자가 면역 뇌염은 중추 신경계의 항체 매개 질환의 새로운 범주입니다. 해마 뉴런은 이러한 항체를 발견하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 논문은 환자의 혈청 및 뇌척수액에서 자가항체를 결정하기 위한 일차 세포 배양 및 면역염색을 위한 프로토콜을 제공한다.
지난 15 년 동안 중추 신경계 (CNS)의 항체 매개 질환의 새로운 범주가 특성화되어 현재 “자가 면역 뇌염”(AE)으로 정의됩니다. 현재 17 개의 알려진 AE 증후군이 있으며 모두 신경 세포 표면 또는 시냅스 단백질에 대한 항체와 관련이 있습니다. 임상 증후군은 복잡하며 관련 항체의 유형에 따라 다릅니다. 이러한 질병 중 가장 잘 알려진 것은 항 -N- 메틸 D- 아스 파르 테이트 수용체 (NMDAR) 뇌염으로, 심각한 기억 및 행동 장애와 관련된 두드러진 신경 정신병 장애입니다. 관련 항체는 N-말단 도메인에서 NMDAR의 GluN1 서브유닛과 반응합니다. AE 항체의 발견 및 특성화에 가장 빈번하게 사용되는 접근법은 해리 된, 태아, 설치류 해마 뉴런의 배양을 포함한다. 항체 특성화 과정에서 배양 물의 살아있는 뉴런은 환자의 혈청 또는 CSF에 노출되며 반응성의 검출은 환자의 혈청 또는 CSF 샘플이 뉴런 표면 항원에 대한 항체를 포함하고 있음을 나타냅니다. 해마 배양은 또한 환자의 항체가 뉴런의 구조적 또는 기능적 변화를 유발하는지 여부를 검사하여 잠재적으로 병원성인인지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 연구의 성공 수준은 배양의 품질과 환자 샘플의 반응성을 얻고 감지하는 데 사용되는 프로토콜에 따라 다릅니다. 이 논문은 환자의 혈청 또는 CSF에서 항체의 존재를 확인하기 위해 면역 염색과 결합 된 태아 쥐 해마 뉴런의 1 차 세포 배양에 최적화 된 프로토콜을 제공합니다. 배양된 뉴런 및 칼슘 이미징을 사용하여 NMDAR 항체의 잠재적인 병원성 효과를 검사하는 방법의 예도 제시됩니다.
자가 면역 뇌염 (AE)은 최근에 발견 된 신경 표면 또는 시냅스 단백질 1,2를 표적으로하는 항체에 의해 매개되는 중추 신경계 (CNS) 질환의 범주입니다. 임상적 특징은 항체에 따라 다르지만 일반적으로 기억력 및 인지 장애, 행동 변화 및 정신과 증상, 비정상적인 움직임, 수면 장애, 의식 수준 감소 및 발작을 포함합니다. 이러한 장애는 모든 연령대의 개인에게 영향을 미칠 수 있으며 일부 유형의 AE는 주로 어린이와 젊은 성인에게 영향을 미칩니다2.
지난 15 년 동안 특정 신경 표면 / 시냅스 단백질에 대한 항체가있는 17 개의 AE 증후군이 설명되었습니다 (표 1). 뉴런 표적의 몇 가지 예는 시냅스 흥분성 수용체 NMDAR3,4 및 AMPAR5, 시냅스 억제 수용체 GABAbR6, 뉴런 분비 단백질 LGI17, 및 세포 부착 분자 IgLON58을 포함한다. 이러한 AE의 대부분에서 연구에 따르면 항체는 표적 항원의 구조나 기능을 방해하여 병원성 역할을 강력하게 지원합니다. 예를 들어, 항 -NMDAR 뇌염에서 항체는 NMDAR의 GluN1 서브 유닛의 N- 말단 도메인과 반응하여 이러한 수용체의 선택적이고 가역적 인 내재화를 생성하여 두드러진 신경 정신병 적 변화를 초래합니다 4,9,10,11. 따라서,환자의 혈청 또는 CSF에서 17 개의 알려진 항체 중 임의의 것을 확인하는 것은 특정 AE의 진단을 확립하는 진단 테스트로도 사용될 수 있습니다.
이들 항체의 확인 및 특성화에 더 빈번하게 사용되는 기술 중 하나는 해리 된, 태아, 설치류 해마 뉴런의 배양 물의 사용을 포함한다. 이들 배양은 여러 가지 이유로 유용하다: 배아 뇌는 해리하기 쉽고, 뉴런 배양에서 오염의 주요 원인인 낮은 수준의 신경교 세포를 함유한다12; 해마의 세포 집단은 CNS의 대부분의 다른 영역에 비해 상대적으로 균질하며 피라미드 세포가 대다수를 차지합니다13,14; 배양은 피라미드 뉴런의 생성이 완료되었지만 과립 세포가 아직 발달하지 않은 후기 단계의 배아에서 준비되어 배양의 균질성을 더욱 높입니다. 배양 될 때, 피라미드 뉴런은 대부분의 주요 표현형 특징을 발현하고, 잘 발달 된 수상 돌기를 형성 할 수 있으며, 구조적 및 전기 생리 학적 조사에 사용될 수있는 시냅스 적으로 연결된 네트워크를 확립 할 수있다12,13; 항체는 살아있는 뉴런을 관통 할 수 없기 때문에 살아있는 배양을 사용하면 세포 표면에있는 항원 표적을 식별 할 수 있습니다. 및 뉴런 배양물로부터의 항체-항원 복합체의 면역침전은 표적 항원의 동정을 허용한다5.
신경 세포 배양을 사용한 연구의 성공 여부는 배양의 품질과 환자의 혈청 또는 뇌척수액(CSF)의 면역 반응성을 평가하는 데 사용되는 프로토콜에 크게 좌우됩니다. 배양에 영향을 미칠 수 있는 변수에는 배양 발달 전에 해마의 분리 절차, 조직의 해리, 도금 밀도, 사용된 성장 표면 및 배지 13,15,16의 구성이 포함됩니다. 이 논문은 알려진 AE 항원 및 잠재적으로 새로운 표면 표적에 대한 항체의 존재를 확인하는 데 사용할 수 있는 형광 면역염색과 결합된 태아 쥐 해마 뉴런의 1차 세포 배양에 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 또한 GCaMP 계열인 GCaMP5G에서 유전적으로 암호화된 칼슘 지표(GECI)를 발현하는 배양된 해마 뉴런을 사용하여 생세포 이미징 기술로 NMDAR 항체의 병원성 효과를 검사하는 방법의 예를 제공합니다.
표적 단백질 | 단백질 기능 | 셀 구획 | 주 증후군 |
엔다르 | 이온 샤넬 | 시냅스 단백질 | 항 NMDAR 뇌염 |
암파르 | 이온 샤넬 | 시냅스 단백질 | 변연계 뇌염 |
글루K2 | 이온 샤넬 | 시냅스 단백질 | 뇌염 |
가바 아르 | 이온 샤넬 | 시냅스 단백질 | 뇌염 |
가바브르 | 대사성 수용체 | 시냅스 단백질 | 변연계 뇌염 |
mGluR1 | 대사성 수용체 | 시냅스 단백질 | 뇌염 |
mGluR2 | 대사성 수용체 | 시냅스 단백질 | 뇌염 |
엠글루R5 | 대사성 수용체 | 시냅스 단백질 | 뇌염 |
D2R | 대사성 수용체 | 시냅스 단백질 | 기저핵 뇌염 |
LGI1 | 접착 분자 | 세포 표면 단백질 | 변연계 뇌염 |
카스프르2 | 접착 분자 | 세포 표면 단백질 | 변연계 뇌염 |
이그론5 | 접착 분자 | 세포 표면 단백질 | 항 -IgLON5 질병 |
뉴렉신-3α | 접착 분자 | 세포 표면 단백질 | 뇌염 |
DNER (Tr) | 막횡단 단백질 | 세포 표면 단백질 | 뇌염 |
시즈6L | 막횡단 단백질 | 세포 표면 단백질 | 뇌염 |
양서류 | 구조 분자 | 세포 표면 단백질 | 변연계 뇌염 |
증권 시세 표시기 | 펩티다아제 | 세포 표면 단백질 | 뇌염 |
표 1: 신경 세포 표면 및 시냅스 단백질에 대한 항체.
항체 매개 자가면역의 성장하는 분야는 환자의 진단 및 치료를 개선하는 데 사용할 수 있는 신경 자가항체의 식별을 위한 기회의 창을 열었습니다. 해마 뉴런의 배양은 항체 식별에 필수적인 도구입니다. 따라서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻으려면 표준화된 프로토콜을 수행하는 것이 중요합니다. 고려해야 할 가장 중요한 단계, 제한 사항 및 문제 해결은 여기에서 설명합니다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 해마 뉴런의 순도, 균질성 또는 생존력에 영향을 미치는지 여부에 따라 세 가지 범주로 그룹화 할 수 있습니다.
순도 – 최적의 일차 세포 배양을 얻으려면 연구자는 특히 해부 시간을 최소화하기 위해 자신감 있고 훈련을 받았으며 신속하게 작업할 수 있어야 합니다. 피라미드 뉴런이 주요 세포 유형이라 할지라도, 해마는 다양한 인터뉴런(interneurons)을 함유한다(14). 최소한의 신경교 세포로 배양을 생성하려면 최소한의 주변 조직으로 해마를 추출해야 합니다. 해부 중에 검은 색 배경을 사용하면 실체 현미경으로 해마의 한계를 식별하는 데 도움이됩니다. 또한, 낮은 세포 밀도는 더 적은 파라크린 지지를 초래하고 배양(13)을 유지하는 것을 더 어렵게 만든다는 것을 고려해야 한다. 따라서이 균형을 명심하는 것이 중요합니다. 이것은 적은 수의 세포 (3.5cm 접시 당 50,000 개의 뉴런)를 사용하는 영상 연구에서 중요합니다. 해마 추출을 위한 추가적인 시간을 가질 수 있으려면, 조직을 보존하는 동면 매체가17 사용되어야 한다. 적절한 수술 도구로 작업하는 것도 필수적입니다. 고정밀 공구는 섬세하므로 신중하게 보호하여 기술의 재현성을 보장해야합니다.
균질성 – 세포 응집체가 없는 배양을 개발하기 위해 사전 당겨진 유리 피펫과 표준 1,000μL 피펫을 결합하여 기계적 세포 해리가 업그레이드되었습니다.
생존성 – 이 프로토콜에서, 항생제는 뉴런 흥분성에 영향을 미치고 배양된 뉴런의 전기생리학적 특성을 변경하기 때문에 첨가되지 않았다18. 따라서 최고 수준의 무균 상태가 유지되지 않으면 오염 가능성이 매우 높습니다. 온도도 핵심 요소입니다. 해마 격리 중에 조직을 차갑게 유지하면 신진 대사가 느려지고 세포 분해가 감소합니다. 따라서 조직은 세포 해리 과정까지 얼음 위에 보관되었습니다. 또한, 효소 세포 해리 중에 현저한 세포 용해 없이 세포를 분해하는 올바른 균형을 찾는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서, 트립신을 사용한 배양 타이밍 및 후속 세척 단계는 적절한 뉴런 네트워크를 생성 할 수있는 충분한 공간을 가진 개별 세포를 얻기 위해 최적화되었습니다.
중요한 단계는 신경 세포 배양의 형광 라이브 면역 염색 및 칼슘 활성 기록에서도 발견됩니다. 환자 샘플에서 세포 표면 단백질에 대한 항체의 존재를 결정하기 위한 성공적인 라이브 면역염색을 수행하려면 항체가 세포내 단백질에 접근할 수 있도록 하는 세포의 투과화를 피해야 합니다. 또한 항체의 역가에 따라 배양 시간과 샘플 희석을 적절하게 조정해야 합니다(예: 매우 높은 역가 항체는 결과를 해석하기 어렵게 만드는 배경 염색을 제공할 수 있음). 칼슘 영상으로 자가항체의 병원성 평가를 수행할 때는 세포 활성 측정에 최적화된 배지를 사용해야 합니다(예: 배양 배지에서Mg2+ 억제가 우수한 성능을 위해 중요함). 또한 형광 이미징의 경우 페놀 레드와 같은 pH 표시기가 있는 매체는 비특이적 배경 신호를 도입하므로 피해야 합니다.
해마 신경 세포의 사용에는 두 가지 주요 한계가 있습니다. 첫째, 안정한 세포주와 비교하여 1 차 배양은 지속적으로 생성되어야하며 이는 실험실 동물을 정기적으로 사용하는 것을 의미합니다. 유도만능줄기세포(iPSC) 계통은 동물 모델 사용의 필요성을 대체할 수 있지만 iPSC의 분화 프로토콜은 여전히 최적이 아닙니다. 둘째, iPSC로부터 유도된 뉴런은 표면 단백질의 전체 스펙트럼을 발현하지 않으므로, 사용되는 경우, 반응성의 부재가 반드시 샘플(19)의 음성성을 의미하지는 않는다.
AE가 의심되는 환자의 혈청 또는 CSF에서 자가항체의 존재를 스크리닝하는 세 가지 방법이 있습니다: 쥐 뇌 조직을 사용하는 조직 기반 분석(TBA), 신경 단백질을 발현하도록 형질감염된 HEK 세포를 사용하는 세포 기반 분석(CBA), 및 해마 뉴런의 라이브 배양을 사용하여 여기에 보고된 응용 프로그램19. 배양 된 해마 뉴런 방법의 중요성은 TBA로 쉽게 구별 할 수없는 표면 및 세포 내 항원과의 반응성을 구별하는 능력에 있습니다. 게다가, HEK 형질감염된 세포의 CBA와 달리 1차 뉴런 배양은 형질감염된 단백질의 레퍼토리에 의해 제한되지 않습니다. 또한 배양된 해마 뉴런을 사용하여 면역침전 및 질량분석법과 결합할 때 새로운 항체 및 표적 항원을 식별할 수 있으므로 식별 가능한 항체의 스펙트럼을 확장할 수 있습니다. 마지막으로, 세포 활동의 변화를 모니터링할 수 있는 라이브 이미징 방법으로 자가항체의 병원성 효과를 평가할 수 있습니다. 결론적으로, 새로운 자가항체의 동정은 결국 환자 결과를 개선하기 위한 특정 면역요법의 개시를 가능하게 한다.
The authors have nothing to disclose.
메르슈 리바스, 마리아 마르살, 구스타보 카스트로, 조르디 코르테스, 알리나 히르슈만, 앙헬 산도발(ICFO-Institut de Ciències Fotòniques)과 메르세데스 알바, 마리야 라도세비치, 다비드 소토, 자비에르 가술, 마르 구아스프, 리디아 사바터(IDIBAPS, 바르셀로나 대학교 클리닉 병원)와 기술 지원 및 시약 제공에 대해 Josep Dalmau와 Myrna R. Rosenfeld(IDIBAPS, 바르셀로나 대학교 Clínic 병원)에 대한 비판적 검토와 멘토링. 이 연구는 Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)가 자금을 지원하고 유럽 연합, FIS (PI20 / 00280, JP), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad – R & D 우수 센터를위한 Severo Ochoa 프로그램 (CEX2019-000910-S, P.L-A.); CERCA 프로그램 및 레이저 랩 유럽 (871124, PLA); Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); 및 폰도 소셜 유럽 (PRE2020-095721, M.C.).
10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Beaker 100 mL | Pirex | – | |
Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Curved forceps | FST | 11009-13 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | – | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
Forceps | FST | 11000-12 | |
Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | – | |
Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | – | |
ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
Microscope cell chamber | Custom-build | – | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
NBQX | Tocris | 373 | |
Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | – | |
Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
Polystyrene ice tray | – | – | re-used cap of a polysterene box |
Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
Scissors | FST | 14068-12 | |
Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |