Summary
En protokoll for etikettretensjonsutvidelsesmikroskopi (LR-ExM) er demonstrert. LR-ExM bruker et nytt sett med trifunksjonelle ankre, som gir bedre merkingseffektivitet sammenlignet med tidligere introduserte ekspansjonsmikroskopier.
Abstract
Ekspansjonsmikroskopi (ExM) er en prøveprepareringsteknikk som kan kombineres med de fleste lysmikroskopimetoder for å øke oppløsningen. Etter innebygging av celler eller vev i svulmende hydrogel, kan prøver fysisk utvides tre til seksten ganger (lineær dimensjon) sammenlignet med den opprinnelige størrelsen. Derfor økes den effektive oppløsningen til et hvilket som helst mikroskop med ekspansjonsfaktoren. En stor begrensning av den tidligere introduserte ExM er redusert fluorescens etter polymerisering og fordøyelsesprosedyren. For å overvinne denne begrensningen er det utviklet etikettretensjonsutvidelsesmikroskopi (LR-ExM), som forhindrer signaltap og forbedrer merkingseffektiviteten kraftig ved hjelp av et sett med nye trifunksjonelle ankre. Denne teknikken gjør det mulig å oppnå høyere oppløsning når man undersøker cellulære eller subcellulære strukturer i nanometrisk skala med minimalt fluorescerende signaltap. LR-ExM kan brukes ikke bare til immunfluorescensmerking, men også med selvmerkende proteinkoder, for eksempel SNAP- og CLIP-tagger, og oppnår dermed høyere merkingseffektivitet. Dette arbeidet presenterer prosedyren og feilsøkingen for denne immunostaining-baserte tilnærmingen, samt diskusjon av selvmerkingsmerkingsmetoder for LR-ExM som et alternativ.
Introduction
Ekspansjonsmikroskopi (ExM) har blitt brukt av forskere siden det først ble introdusert som en praktisk tilnærming for å oppnå superoppløsningsavbildning med konvensjonelle mikroskoper, for eksempel epifluorescens og konfokale mikroskoper 1,2,3,4,5,6,7 . Ved hjelp av ExM er det mulig å oppnå ~ 70 nm lateral oppløsning selv med vanlige konfokale mikroskoper. Når ExM kombineres med bildebehandling med superoppløsning, forbedres oppløsningen ytterligere. For eksempel kan man oppnå omtrent 30 nm oppløsning med strukturert belysningsmikroskopi (SIM), og omtrent 4 nm oppløsning med stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM)1,5.
Imidlertid er lav merkingseffektivitet et kritisk problem med standard ExM-metoder. Fluorescenstap kan variere basert på type fluorescerende grupper og fordøyelsestid. I gjennomsnitt har det imidlertid blitt rapportert at mer enn 50% av fluoroforene går tapt etter polymerisasjonen og proteinfordøyelsestrinnene til ExM, noe som er skadelig for bildekvaliteten 3,4.
Dermed er det utviklet utvidelsesmikroskopi for etikettoppbevaring (LR-ExM), som effektivt kan beholde etiketter og redusere signaltap1. Den viktigste innovasjonen av LR-ExM er bruken av et sett med trifunksjonelle ankre i stedet for bare å bruke fluorescerende fargestoffer - som i standard ExM-prosedyre - for farging av proteiner av interesse. Disse trifunksjonelle linkerne består av tre deler: (1) kontakten (f.eks. N-hydroksysuccinimid (NHS)) for å koble til antistoffet, (2) ankeret (f.eks. Metakrylamid (MA)) for å forankre proteiner til polymeren, og (3) reporteren (f.eks. Biotin eller digoxigenin (DIG)) for å bøye seg til et organisk fargestoff. De trifunksjonelle ankrene overlever polymerisasjons- og proteinfordøyelsestrinnene, og forhindrer derfor fluorofortap.
Videre har denne metoden stort potensial siden den er kompatibel med selvmerkende enzymatiske koder som SNAP eller CLIP. Enzymatiske tag-tilnærminger har noen fordeler i forhold til immunostaining-tilnærmingen angående høy spesifisitet og merkingseffektivitet 8,9,10.
I dette manuskriptet er det vist en detaljert prosedyre for LR-ExM. LR-ExM er en svært effektiv og fleksibel metode for å oppnå høy romlig oppløsning med forbedret merkingseffektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Bruk U2OS-celler dyrket i McCoys 5A-medium supplert med 10% FBS ved 37 ° C i 5% CO2.
- Kulturceller på et 16 godt avtagbart kammerglass (kulturområde 0,4 cm2) for enkel håndtering.
2. Fiksering og permeabilisering
MERK: Fikserings- og permeabiliseringsbetingelser avhenger av de optimaliserte immunostainingprotokollene. Følgende er en fikserings- og permeabiliseringsprotokoll til co-immunostain mikrotubuli og clathrinbelagte groper (CCPs).
- Når celletallet når ~0,04 x 10 6, fikser cellene med 100 μL 3,2 % paraformaldehyd (PFA) i PEM-buffer (100 mM PIPES, 1 mM EGTA og 1 mM MgCl2, pH6,9) i 10 minutter ved romtemperatur (tabell 1).
MERK: Fiksering ved hjelp av PFA utføres i en sertifisert sikkerhetshette. - Vask cellene tre ganger i 5 minutter hver med 200 μL fosfatbufret saltvann (PBS).
- Permeabiliser celler med 100 μL permeabiliseringsbuffer ved romtemperatur i 15 minutter (tabell 1).
MERK: Fortsett med merking så snart som mulig for å unngå målprotein, RNA eller DNA-nedbrytning, og for å oppnå et optimalt resultat. Hvis det er nødvendig, kan imidlertid faste prøver lagres i lang tid (opptil en måned) i en PBS-buffer ved 4 ° C. Bytt ut fordampet PBS og beskytt prøven mot fotobleking.
3. Endogen streptavidin og biotin blokkering
- Inkuber celler med streptavidinoppløsningen fortynnet i en celleblokkerende buffer (100 μL) i 15 minutter ved romtemperatur (tabell 1).
- Skyll kort med 200 μL celleblokkerende buffer.
- Inkubere celler med 100 μL biotinoppløsning fortynnet i en celleblokkerende buffer i 15 minutter ved romtemperatur.
MERK: Når du bruker en metode for merking av selvmerking, for eksempel bruk av SNAP- eller CLIP-tagger, hopper du over trinn 4 og går videre til trinn 5.1: tilnærming til merking av selvmerking.
4. Primær antistofffarging
- Inkuber celler med rotte-anti-α-tubulinantistoff (1:500 fortynning) og kaninanti-clathrin tungkjedet antistoff (1:100 fortynning) i 100 μL celleblokkerende buffer i 16 timer ved 4 ° C eller 1 time ved romtemperatur. Doble inkubasjonstiden for vevsprøvene.
- Vask prøver fire ganger med 200 μL PBS i 5 minutter hver.
5. LR-ExM-spesifikk sekundær antistofffarging
- Konjugerte IgG-antistoffer med trifunksjonelle linkere som N-hydroksysuccinimid (NHS) - metakrylamid (MA) -Biotin eller NHS-MA-Digoxigenin (Dig) (figur 1B). Syntese av trifunksjonelle ankre og konjugering av sekundære antistoffer er tidligere introdusert i Shi et al.1. Selvmerking merking tilnærming: Konjugerte IgG-antistoffer med trifunksjonelle linkere, for eksempel MA- benzylguanin (BG) -Biotin eller MA- benzylcytosin (BC) -Dig (figur 1B). Syntese av trifunksjonelle ankre og en konjugering av sekundære antistoffer er tidligere introdusert i Shi et al.1.
- Inkubere celler med esel anti-kanin-Dig-MA (1:100 fortynning) og esel anti-rotte-biotin-MA (1:100 fortynning) sekundære antistoffer i 100 μL celleblokkerende buffer i 1 time ved romtemperatur. Doble denne inkubasjonstiden for vevsprøvene.
- Vask prøver fire ganger i 200 μL PBS i 5 minutter hver.
6. Ytterligere forankring
- Inkuber celler med 0,25% glutaraldehyd (GA) i PBS (100 μL) i 15 minutter ved romtemperatur for å forankre proteinene på hydrogelen. Alternativt kan du bruke 25 mM metakrylsyre N-hydroksysuccinimidester (MA-NHS) for forankring. En times inkubasjon ved romtemperatur oppfordres.
- Vask prøver tre ganger i PBS i 5 minutter hver.
7. Gelering
MERK: Ekspansjonshastigheten bestemmes av diffusjonstiden for salt og vann ut eller inn i gelen; Dermed øker støping av tynne geler ekspansjonstiden.
- Fjern den øvre strukturen på gelplaten med 16 brønner. Tilsett 40 μL monomeroppløsning til hver brønn for å kondisjonere celler på is. Inkuber på is i 5 min.
- For å klargjøre en monomeroppløsning, se tabell 2.
- Forbered geleringsløsningen på is. Tilsett dobbelt destillert vann og 10% N, N, N′, N' Tetrametyletylendiamin (TEMED) akselerator til monomerløsningen (10% TESTET: monomerløsning = 1:47); Ikke legg til initiativtakeren ennå (tabell 3).
- For et cellekulturkammer med et areal på 0,4 cm2, bruk et geleringsløsningsvolum på ca. 40 μL. Forbered 45 μL geleringsløsning for hver brønn.
- Tilsett 10% ammoniumpersulfat (APS) til geleringsløsningen, inkuber på is, og pipetter umiddelbart 40 μL geleringsløsning i hver silikonpakningsbrønn på is. Inkuber på is i 3 minutter (10% APS: 10% TEMED: monomer løsning = 1: 1: 47).
- Beskytt prøven mot lys og flytt dekselglasset i 10 cm petriskålen til en 37 °C inkubator i 1,5 timer for gelering. For å holde fuktigheten i gelen under inkubasjonen på 37 °C, dekk petriskålen med lokket og legg noen dråper vann i petriskålen.
8. Fordøyelse
- Etter gelering, fjern glasset for å skille gelen og overfør gelen til 6 brønnplate. Fordøye innebygde celler med 2 ml fordøyelsesbuffer (tabell 1) over natten ved romtemperatur eller 4 timer ved 37 °C. Bruk minst 10 ganger overflødig volum av fordøyelsesbufferen.
- Vask geler med minst 10 ganger overflødig volum vann enn det endelige gelvolumet. Gjenta vasketrinnet fire ganger i 20 til 30 minutter hver gang. Gelen utvides omtrent to ganger i hver dimensjon.
MERK: Gelprøver kan lagres i opptil 1 måned i en PBS-buffer ved 4 °C. Bytt ut fordampet vann for å unngå tørking, og beskytt prøven mot lys under lagring. For å unngå nedbrytning av trifunksjonelle ankre, bør prøver farges så snart som mulig etter fordøyelse og vask.
9. Fluorescensfarging etter fordøyelsen
- Inkuber geler i 2 ml volum streptavidin (STV) / digoxigenin (DIG) fargebuffer med 2 til 5 μM STV-fargestoff og / eller anti-DIG-fargestoff i 24 timer ved romtemperatur. Hold prøvene i mørket.
10. Utvidelse
- Vask og utvid gelen fire ganger med for mye vann (2-3 ml) i 30 minutter til 1 time hver gang.
- For enklere visualisering av celler under fluorescerende mikroskopi, flekker celler med DAPI under den tredje av de fem vaskene. Fortynn DAPI-lagerkonsentrasjon (5 mg/ml, lagret ved 4 °C) i 1:5 000 fortynninger i vaskevann. Inkuber gelen med en DAPI-vannløsning (2 ml) i 30 minutter til 1 time.
- Vask ytterligere to ganger med 3 ml vann.
- Utvid geler i en hvilken som helst flat tallerken som er stor nok til å inneholde prøvene. De utvidede gelene som er tilberedt på 0,4 cm2 områdedekselglass passer fint i en glassbunn 6-brønnsplate.
MERK: Post-ekspansjonsfargede prøver kan lagres i opptil 4 måneder i en PBS-buffer ved 4 ° C. Tilsett nok vann for å unngå tørking og beskytt prøven mot fotobleking. Gjenta ekspansjons- og DAPI-fargingstrinnet før avbildning. For å unngå risiko for fluorofornedbrytning, må prøver avbildes så snart som mulig.
11. Bildebehandling
- Belegg det 6-brønns glassbunnavbildningskammeret med 0,01% poly-L-lysin (3 ml hver) for å immobilisere gelprøvene.
- Overfør gelprøver til det belagte bildekammeret.
- Avbilde prøvene med ønsket fluorescensomfang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Clathrin-belagte groper (CCP) immuniseres ved hjelp av trifunksjonelle ankre (figur 1B) og LR-ExM utføres som beskrevet i figur 1A. LR-ExM (figur 2C, E) viser mye høyere fluorescensintensitet sammenlignet med proteinretensjonsutvidelsesmikroskopi (proExM, figur 2A) eller biotin-ExM (figur 2B); signalet for LR-ExM var omtrent seks ganger høyere enn proExM (figur 2D). LR-ExM kan effektivt fange opp små strukturer som CCP-er, som er enda mindre enn diffraksjonsgrensen (figur 2F, G).
Noen representative resultater av LR-ExM vises ved å bruke immunostaining-tilnærmingen. Mikrotubuli og CCP er co-immunostained ved hjelp av trifunksjonelle ankre, inkludert NHS-MA-DIG og NHS-MA-biotin (figur 3A, B). LR-ExM er tilgjengelig for enzymatisk tag-basert tilnærming. Resultatet er demonstrert ved hjelp av trifunksjonelle ankre BG-MA-biotin (for SNAP-tag) og BC-MA-DIG (for CLIP-tag) i figur 3C-F. Videre kan man kombinere både immunostaining og protein-tag tilnærming i LR-ExM som vist i figur 3G-J. Fra disse resultatene er det bekreftet at LR-ExM er gunstig for å oppnå bilder av høy kvalitet med forbedret merkingseffektivitet og oppløsning.
LR-ExM viser også god ytelse i vevsprøver. LR-ExM utføres på musens hjernevev ved å co-immunostaining den presynaptiske markøren Bassoon og postsynaptic markør Homer1. De to etikettene er klare og godt atskilt, noe som støtter høy oppløsning og merkingseffektivitet (figur 4A-E).
Figur 1: Arbeidsflyt for utvidelsesmikroskopi for etikettoppbevaring (LR-ExM). (A) Arbeidsflyt av LR-ExM. (B) Skjemaer for trifunksjonelle ankre. Dette tallet er modifisert fra Shi et al.1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kvantifisering av signalretensjon (A-C) ekspansjonsmikroskopi (ExM) konfokale bilder av clathrin-belagte groper (CCP) i U2OS-celler indirekte immunstained for clathrin heavy-chain (POI). (A) Proteinretensjon ExM (ProExM) ved bruk av AF488-konjugerte sekundære antistoffer. (B) ExM med merking etter ekspansjon ved bruk av biotinkonjugerte antistoffer. (C) LR-ExM ved bruk av antistoffer konjugert med NHS-MA-biotin trifunksjonelle ankre. Prøver i B og C er etter ekspansjon farget med streptavidin-AF488. (D) Intensitetskvantifisering av AC. Feilfelt representerer SD. n = 3 for hvert tilfelle. Lengdeutvidelsesforholdene for bilder i A, B, C og E-G er henholdsvis 4.3, 4.5, 4.6 og 4.3. Lengdeutvidelsesforholdet for prøvene som brukes i plott D er 4,5 ± 0,2. Skalastenger, 500 nm (A-C og E) og 100 nm (F og G). Alle vektstenger er i pre-ekspansjonsenheter. Arb. u., vilkårlige enheter; STV, streptavidin. Alle bilder oppnås ved hjelp av et konfokalt mikroskop for roterende disk (Nikon CSU-W1) med et 60x vann nedsenkningsmål (NA1.27). Dette tallet er modifisert fra Shi et al.1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative resultater av LR-ExM ved bruk av konfokale mikroskoper. (A,B) LR-ExM konfokale bilder av mikrotubuli merket med NHS-MA-biotin-konjugerte sekundære antistoffer (magenta) og CCPer merket med NHS-MA-DIG-konjugerte sekundære antistoffer (grønn) i en U2OS-celle. (B) Forstørret visning. (C-F) LR-ExM konfokale bilder av KKP og/eller mitokondrier i HeLa-celler merket med proteinkodetilnærming (C) SNAP-tagmerket clathrin, (D) CLIP-tagmerket TOMM20 og (E) tofarget bildebehandling. (F) Forstørret visning. (G) Tofarget konfokal LR-ExM-bilder ved hjelp av en kombinasjon av immunostaining-tilnærming (NPC, rødglødende) og protein-tag-tilnærming (SNAP-merket lamin A / C (cyan)). (H) Forstørret visning. (I,J) Visninger av individuelle kanaler av H. Merk at cytoplasmatisk bakgrunn i G er forårsaket av anti-NUP153 antistoffet. Lengdeutvidelsesforholdene for bilder i A-B: 4.7, C-D: 4.4, E-F: 4.5 og G-J er 4.5. Skalastenger,1 μm for A, 200 nm for B og F, 500 nm for C-E, 2 μm for G og 500 nm for H, I og J. Alle vektstenger er i pre-ekspansjonsenheter. Alle bildene er oppnådd ved hjelp av en spinning-disk konfokal mikroskop (Nikon CSU-W1) med en 60x vann nedsenking mål (NA1.27). Dette tallet er modifisert fra Shi et al.1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representative resultater av LR-ExM på vevsprøver. (A) LR-ExM konfokalt bilde av musehjerneskive indirekte immunfarget for den presynaptiske markøren Bassoon (magenta) og den postsynaptiske markøren Homer1 (grønn). (B,C) Innzoomede bilder av synapser. (D,E) Tverrgående intensitetsprofiler langs de gule boksens lange akser. Fagott er merket med NHS-MA-DIG-konjugerte sekundære antistoffer, og Homer1 er merket med NHS-MA-biotin-konjugerte sekundære antistoffer. Alle prøver er post-ekspansjon farget med streptavindin-AF488 og eller anti-Digoksin-AF594. Lengdeutvidelsesforholdene for bilder i AC er 4,2. Skala barer, 1 μm (A), og 200 nm (B, C). Alle vektstenger er i pre-ekspansjonsenheter. Alle bildene er oppnådd ved hjelp av en spinning-disk konfokal mikroskop (Nikon CSU-W1) med en 60x vann nedsenking mål (NA1.27). Dette tallet er modifisert fra Shi et al.1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Kjemikalier og buffere Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Monomerløsning Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Geleringsløsning Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den viktigste innovasjonen til LR-ExM er å bruke trifunksjonelle ankre for effektivt å merke målproteinene og forbedre bildekvaliteten. Denne metoden er begrenset av trifunksjonelle ankre, som ikke er så lett tilgjengelige for forskere. Imidlertid kan trifunksjonelle ankre deles med andre forskere på forespørsel, og lignende produkter som ExM-sonder fra Chrometa er nå også kommersielt tilgjengelige.
I denne protokollen er det utført 1 time inkubasjon ved romtemperatur for de primære og sekundære antistofffargingstrinnene. Imidlertid kan disse trinnene alternativt gjøres over natten ved 4 ° C, og det observeres at farging over natten senker bakgrunnsstøyen.
For å forhindre strukturell forvrengning avledet fra anisotropisk ekspansjon av hydrogelen, er det viktig å utføre en grundig proteinfordøyelse ved bruk av protease3. Tidligere ekspansjonsmikroskopier viser imidlertid at mer enn 50% av fluorescensetikettene kan gå tapt etter polymerisering og proteinfordøyelsestrinn, noe som resulterer i dårlig bildekvalitet 3,4. For å løse dette problemet har LR-ExM blitt utviklet, noe som minimerer tap av signal ved å introdusere fluorescerende etiketter etter fordøyelsen1.
LR-ExM kan brukes mye med immunostaining-baserte metoder for å studere målstrukturen. Videre kan LR-ExM kombineres med selvmerkende proteinmerketilnærminger som SNAP- eller CLIP-tag-baserte tilnærminger. Dette er nyttig spesielt når gode antistoffer av interesse ikke er tilgjengelige, eller hvis man trenger forbedret målspesifisitet.
I denne artikkelen introduseres protokollen til LR-ExM med lengdeutvidelsesfaktoren på rundt 4. LR-ExM er imidlertid ikke begrenset til visse ekspansjonsforhold eller typer prøver. Faktisk kan denne metoden kombineres med alle eksisterende ekspansjonsmikroskopier, for eksempel X10-ekspansjonsmikroskopi 4,11 eller TREx 12 for å oppnå høyere oppløsning. LR-ExM kan også kombineres med pan-ExM, slik at den effektivt visualiserer hele proteinlandskapet med høy oppløsning uten å ofre spesifisitet13.
Oppsummert har LR-ExM potensial til å bli mye brukt av mange forskere som et verktøy for å belyse cellulære strukturer med høy oppløsning og merkingseffektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av U.S. National Institutes of Health (R00 GM126136 til X.S.), U.S. National Science Foundation (DMS1763272 til S.P.) og Simons Foundation (594598 til S.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
References
- Shi, X., et al.
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836 (2018).
- Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775 (2021).
- M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
