 ए 5 ए 1015365)। जेपी कोरियाई सरकार (एमएसआईटी) द्वारा वित्त पोषित एनआरएफ अनुदान से वित्तीय सहायता को स्वीकार करता है; अनुदान नं. एनआरएफ -2020 आर 1 ए 6 सी 101 ए 183), और कॉलेज ऑफ इंजीनियरिंग और कॉलेज ऑफ मेडिसिन, सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी (2021) द्वारा अंतःविषय अनुसंधान पहल कार्यक्रम। एम-एचके कोरियाई सरकार (एमएसआईटी) द्वारा वित्त पोषित एनआरएफ अनुदान से वित्तीय सहायता को स्वीकार करता है; अनुदान नं. एनआरएफ-2020आर1आई1ए1ए0107416612)। लेखक सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी सेंटर फॉर मैक्रोमोलेक्यूलर एंड सेल इमेजिंग (एसएनयू सीएमसीआई) के कर्मचारियों और चालक दल को क्रायो-ईएम प्रयोगों के साथ उनके अथक प्रयासों और दृढ़ता के लिए धन्यवाद देते हैं। लेखक एफआईबी-एसईएम प्रयोगों के साथ सहायता के लिए नेशनल सेंटर फॉर इंटर-यूनिवर्सिटी रिसर्च फैसिलिटीज के एसजे किम को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
| Acetone | |||
| AFM | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
| Aligner | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
| AZ 300 MIF developer | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
| Cryo-EM holder | Gatan, USA | 626 single tilt cryo-EM holder | |
| Cryo-plunging machine | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
| Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
| Glow discharger | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
| Graphene oxide (GO) solution | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
| Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
| Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
| maP1205 positive PR | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
| Potassium hydroxide (KOH), flake | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
| Raman Spectrometer | NOST, South Korea | Confocal Micro Raman System HEDA | |
| Reactive ion etcher (RIE) | Scientific Engineering, South Korea | Lab-built | |
| SEM | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
| Si wafer | JP COMMERCE, South Korea | 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um | |
| Spin coater | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
| TEM | JEOL, Japan | JEM-2100F |
References
- Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
- Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
- Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
- Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
- Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
- Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
- Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
- Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
- Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
- Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
- Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
- Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
- Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
- Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
- D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
- Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
- Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
- Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
- Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
- Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
- Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
- Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
- Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
- Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).
