L’encefalite autoimmune è una nuova categoria di malattie mediate da anticorpi del sistema nervoso centrale. I neuroni ippocampali possono essere utilizzati per scoprire e caratterizzare questi anticorpi. Questo articolo fornisce un protocollo per la coltura cellulare primaria e l’immunocolorazione per determinare gli autoanticorpi nel siero e nel liquido cerebrospinale dei pazienti.
Negli ultimi 15 anni, una nuova categoria di malattie mediate da anticorpi del sistema nervoso centrale (SNC) è stata caratterizzata ed è ora definita come “encefalite autoimmune” (AE). Attualmente sono note 17 sindromi AE e tutte sono associate ad anticorpi contro la superficie delle cellule neuronali o le proteine sinaptiche. Le sindromi cliniche sono complesse e variano a seconda del tipo di anticorpo associato. La più nota di queste malattie è l’encefalite anti-N-metil D-aspartato (NMDAR), che è un disturbo neuropsichiatrico di spicco associato a gravi disturbi della memoria e del comportamento. Gli anticorpi associati reagiscono con la subunità GluN1 del NMDAR nel dominio N-terminale. L’approccio più frequentemente utilizzato per la scoperta e la caratterizzazione degli anticorpi AE include la coltura di neuroni ippocampali dissociati, fetali, roditori. Durante il processo di caratterizzazione degli anticorpi, i neuroni vivi in coltura sono esposti al siero o al liquido cerebrospinale dei pazienti e il rilevamento della reattività indica che i campioni di siero o CSF del paziente contengono anticorpi contro gli antigeni di superficie neuronale. Le colture ippocampali possono anche essere utilizzate per determinare se gli anticorpi nei pazienti sono potenzialmente patogeni esaminando se causano alterazioni strutturali o funzionali dei neuroni. Il livello di successo di questi studi dipende dalla qualità delle colture e dai protocolli utilizzati per ottenere e rilevare la reattività dei campioni di pazienti. Questo articolo fornisce un protocollo ottimizzato per la coltura cellulare primaria di neuroni ippocampali di ratto fetale combinato con immunocolorazione per determinare la presenza di anticorpi nel siero o nel liquido cerebrospinale dei pazienti. Viene inoltre presentato un esempio di come esaminare i potenziali effetti patogeni degli anticorpi NMDAR utilizzando neuroni in coltura e imaging del calcio.
L’encefalite autoimmune (AE) è una categoria recentemente scoperta di malattie del sistema nervoso centrale (SNC) mediate da anticorpi che colpiscono la superficie neuronale o le proteine sinaptiche 1,2. Le caratteristiche cliniche variano a seconda dell’anticorpo, ma comunemente includono disturbi della memoria e della cognizione, comportamento alterato e sintomi psichiatrici, movimenti anormali, disfunzione del sonno, diminuzione del livello di coscienza e convulsioni. Questi disturbi possono colpire individui di tutte le età, con alcuni tipi di AE che colpiscono prevalentemente bambini e giovani adulti2.
Negli ultimi 15 anni sono state descritte 17 sindromi AE con anticorpi contro specifiche proteine di superficie neuronale/sinaptica (Tabella 1). Alcuni esempi dei bersagli neuronali includono i recettori eccitatori sinaptici NMDAR3,4 e AMPAR5, il recettore inibitorio sinaptico GABAbR6, la proteina secreta neuronale LGI17 e la molecola di adesione cellulare IgLON58. Per la maggior parte di questi eventi avversi, gli studi hanno dimostrato che gli anticorpi interrompono la struttura o la funzione del loro antigene bersaglio, sostenendo fortemente un ruolo patogeno. Ad esempio, nell’encefalite anti-NMDAR, gli anticorpi reagiscono con il dominio N-terminale della subunità GluN1 del NMDAR, producendo un’internalizzazione selettiva e reversibile di questi recettori che si traduce in alterazioni neuropsichiatriche prominenti 4,9,10,11. Pertanto, l’identificazione di uno qualsiasi dei 17 anticorpi noti nel siero o nel liquido cerebrospinale di un paziente può anche essere utilizzata come test diagnostico che stabilisce la diagnosi di un evento avverso specifico.
Una delle tecniche più frequentemente utilizzate per l’identificazione e la caratterizzazione di questi anticorpi include l’uso di colture di neuroni ippocampali dissociati, fetali, roditori. Queste colture sono utili per diversi motivi: il cervello embrionale è facile da dissociare e contiene un basso livello di cellule gliali, la principale fonte di contaminazione nelle colture neuronali12; la popolazione cellulare dell’ippocampo è relativamente omogenea rispetto alla maggior parte delle altre regioni del SNC, con cellule piramidali che rappresentano la stragrande maggioranza13,14; le colture sono preparate da embrioni in stadio avanzato quando la generazione di neuroni piramidali è completa, ma le cellule granulari non si sono ancora sviluppate, aumentando ulteriormente l’omogeneità della coltura; Quando coltivati, i neuroni piramidali esprimono la maggior parte delle loro principali caratteristiche fenotipiche, sono in grado di formare dendriti ben sviluppati e stabilire reti sinapticamente connesse che possono essere utilizzate per indagini strutturali ed elettrofisiologiche12,13; Poiché gli anticorpi non possono penetrare nei neuroni vivi, l’uso di colture vive consente l’identificazione di bersagli antigenici che risiedono sulla superficie cellulare; e l’immunoprecipitazione del complesso anticorpo-antigene da colture neuronali consente l’identificazione dell’antigene bersaglio5.
Il successo degli studi che utilizzano colture neuronali dipende fortemente dalla qualità delle colture e dai protocolli utilizzati per valutare l’immunoreattività del siero o del liquido cerebrospinale (CSF) di un paziente. Le variabili che possono influenzare le colture includono le procedure per l’isolamento dell’ippocampo prima dello sviluppo della coltura, la dissociazione del tessuto, la densità di placcatura, la superficie di crescita utilizzata e la composizione dei terreni13,15,16. Questo articolo fornisce un protocollo ottimizzato per la coltura cellulare primaria di neuroni ippocampali di ratto fetale combinato con immunocolorazione fluorescente che può essere utilizzata per determinare la presenza di anticorpi contro antigeni AE noti e potenzialmente nuovi bersagli di superficie. Fornisce anche un esempio di come esaminare gli effetti patogeni degli anticorpi NMDAR mediante tecniche di imaging di cellule vive utilizzando neuroni ippocampali in coltura che esprimono un indicatore di calcio geneticamente codificato (GECI) della famiglia GCaMP, GCaMP5G.
Proteina bersaglio | Funzione proteica | Compartimento celle | Sindrome principale |
NMDAR | Ion Chanel | Proteina sinaptica | Encefalite anti-NMDAR |
AMPAR | Ion Chanel | Proteina sinaptica | Encefalite limbica |
GluK2 | Ion Chanel | Proteina sinaptica | Encefalite |
GABAaR | Ion Chanel | Proteina sinaptica | Encefalite |
GABAbR | Recettore metabotropico | Proteina sinaptica | Encefalite limbica |
mGluR1 | Recettore metabotropico | Proteina sinaptica | Encefalite |
mGluR2 | Recettore metabotropico | Proteina sinaptica | Encefalite |
mGluR5 | Recettore metabotropico | Proteina sinaptica | Encefalite |
D2R | Recettore metabotropico | Proteina sinaptica | Encefalite da gangli della base |
LGI1 | Molecola di adesione | Proteine della superficie cellulare | Encefalite limbica |
CASPR2 | Molecola di adesione | Proteine della superficie cellulare | Encefalite limbica |
IgLON5 | Molecola di adesione | Proteine della superficie cellulare | Malattia anti-IgLON5 |
Neurexin-3α | Molecola di adesione | Proteine della superficie cellulare | Encefalite |
DNER (Tr) | Proteina transmembrana | Proteine della superficie cellulare | Encefalite |
SEZ6L | Proteina transmembrana | Proteine della superficie cellulare | Encefalite |
Anfifisina | Molecola strutturale | Proteine della superficie cellulare | Encefalite limbica |
DPPX | Peptidasi | Proteine della superficie cellulare | Encefalite |
Tabella 1: Anticorpi contro la superficie delle cellule neuronali e le proteine sinaptiche.
Il crescente campo dell’autoimmunità mediata da anticorpi ha aperto una finestra di opportunità per l’identificazione di autoanticorpi neuronali che possono essere utilizzati per migliorare la diagnosi e il trattamento dei pazienti. Le colture di neuroni ippocampali sono uno strumento essenziale per l’identificazione degli anticorpi; Pertanto, è importante eseguire un protocollo standardizzato per ottenere risultati affidabili e riproducibili. I passaggi più importanti da considerare, le limitazioni e la risoluzione dei problemi, sono discussi qui.
I passaggi critici di questo protocollo possono essere raggruppati in tre categorie a seconda che influenzino la purezza, l’omogeneità o la vitalità dei neuroni ippocampali.
Purezza – Per ottenere colture cellulari primarie ottimali, lo sperimentatore deve essere sicuro, addestrato e in grado di lavorare rapidamente, soprattutto per ridurre al minimo il tempo della dissezione. Anche se i neuroni piramidali sono il tipo di cellula principale, l’ippocampo contiene una varietà di interneuroni14. Per generare colture con cellule gliali minime, l’ippocampo deve essere estratto con il minimo tessuto circostante. L’uso di uno sfondo nero durante la dissezione aiuta a identificare i limiti dell’ippocampo sotto lo stereomicroscopio. Inoltre, si dovrebbe tener conto del fatto che densità cellulari più basse si traducono in un minore supporto paracrino e rendono più difficile mantenere la coltura13. Quindi, è importante tenere a mente questo equilibrio. Questo è importante negli studi di imaging che utilizzano un basso numero di cellule (50.000 neuroni per piatto di 3,5 cm). Per poter avere più tempo per l’estrazione dell’ippocampo, è necessario utilizzare Hibernate media che preserva il tessuto17. Anche lavorare con strumenti chirurgici adeguati è essenziale. Gli strumenti di alta precisione sono delicati, quindi la riproducibilità della tecnica dovrebbe essere garantita proteggendoli attentamente.
Omogeneità – Per sviluppare una coltura senza aggregati cellulari, la dissociazione meccanica delle cellule è stata migliorata combinando l’uso di pipette di vetro pre-tirate con una pipetta standard da 1.000 μL.
Viabilità – In questo protocollo, non sono stati aggiunti antibiotici perché influenzano l’eccitabilità neuronale e alterano le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni coltivati18. Pertanto, la contaminazione è molto probabile se non vengono mantenuti i più alti standard di sterilità. Anche la temperatura è un fattore chiave. Mantenere il tessuto freddo durante l’isolamento dell’ippocampo rallenta il metabolismo e diminuisce la degradazione cellulare. Il tessuto è stato, quindi, tenuto sul ghiaccio fino al processo di dissociazione cellulare. Inoltre, è fondamentale trovare il corretto equilibrio durante la dissociazione enzimatica cellulare che disaggrega le cellule senza marcata lisi cellulare. In questo protocollo, i tempi di incubazione con tripsina e le successive fasi di lavaggio sono stati ottimizzati per ottenere singole cellule con spazio sufficiente per consentire la creazione di una rete neuronale appropriata.
I passaggi critici si trovano anche nelle registrazioni fluorescenti di immunocolorazione dal vivo e dell’attività del calcio dalle colture neuronali. Per eseguire con successo l’immunocolorazione dal vivo per determinare la presenza di anticorpi contro le proteine della superficie cellulare nei campioni di pazienti, è necessario evitare la permeabilizzazione delle cellule che consentirebbe agli anticorpi di accedere alle proteine intracellulari. Inoltre, in base al titolo degli anticorpi, il tempo di incubazione e la diluizione del campione devono essere regolati di conseguenza (ad esempio, anticorpi con titoli molto alti possono dare una colorazione di fondo che rende difficile l’interpretazione dei risultati). Quando si esegue la valutazione della patogenicità degli autoanticorpi con imaging del calcio, è necessario utilizzare un mezzo ottimale per le misurazioni dell’attività cellulare (ad esempio, la soppressione di Mg2+ nel terreno di coltura è importante per buone prestazioni). Inoltre, per l’imaging a fluorescenza, i mezzi con indicatori di pH come il rosso fenolo dovrebbero essere evitati in quanto introducono un segnale di fondo non specifico.
Ci sono due principali limitazioni dell’uso delle colture neuronali ippocampali. In primo luogo, rispetto alle linee cellulari stabili, le colture primarie devono essere generate continuamente, e questo implica l’uso regolare di animali da laboratorio. Le linee di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) potrebbero sostituire la necessità di utilizzare modelli animali, ma i protocolli di differenziazione per iPSC non sono ancora ottimali. In secondo luogo, i neuroni derivati da iPSC non esprimono gli spettri completi delle proteine di superficie e, quindi, se utilizzati, l’assenza di reattività non implica necessariamente la negatività del campione19.
Esistono tre metodi per lo screening della presenza di autoanticorpi nel siero o nel liquido cerebrospinale di pazienti sospettati di avere AE: test basato sui tessuti (TBA) utilizzando tessuto cerebrale di ratto, saggio basato su cellule (CBA) utilizzando cellule HEK trasfettate per esprimere proteine neuronali e l’applicazione riportata qui utilizzando colture vive di neuroni ippocampali19. L’importanza del metodo del neurone ippocampale in coltura risiede nella sua capacità di differenziare la reattività con antigeni di superficie e intracellulari che non possono essere facilmente distinti dal TBA. Inoltre, le colture neuronali primarie, a differenza del CBA nelle cellule trasfettate HEK, non sono limitate dal repertorio di proteine trasfettate. Inoltre, i neuroni ippocampali in coltura possono essere utilizzati per identificare nuovi anticorpi e i loro antigeni bersaglio quando combinati con immunoprecipitazione e spettrometria di massa e, quindi, ampliare lo spettro di anticorpi identificabili. Infine, consente la valutazione degli effetti patogeni degli autoanticorpi mediante metodi di imaging live in grado di monitorare le alterazioni dell’attività cellulare. In conclusione, l’identificazione di nuovi autoanticorpi consente infine l’avvio di immunoterapie specifiche per migliorare gli esiti dei pazienti.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Merche Rivas, Maria Marsal, Gustavo Castro, Jordi Cortés, Alina Hirschmann e Angel Sandoval (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) e Mercedes Alba, Marija Radosevic, David Soto, Xavier Gasull, Mar Guasp e Lidia Sabater (IDIBAPS, Hospital Clínic, Università di Barcellona) per il loro supporto tecnico e per la fornitura di reagenti, e Josep Dalmau e Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Hospital Clínic, Università di Barcellona) per la loro revisione critica del manoscritto e tutoraggio. Questo studio è stato finanziato dall’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) e cofinanziato dall’Unione Europea, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad – Severo Ochoa programma per centri di eccellenza in ricerca e sviluppo (CEX2019-000910-S, P.L-A.); Programma CERCA e Laserlab-Europe (871124, P.L-A.); Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); e Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Beaker 100 mL | Pirex | – | |
Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Curved forceps | FST | 11009-13 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | – | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
Forceps | FST | 11000-12 | |
Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | – | |
Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | – | |
ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
Microscope cell chamber | Custom-build | – | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
NBQX | Tocris | 373 | |
Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | – | |
Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
Polystyrene ice tray | – | – | re-used cap of a polysterene box |
Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
Scissors | FST | 14068-12 | |
Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |