Summary
라벨 머무름 확장 현미경(LR-ExM) 프로토콜이 시연됩니다. LR-ExM은 새로운 다기능 앵커 세트를 사용하여 이전에 도입된 확장 현미경에 비해 더 나은 라벨링 효율성을 제공합니다.
Abstract
확장 현미경(ExM)은 대부분의 광학 현미경 방법과 결합하여 분해능을 높일 수 있는 샘플 준비 기술입니다. 세포 또는 조직을 팽윤성 하이드로겔에 매립한 후, 샘플은 원래 크기에 비해 물리적으로 3-16배(선형 치수)로 확장될 수 있습니다. 따라서 모든 현미경의 유효 해상도는 팽창 계수에 의해 증가합니다. 이전에 도입된 ExM의 주요 한계는 중합 및 소화 절차 후에 감소된 형광이다. 이러한 한계를 극복하기 위해 새로운 삼중 기능 앵커 세트를 사용하여 신호 손실을 방지하고 라벨링 효율성을 크게 향상시키는 라벨 머무름 확장 현미경(LR-ExM)이 개발되었습니다. 이 기술을 사용하면 최소한의 형광 신호 손실로 나노미터 규모의 세포 또는 세포하 구조를 조사할 때 더 높은 분해능을 달성할 수 있습니다. LR-ExM은 면역형광 라벨링뿐만 아니라 SNAP 및 CLIP-태그와 같은 자가 라벨링 단백질 태그와 함께 사용할 수 있어 라벨링 효율을 높일 수 있습니다. 이 연구는 이 면역염색 기반 접근법에 대한 절차 및 문제 해결뿐만 아니라 대안으로 LR-ExM의 자가 라벨링 태깅 접근법에 대한 논의를 제시합니다.
Introduction
확장 현미경(ExM)은 에피형광 및 컨포칼 현미경 1,2,3,4,5,6,7과 같은 기존 현미경으로 초고해상도 이미징을 달성하기 위한 편리한 접근 방식으로 처음 도입된 이후 연구자들에 의해 사용되어 왔습니다. . ExM을 사용하면 일반 컨포칼 현미경으로도 ~70nm의 측면 분해능을 달성할 수 있습니다. ExM을 초고해상도 이미징과 결합하면 해상도가 더욱 향상됩니다. 예를 들어, 구조 조명 현미경(SIM)으로 약 30nm, 확률적 광학 재구성 현미경(STORM)으로 약 4nm 분해능을 달성할 수 있습니다1,5.
그러나 낮은 라벨링 효율은 표준 ExM 분석법에서 중요한 문제입니다. 형광 손실은 형광 그룹의 유형과 분해 시간에 따라 달라질 수 있습니다. 그러나 평균적으로 ExM의 중합 및 단백질 분해 단계 후에 형광단의 50% 이상이 손실되는 것으로 보고되었으며, 이는 이미징 품질 3,4에 해롭습니다.
따라서 라벨을 효율적으로 유지하고신호 손실을 줄일 수 있는 라벨 머무름 확장 현미경(LR-ExM)이 개발되었습니다1. LR-ExM의 핵심 혁신은 관심 단백질을 염색하기 위해 표준 ExM 절차에서와 같이 형광 염료를 사용하는 대신 삼중 앵커 세트를 사용하는 것입니다. 이들 삼작용성 링커는 3개의 부분으로 구성된다: (1) 항체에 연결하는 커넥터 (예를 들어, N-하이드록시숙신이미드 (NHS)), (2) 단백질을 중합체에 앵커하는 앵커 (예를 들어, 메타크릴아미드 (MA)), 및 (3) 유기 염료에 접합하기 위한 리포터 (예를 들어, 비오틴 또는 디곡시제닌 (DIG)). 삼작용성 앵커는 중합 및 단백질 분해 단계에서 살아남아 형광단 손실을 방지합니다.
또한 이 방법은 SNAP 또는 CLIP과 같은 자체 라벨링 효소 태그와 호환되기 때문에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 효소 태그 접근법은 높은 특이성 및 표지 효율 8,9,10과 관련하여 면역염색 접근법에 비해 몇 가지 이점이 있습니다.
이 원고에서는 LR-ExM의 자세한 절차를 보여줍니다. LR-ExM은 향상된 라벨링 효율성으로 높은 공간 해상도를 달성하는 매우 효과적이고 유연한 방법입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 세포 배양
- 5%CO2 중 37°C에서 10% FBS가 보충된 McCoy's 5A 배지에서 배양된 U2OS 세포를 사용한다.
- 배양 세포를 취급의 용이성을 위해 16개의 잘 제거가능한 챔버 커버글라스(배양 영역 0.4cm2) 상에 놓는다.
2. 고정 및 투과
참고: 고정 및 투과화 조건은 최적화된 면역염색 프로토콜에 따라 다릅니다. 다음은 공동 면역 염색 미세 소관 및 클라 트린 코팅 피트 (CCP)에 대한 고정 및 투과화 프로토콜입니다.
- 세포 수가 ~0.04 x 10 6에 도달하면 실온에서 10분 동안 PEM 완충액(100mM PIPES, 1mM EGTA 및 1mMMgCl2, pH6.9)에 100μL의 3.2% 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 고정합니다(표 1).
알림: PFA를 사용한 고정은 인증된 안전 후드에서 수행됩니다. - 200μL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 각각 5분 동안 세포를 3회 세척합니다.
- 실온에서 15분 동안 100μL의 투과화 완충액으로 세포를 투과화합니다(표 1).
참고: 표적 단백질, RNA 또는 DNA 분해를 방지하고 최적의 결과를 얻기 위해 가능한 한 빨리 라벨링을 진행하십시오. 그러나 필요한 경우 고정 된 샘플을 4 ° C의 PBS 버퍼에 연장 된 시간 (최대 한 달) 동안 저장할 수 있습니다. 증발된 PBS를 교체하고 광퇴색으로부터 샘플을 보호합니다.
3. 내인성 스트렙타비딘 및 비오틴 차단
- 세포 차단 완충액(100 μL)에 희석된 스트렙타비딘 용액과 함께 실온에서 15분 동안 세포를 배양한다(표 1).
- 200μL의 세포 차단 완충액으로 간단히 헹굽니다.
- 실온에서 15분 동안 세포 차단 완충액에 희석된 100μL의 비오틴 용액으로 세포를 배양합니다.
참고: SNAP- 또는 CLIP- 태그 사용과 같이 자체 레이블 지정 태그 지정 방법을 사용하는 경우 4단계를 건너뛰고 5.1단계: 자체 레이블 지정 태그 지정 방법으로 진행합니다.
4. 1차 항체 염색
- 쥐 항-α-튜불린 항체(1:500 희석) 및 토끼 항-클라트린 중쇄 항체(1:100 희석)와 함께 세포를 100μL의 세포 차단 완충액에서 4°C에서 16시간 또는 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 조직 샘플에 대한 배양 시간을 두 배로 늘립니다.
- 200μL의 PBS로 샘플을 각각 5분 동안 4회 세척합니다.
5. LR-ExM 특이적 2차 항체 염색
- IgG 항체를 N-하이드록시숙신이미드(NHS)-메타크릴아미드(MA)-비오틴 또는 NHS-MA-디곡시제닌(Dig)과 같은 삼관능성 링커와 접합합니다(그림 1B). 삼관능성 앵커의 합성 및 2차 항체의 접합은 이전에 Shi et al.1에 소개되었습니다. 자가 표지 태깅 접근법: IgG 항체를 삼관능성 링커, 예컨대 MA-벤질구아닌(BG)-비오틴 또는 MA-벤질시토신(BC)-디그와 접합시킨다(도 1B). 삼관능성 앵커의 합성 및 2차 항체의 접합은 이전에 Shi et al.1에 소개되었다.
- 당나귀 항-토끼-Dig-MA(1:100 희석) 및 당나귀 항-래트-비오틴-MA(1:100 희석) 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 세포 차단 완충액 100μL로 세포를 배양합니다. 조직 샘플에 대해 이 배양 시간을 두 배로 늘립니다.
- 샘플을 200μL의 PBS에서 각각 5분 동안 4회 세척합니다.
6. 추가 앵커링
- 단백질을 하이드로겔 상에 고정시키기 위해 PBS(100μL) 중 0.25% 글루타르알데히드(GA)로 세포를 실온에서 15분 동안 배양한다. 또는 앵커링을 위해 25mM 메타크릴산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MA-NHS)를 사용하십시오. 실온에서 1 시간 배양하는 것이 좋습니다.
- PBS에서 샘플을 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
7. 겔화
알림: 팽창 속도는 소금과 물이 젤 밖으로 또는 젤로 확산되는 시간에 의해 결정됩니다. 따라서 얇은 젤을 주조하면 팽창 시간이 단축됩니다.
- 16-웰 겔 플레이트의 상부 구조물을 제거한다. 각 웰에 40μL의 단량체 용액을 추가하여 얼음 위의 세포를 컨디셔닝합니다. 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
- 단량체 용액을 제조하려면 표 2를 참조하십시오.
- 얼음 위에 겔화 용액을 준비하십시오. 이중 증류수와 10 % N, N, N', N'테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED) 촉진제를 단량체 용액에 첨가하십시오 (10 % TEMED : 단량체 용액 = 1:47). 아직 초기자를 추가하지 마십시오(표 3).
- 면적이 0.4cm2인 세포 배양 챔버의 경우, 약 40 μL의 겔화 용액 부피를 사용한다. 각 웰에 대해 45μL의 겔화 용액을 준비합니다.
- 겔화 용액에 10% 과황산암모늄(APS)을 넣고 얼음 위에서 배양한 다음 즉시 40μL의 겔화 용액을 얼음 위의 각 실리콘 개스킷에 잘 피펫팅합니다. 얼음 위에서 3분 동안 배양합니다(10% APS:10% TEMED:단량체 용액 = 1:1:47).
- 빛을 으로부터 시료를 보호하고 겔화를 위해 10cm 페트리 접시의 커버 글라스를 37°C 인큐베이터로 1.5시간 동안 옮깁니다. 37°C 인큐베이션 동안 겔의 습도를 유지하기 위해, 페트리 접시를 뚜껑으로 덮고, 페트리 접시에 몇 방울의 물을 넣는다.
8. 소화
- 겔화 후, 유리를 제거하여 겔을 분리하고 겔을 6 웰 플레이트로 옮긴다. 2mL의 분해 완충액(표 1)으로 실온에서 밤새 또는 37°C에서 4시간 동안 포매된 세포를 분해합니다. 적어도 10배 초과량의 소화 완충액을 사용하십시오.
- 최종 젤 부피보다 최소 10배 더 많은 양의 물로 젤을 세척하십시오. 매번 20 내지 30분 동안 세척 단계를 4회 반복한다. 젤은 각 차원에서 약 2 배 팽창합니다.
참고: 겔 샘플은 4°C의 PBS 버퍼에 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다. 건조를 피하기 위해 증발된 물을 교체하고 보관 중에 빛으로부터 샘플을 보호하십시오. 삼중 앵커의 분해를 방지하려면 소화 및 세척 후 가능한 한 빨리 샘플을 염색해야합니다.
9. 소화 후 형광 염색
- 2mL 부피의 스트렙타비딘(STV)/디곡시제닌(DIG) 염색 완충액에 2-5μM STV-염료 및/또는 항-DIG 염료를 사용하여 실온에서 24시간 동안 겔을 배양합니다. 샘플을 어둠 속에 보관하십시오.
10. 확장
- 과도한 물 (2-3 mL)로 매번 30 분에서 1 시간 동안 젤을 4 번 씻고 팽창시킵니다.
- 형광 현미경으로 세포를 더 쉽게 시각화하려면 5회 세척 중 3차 세척 중에 DAPI로 세포를 염색합니다. 세척수에서 1:5,000 희석액으로 DAPI 스톡 농도(5mg/mL, 4°C에서 보관)를 희석합니다. DAPI-물 용액(2mL)과 함께 겔을 30분에서 1시간 동안 배양합니다.
- 3mL의 물로 2회 더 세척합니다.
- 샘플을 담을 수 있을 만큼 충분히 큰 평평한 접시에 젤을 펼칩니다. 0.4cm2 면적의 커버글라스 상에 제조된 팽창된 젤은 유리 바닥 6웰 플레이트에 잘 들어맞는다.
참고: 팽창 후 염색된 샘플은 4°C의 PBS 버퍼에 최대 4개월 동안 보관할 수 있습니다. 건조를 방지하고 샘플을 광표백으로부터 보호하기 위해 충분한 물을 추가하십시오. 이미징하기 전에 확장 및 DAPI 염색 단계를 반복합니다. 형광단 분해의 위험을 방지하려면 가능한 한 빨리 샘플을 이미징해야 합니다.
11. 이미징
- 6웰 유리 바닥 이미징 챔버를 0.01% 폴리-L-라이신(각각 3mL)으로 코팅하여 겔 샘플을 고정화합니다.
- 겔 샘플을 코팅된 이미징 챔버로 옮깁니다.
- 원하는 형광 스코프를 사용하여 샘플을 이미지화합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
클라트린 코팅 피트(CCP)는 삼작용성 앵커(그림 1B)를 사용하여 면역염색되고 LR-ExM은 그림 1A에 설명된 대로 수행됩니다. LR-ExM (그림 2C, E)은 단백질 보유 확장 현미경 (proExM, 그림 2A) 또는 비오틴 -ExM (그림 2B)에 비해 훨씬 높은 형광 강도를 보여줍니다. LR-ExM의 신호는 proExM보다 약 6배 높았습니다(그림 2D). LR-ExM은 회절 한계보다 훨씬 작은 CCP와 같은 작은 구조를 효과적으로 포착할 수 있습니다(그림 2F,G).
LR-ExM의 일부 대표적인 결과는 면역염색 접근법을 사용하여 보여줍니다. 미세소관과 CCP는 NHS-MA-DIG 및 NHS-MA-비오틴을 포함한 삼작용 앵커를 사용하여 공동 면역염색됩니다(그림 3A,B). LR-ExM은 효소 태그 기반 접근법에 사용할 수 있습니다. 결과는 그림 3C-F에서 삼기능 앵커 BG-MA-비오틴(스냅 태그용) 및 BC-MA-DIG(클립 태그용)를 사용하여 입증됩니다. 또한 그림 3G-J와 같이 LR-ExM에서 면역 염색과 단백질 태그 접근법을 모두 결합 할 수 있습니다. 이러한 결과로부터 LR-ExM은 향상된 라벨링 효율과 해상도로 고품질 이미지를 얻는 데 유리함을 확인할 수 있습니다.
LR-ExM은 조직 샘플에서도 뛰어난 성능을 보여줍니다. LR-ExM은 시냅스 전 마커 바순과 시냅스 후 마커 Homer1을 공동 면역 염색하여 마우스 뇌 조직에서 수행됩니다. 두 라벨은 명확하고 잘 분리되어 있어 고해상도 및 라벨링 효율성을 지원합니다(그림 4A-E).
그림 1: 라벨 머무름 확장 현미경(LR-ExM)의 워크플로우. (A) LR-ExM의 워크플로우. (B) 삼중 앵커의 개략도. 이 수치는 Shi et al.1에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 클라트린 중쇄(POI)에 대해 간접적으로 면역염색된 U2OS 세포에서 클라트린 코팅 피트(CCP)의 신호 유지(A-C) 확장 현미경(ExM) 컨포칼 이미지의 정량화. (A) AF488 접합 2차 항체를 사용한 단백질 보유 ExM(ProExM). (B) 비오틴-접합 항체를 사용한 팽창 후 표지가 있는 ExM. (C) NHS-MA-비오틴 삼관능성 앵커와 접합된 항체를 사용하는 LR-ExM. B 및 C의 샘플은 스트렙타비딘-AF488로 팽창 후 염색됩니다. (D) A-C의 강도 정량화. 오차 막대는 각 경우에 대해 SD. n = 3을 나타냅니다. A, B, C 및 E-G의 이미지에 대한 길이 확장 비율은 각각 4.3, 4.5, 4.6 및 4.3입니다. 플롯 D에 사용된 표본의 길이 확장비는 4.5 ± 0.2입니다. 스케일 바, 500 nm (A-C 및 E) 및 100 nm (F 및 G). 모든 축척 막대는 확장 전 단위입니다. 중재. u., 임의의 단위; STV, 스트렙타비딘. 모든 이미지는 60x 수침 대물렌즈(NA1.27)가 있는 회전 디스크 컨포칼 현미경(Nikon CSU-W1)을 사용하여 얻습니다. 이 수치는 Shi et al.1에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 컨포칼 현미경을 사용한 LR-ExM의 대표적인 결과. (A,B) U2OS 세포에서 NHS-MA-비오틴 접합 2차 항체(마젠타)로 표지된 미세소관 및 NHS-MA-DIG-접합 2차 항체(녹색)로 표지된 CCP의 LR-ExM 공초점 이미지. (B) 확대보기. (C-F) 단백질 태그 접근법 (C) SNAP 태그 표지 클라 트린, (D) CLIP 태그 표지 TOMM20 및 (E) 2 색 이미징을 사용하여 표지 된 HeLa 세포에서 CCP 및 / 또는 미토콘드리아의 LR-ExM 컨 포칼 이미지. (F) 확대 보기. (G) 면역염색 접근법(NPC, 레드 핫)과 단백질 태그 접근법(SNAP 태그 라민 A/C(시안))의 조합을 사용한 2색 컨포칼 LR-ExM 이미지. (H) 확대 보기. (I, J) H의 개별 채널 조회수. G 의 세포질 배경은 항-NUP153 항체에 의해 유발됩니다. A-B: 4.7, CD: 4.4, E-F: 4.5 및 G-J 이미지의 길이 확장 비율은 4.5입니다. 스케일 바, A의 경우 1μm, B 및 F의 경우 200nm, CE의 경우 500nm, G의 경우 2μm, H, I 및 J의 경우 500nm입니다. 모든 축척 막대는 확장 전 단위입니다. 모든 이미지는 60x 수침 대물렌즈(NA1.27)가 있는 회전 디스크 컨포칼 현미경(Nikon CSU-W1)을 사용하여 얻습니다. 이 수치는 Shi et al.1에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 조직 샘플에 대한 LR-ExM의 대표적인 결과. (A) 시냅스 전 마커 바순 (마젠타) 및 시냅스 후 마커 Homer1 (녹색)에 대해 간접적으로 면역 염색 된 마우스 뇌 절편의 LR-ExM 공초점 이미지. (ᄃ,씨) 시냅스의 확대 이미지. (D,E) 노란색 상자 긴 축을 따라 가로 강도 프로파일. 바순은 NHS-MA-DIG-접합 2 차 항체로 표지되고, 호머1은 NHS-MA- 비오틴- 접합 2 차 항체로 표지된다. 모든 샘플은 스트렙타빈딘-AF488 및/또는 항-디곡신-AF594로 팽창후 염색된다. A-C 에서 이미지의 길이 확장 비율은 4.2입니다. 스케일 바, 1 μm (A) 및 200 nm (B, C). 모든 축척 막대는 확장 전 단위입니다. 모든 이미지는 60x 수침 대물렌즈(NA1.27)가 있는 회전 디스크 컨포칼 현미경(Nikon CSU-W1)을 사용하여 얻습니다. 이 수치는 Shi et al.1에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 화학물질 및 완충액 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 단량체 용액 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 겔화 용액 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LR-ExM의 핵심 혁신은 삼중 기능 앵커를 사용하여 표적 단백질을 효과적으로 라벨링하고 이미지 품질을 개선하는 것입니다. 이 방법은 연구자가 쉽게 사용할 수없는 삼중 기능 앵커에 의해 제한됩니다. 그러나 요청 시 삼중 기능 앵커를 다른 연구자와 공유할 수 있으며 Chrometa의 ExM 프로브와 같은 유사한 제품도 현재 상용화되고 있습니다.
이 프로토콜에서, 실온에서 1시간 인큐베이션이 1차 및 2차 항체 염색 단계에 대해 수행되었다. 그러나, 이들 단계는 대안적으로 4°C에서 밤새 수행될 수 있고, 밤새 염색이 배경 소음을 낮추는 것으로 관찰된다.
하이드로젤의 이방성 팽창에 따른 구조적 왜곡을 방지하기 위해서는 프로테아제3를 이용한 철저한 단백질 소화를 수행하는 것이 중요하다. 그러나 이전의 확장 현미경 검사에서는 중합 및 단백질 분해 단계 후에 형광 라벨의 50% 이상이 손실될 수 있으며, 이로 인해이미지 품질이 저하될 수 있습니다3,4. 이 문제를 해결하기 위해 분해 후 형광 라벨을 도입하여 신호 손실을 최소화하는 LR-ExM이 개발되었습니다1.
LR-ExM은 표적 구조를 연구하기 위해 면역 염색 기반 방법과 함께 널리 사용될 수 있습니다. 또한 LR-ExM은 SNAP 또는 CLIP 태그 기반 접근법과 같은 자가 라벨링 단백질 태그 접근법과 결합될 수 있습니다. 이는 특히 관심있는 우수한 항체를 사용할 수 없거나 향상된 표적 특이성이 필요한 경우에 유용합니다.
이 논문에서는 길이 확장 계수가 약 4인 LR-ExM의 프로토콜을 소개합니다. 그러나 LR-ExM은 특정 팽창 비율이나 샘플 유형에 국한되지 않습니다. 실제로 이 방법은 X10 확장 현미경 4,11 또는 TREx 12와 같은 기존 확장 현미경과 결합하여 더 높은 분해능을 달성할 수 있습니다. LR-ExM은 또한 pan-ExM과 결합할 수 있으므로 특이성을 희생하지 않으면서 전체 단백질 환경을 고해상도로 효과적으로 시각화할 수 있습니다13.
요약하면, LR-ExM은 고해상도 및 라벨링 효율로 세포 구조를 밝히는 도구로 많은 연구자들에 의해 널리 사용될 가능성이 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 미국 국립 보건원 (R00 GM126136에서 X.S.), 미국 국립 과학 재단 (DMS1763272에서 S.P.) 및 시몬스 재단 (594598에서 S.P.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
References
- Shi, X., et al.
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836 (2018).
- Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775 (2021).
- M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
