Autoimmun encefalitt er en ny kategori av antistoffmedierte sykdommer i sentralnervesystemet. Hippocampale nevroner kan brukes til å oppdage og karakterisere disse antistoffene. Denne artikkelen gir en protokoll for primær cellekultur og immunostaining for å bestemme autoantistoffer i serum og cerebrospinalvæske hos pasienter.
I løpet av de siste 15 årene har en ny kategori antistoffmedierte sykdommer i sentralnervesystemet (CNS) blitt karakterisert og er nå definert som “autoimmun encefalitt” (AE). Det er for tiden 17 kjente AE-syndromer, og alle er assosiert med antistoffer mot nevroncelleoverflaten eller synaptiske proteiner. De kliniske syndromene er komplekse og varierer i henhold til typen assosiert antistoff. Den mest kjente av disse sykdommene er anti-N-metyl D-aspartatreseptor (NMDAR) encefalitt, som er en fremtredende nevropsykiatrisk lidelse forbundet med alvorlig hukommelse og atferdssvikt. De tilknyttede antistoffene reagerer med GluN1-underenheten til NMDAR på N-terminaldomenet. Tilnærmingen som oftest brukes til oppdagelse og karakterisering av AE-antistoffer inkluderer kulturen av dissosierte, føtale, gnager hippocampale nevroner. Under prosessen med antistoffkarakterisering blir levende nevroner i kultur utsatt for pasientens serum eller CSF, og deteksjon av reaktivitet indikerer at serum- eller CSF-prøver av pasienten inneholder antistoffer mot nevronale overflateantigener. Hippocampale kulturer kan også brukes til å avgjøre om antistoffene hos pasienter er potensielt patogene ved å undersøke om de forårsaker strukturelle eller funksjonelle endringer i nevronene. Nivået på suksess for disse studiene avhenger av kvaliteten på kulturene og på protokollene som brukes til å oppnå og oppdage reaktiviteten til pasientprøver. Denne artikkelen gir en optimalisert protokoll for primær cellekultur av føtal rotte hippocampal nevroner kombinert med immunostaining for å bestemme tilstedeværelsen av antistoffer i serum eller CSF hos pasienter. Et eksempel på hvordan man undersøker potensielle patogene effekter av NMDAR-antistoffer ved bruk av dyrkede nevroner og kalsiumavbildning presenteres også.
Autoimmun encefalitt (AE) er en nylig oppdaget kategori av sykdommer i sentralnervesystemet (CNS) mediert av antistoffer som retter seg mot nevronoverflate eller synaptiske proteiner 1,2. De kliniske egenskapene varierer i henhold til antistoffet, men inkluderer vanligvis nedsatt hukommelse og kognisjon, endret oppførsel og psykiatriske symptomer, unormale bevegelser, søvndysfunksjon, nedsatt bevissthetsnivå og anfall. Disse forstyrrelsene kan påvirke personer i alle aldre, med noen typer AE som hovedsakelig påvirker barn og unge voksne2.
De siste 15 årene er det beskrevet 17 AE-syndromer med antistoffer mot spesifikke nevronale overflate-/synaptiske proteiner (tab 1). Noen få eksempler på nevronmålene inkluderer de synaptiske eksitatoriske reseptorene NMDAR3,4 og AMPAR5, den synaptiske hemmende reseptoren GABAbR6, det nevronutskilte proteinet LGI17 og celleadhesjonsmolekylet IgLON58. For de fleste av disse bivirkningene har studier vist at antistoffene forstyrrer strukturen eller funksjonen til målantigenet, og støtter sterkt en patogen rolle. For eksempel, i anti-NMDAR-encefalitt, reagerer antistoffene med det N-terminale domenet til GluN1-underenheten til NMDAR, og produserer en selektiv og reversibel internalisering av disse reseptorene som resulterer i fremtredende nevropsykiatriske endringer 4,9,10,11. Dermed kan identifiseringen av noen av de 17 kjente antistoffene i serum eller CSF hos en pasient også brukes som en diagnostisk test som fastslår diagnosen av en bestemt AE.
En av teknikkene som oftest brukes til identifisering og karakterisering av disse antistoffene, inkluderer bruk av kulturer av dissosierte, føtale, gnager hippocampale nevroner. Disse kulturene er nyttige av flere grunner: embryonal hjerne er lett å dissosiere og inneholder et lavt nivå av gliaceller, den viktigste forurensningskilden i nevronkulturer12; cellepopulasjonen i hippocampus er relativt homogen sammenlignet med de fleste andre regioner i CNS, med pyramideceller som representerer det store flertallet13,14; kulturer fremstilles fra embryoer i sen fase når genereringen av pyramidale nevroner er fullført, men granulatceller ennå ikke har utviklet seg, noe som ytterligere legger til homogeniteten av kulturen; når dyrkede, pyramidale nevroner uttrykker de fleste av deres viktigste fenotypiske egenskaper, er i stand til å danne velutviklede dendritter og etablere synaptisk tilkoblede nettverk som kan brukes til strukturelle og elektrofysiologiske undersøkelser12,13; da antistoffer ikke kan trenge inn i levende nevroner, tillater bruk av levende kulturer identifisering av antigene mål som ligger på celleoverflaten; og immunoprecipitation av antistoff-antigenkomplekset fra nevronkulturer tillater identifisering av målantigenet5.
Suksessen til studier som bruker nevronkulturer er svært avhengig av kvaliteten på kulturene og protokollene som brukes til å vurdere immunreaktiviteten til pasientens serum eller cerebrospinalvæske (CSF). Variabler som kan påvirke kulturene inkluderer prosedyrene for isolering av hippocampus før kulturutvikling, dissosiasjon av vevet, pletteringstettheten, vekstoverflaten som brukes og sammensetningen av media13,15,16. Denne artikkelen gir en optimalisert protokoll for primærcellekultur av føtale rotte hippocampale nevroner kombinert med fluorescerende immunostaining som kan brukes til å bestemme tilstedeværelsen av antistoffer mot kjente AE-antigener og potensielt nye overflatemål. Det gir også et eksempel på hvordan man undersøker de patogene effektene av NMDAR-antistoffer ved levende celleavbildningsteknikker ved bruk av dyrkede hippocampale nevroner som uttrykker en genetisk kodet kalsiumindikator (GECI) fra GCaMP-familien, GCaMP5G.
Mål protein | Protein funksjon | Celle rom | Hovedsyndrom |
NMDAR | Ion Chanel | Synaptisk protein | Anti-NMDAR encefalitt |
AMPAR | Ion Chanel | Synaptisk protein | Limbisk encefalitt |
GluK2 | Ion Chanel | Synaptisk protein | Hjernebetennelse |
GABAaR | Ion Chanel | Synaptisk protein | Hjernebetennelse |
GABAbR | Metabotrope reseptor | Synaptisk protein | Limbisk encefalitt |
mGluR1 | Metabotrope reseptor | Synaptisk protein | Hjernebetennelse |
mGluR2 | Metabotrope reseptor | Synaptisk protein | Hjernebetennelse |
mGluR5 | Metabotrope reseptor | Synaptisk protein | Hjernebetennelse |
D2R | Metabotrope reseptor | Synaptisk protein | Basal ganglia encefalitt |
LGI1 | Adhesjonsmolekyl | Protein på celleoverflaten | Limbisk encefalitt |
CASPR2 | Adhesjonsmolekyl | Protein på celleoverflaten | Limbisk encefalitt |
IgLON5 | Adhesjonsmolekyl | Protein på celleoverflaten | Anti-IgLON5 sykdom |
Nevreksin-3α | Adhesjonsmolekyl | Protein på celleoverflaten | Hjernebetennelse |
DNER (Tr) | Transmembran protein | Protein på celleoverflaten | Hjernebetennelse |
SEZ6L | Transmembran protein | Protein på celleoverflaten | Hjernebetennelse |
Amfifysin | Strukturelt molekyl | Protein på celleoverflaten | Limbisk encefalitt |
DPPX | Peptidase | Protein på celleoverflaten | Hjernebetennelse |
Tabell 1: Antistoffer mot nevroncelleoverflaten og synaptiske proteiner.
Det voksende feltet av antistoffmediert autoimmunitet har åpnet et mulighetsvindu for identifisering av neuronale autoantistoffer som kan brukes til å forbedre diagnosen og behandlingen av pasienter. Kulturer av hippocampale nevroner er et viktig verktøy for antistoffidentifikasjon; Derfor er det viktig å utføre en standardisert protokoll for å oppnå pålitelige og reproduserbare resultater. De viktigste trinnene å vurdere, begrensninger og feilsøking, diskuteres her.
De kritiske trinnene i denne protokollen kan grupperes i tre kategorier avhengig av om de påvirker renheten, homogeniteten eller levedyktigheten til hippocampale nevroner.
Renhet – For å oppnå optimale primære cellekulturer, må etterforskeren være trygg, trent og i stand til å jobbe raskt, spesielt for å minimere disseksjonens tid. Selv om pyramidale nevroner er den viktigste celletypen, inneholder hippocampus en rekke interneuroner14. For å generere kulturer med minimale gliaceller, må hippocampus ekstraheres med minimalt omkringliggende vev. Bruken av en svart bakgrunn under disseksjonen bidrar til å identifisere grensene for hippocampus under stereomikroskopet. I tillegg bør det tas hensyn til at lavere celletettheter resulterer i mindre parakrin støtte og gjør det vanskeligere å opprettholde kulturen13. Så det er viktig å holde denne balansen i bakhodet. Dette er viktig i bildestudier som bruker et lavt antall celler (50 000 nevroner per 3,5 cm tallerken). For å kunne ha ekstra tid til hippocampusekstraksjonen, bør dvalemodus som bevarer vevet brukes17. Arbeid med tilstrekkelige kirurgiske verktøy er også viktig. Verktøy med høy presisjon er delikate, så reproduserbarheten av teknikken bør sikres ved å beskytte dem nøye.
Homogenitet – For å utvikle en kultur uten celleaggregater, har den mekaniske celledissosiasjonen blitt oppgradert ved å kombinere bruken av en forhåndstrukket glasspipetter med en standard pipette på 1000 μL.
levedyktighet – I denne protokollen ble det ikke tilsatt antibiotika fordi de påvirker nevronal spenning og endrer de elektrofysiologiske egenskapene til de dyrkede nevronene18. Derfor er forurensning svært sannsynlig hvis de høyeste standardene for sterilitet ikke opprettholdes. Temperatur er også en nøkkelfaktor. Å holde vevet kaldt under hippocampusisolasjonen reduserer stoffskiftet og reduserer celleforringelse. Vevet ble derfor holdt på is til celledissosiasjonsprosessen. Videre er det avgjørende å finne den riktige balansen under enzymatisk celledissosiasjon som disaggregerer cellene uten merket cellelyse. I denne protokollen er tidspunktet for inkubasjon med trypsin og de påfølgende vasketrinnene optimalisert for å oppnå individuelle celler med nok plass til å tillate opprettelsen av et passende nevronnettverk.
Kritiske trinn finnes også i fluorescerende levende immunostaining og kalsiumaktivitetsopptak fra nevronkulturene. For å utføre vellykket levende immunostaining for å bestemme tilstedeværelsen av antistoffer mot celleoverflateproteiner i pasientprøver, må man unngå permeabilisering av cellene som vil gi antistoffene tilgang til intracellulære proteiner. I tillegg, basert på titeren av antistoffene, må inkubasjonstiden og prøvefortynningen justeres tilsvarende (f.eks. kan svært høye titerantistoffer gi bakgrunnsfarging som gjør det vanskelig å tolke resultatene). Når man utfører patogenitetsvurderingen av autoantistoffene med kalsiumavbildning, må man bruke et medium som er optimalt for cellulære aktivitetsmålinger (f.eks. Mg2+ -undertrykkelse i kulturmediet er viktig for god ytelse). Videre, for fluorescensavbildning, bør medier med pH-indikatorer som fenolrødt unngås, da det introduserer et ikke-spesifikt bakgrunnssignal.
Det er to hovedbegrensninger ved bruk av hippocampale nevronkulturer. For det første, sammenlignet med stabile cellelinjer, må primærkulturer kontinuerlig genereres, og dette innebærer regelmessig bruk av forsøksdyr. Induserte pluripotente stamcellelinjer (iPSC) kan erstatte behovet for å bruke dyremodeller, men differensieringsprotokollene for iPSC er fortsatt ikke optimale. For det andre uttrykker nevroner avledet fra iPSC ikke hele spektra av overflateproteiner, og derfor, hvis det brukes, betyr ikke fraværet av reaktivitet nødvendigvis negativiteten til prøven19.
Det er tre metoder for å skjerme for tilstedeværelse av autoantistoffer i serum eller CSF hos pasienter mistenkt for å ha AE: vevsbasert analyse (TBA) ved bruk av rottehjernevev, cellebasert analyse (CBA) ved bruk av HEK-celler transfisert for å uttrykke nevronproteiner, og applikasjonen rapportert her ved bruk av levende kulturer av hippocampale nevroner19. Betydningen av den dyrkede hippocampale nevronmetoden ligger i dens evne til å differensiere reaktivitet med overflate- og intracellulære antigener som ikke lett kan skilles ved TBA. Dessuten er primære nevronkulturer, i motsetning til CBA i HEK-transfiserte celler, ikke begrenset av repertoaret av transfiserte proteiner. I tillegg kan dyrkede hippocampale nevroner brukes til å identifisere nye antistoffer og deres målantigener når de kombineres med immunoprecipitation og massespektrometri og derfor utvide spekteret av identifiserbare antistoffer. Til slutt tillater det vurdering av de patogene effektene av autoantistoffene ved hjelp av levende bildebehandlingsmetoder som kan overvåke endringer i cellulær aktivitet. Avslutningsvis gjør identifiseringen av nye autoantistoffer det mulig å starte spesifikke immunterapier for å forbedre pasientresultatene.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Merche Rivas, Maria Marsal, Gustavo Castro, Jordi Cortés, Alina Hirschmann og Angel Sandoval (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) og Mercedes Alba, Marija Radosevic, David Soto, Xavier Gasull, Mar Guasp og Lidia Sabater (IDIBAPS, Hospital Clínic, University of Barcelona) for deres tekniske støtte og for å gi reagenser, og Josep Dalmau og Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Hospital Clínic, Universitetet i Barcelona) for deres kritiske gjennomgang av manuskriptet og mentorskapet. Denne studien ble finansiert av Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) og delfinansiert av EU, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad – Severo Ochoa program for sentre for fremragende forskning i FoU (CEX2019-000910-S, P.L-A.); CERCA-programmet og Laserlab-Europe (871124, P.L-A.); Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); og Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, MC).
10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Beaker 100 mL | Pirex | – | |
Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Curved forceps | FST | 11009-13 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | – | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
Forceps | FST | 11000-12 | |
Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | – | |
Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | – | |
ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
Microscope cell chamber | Custom-build | – | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
NBQX | Tocris | 373 | |
Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | – | |
Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
Polystyrene ice tray | – | – | re-used cap of a polysterene box |
Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
Scissors | FST | 14068-12 | |
Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |