التهاب الدماغ المناعي الذاتي هو فئة جديدة من الأمراض التي تتوسطها الأجسام المضادة في الجهاز العصبي المركزي. يمكن استخدام الخلايا العصبية الحصين لاكتشاف وتوصيف هذه الأجسام المضادة. توفر هذه المقالة بروتوكولا لزراعة الخلايا الأولية والتلطيخ المناعي لتحديد الأجسام المضادة الذاتية في المصل والسائل الدماغي الشوكي للمرضى.
على مدى السنوات ال 15 الماضية ، تم تمييز فئة جديدة من الأمراض التي تتوسط الأجسام المضادة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ويتم تعريفها الآن باسم “التهاب الدماغ المناعي الذاتي” (AE). يوجد حاليا 17 متلازمات AE معروفة ، وكلها مرتبطة بالأجسام المضادة ضد سطح الخلية العصبية أو البروتينات المتشابكة. المتلازمات السريرية معقدة وتختلف وفقا لنوع الأجسام المضادة المرتبطة بها. ومن أشهر هذه الأمراض التهاب الدماغ المضاد لمستقبلات الأسبارتات D-methyl D-aspartate (NMDAR) ، وهو اضطراب عصبي بارز مرتبط بضعف شديد في الذاكرة والسلوك. تتفاعل الأجسام المضادة المرتبطة بها مع الوحدة الفرعية GluN1 من NMDAR في المجال الطرفي N. النهج الأكثر استخداما لاكتشاف وتوصيف الأجسام المضادة AE يشمل ثقافة الخلايا العصبية الحصين المنفصلة والجنينية والقوارض. أثناء عملية توصيف الأجسام المضادة ، تتعرض الخلايا العصبية الحية في الثقافة لمصل المرضى أو السائل الدماغي الشوكي ، ويشير اكتشاف التفاعل إلى أن عينات المصل أو السائل الدماغي الشوكي للمريض تحتوي على أجسام مضادة ضد مستضدات السطح العصبي. يمكن أيضا استخدام ثقافات الحصين لتحديد ما إذا كانت الأجسام المضادة لدى المرضى يحتمل أن تكون مسببة للأمراض من خلال فحص ما إذا كانت تسبب تغيرات هيكلية أو وظيفية في الخلايا العصبية. يعتمد مستوى نجاح هذه الدراسات على جودة الثقافات وعلى البروتوكولات المستخدمة للحصول على تفاعل عينات المرضى واكتشافه. توفر هذه المقالة بروتوكولا محسنا لزراعة الخلايا الأولية للخلايا العصبية الحصين الفئران الجنينية جنبا إلى جنب مع تلطيخ المناعة لتحديد وجود الأجسام المضادة في المصل أو السائل الدماغي الشوكي للمرضى. كما يتم تقديم مثال على كيفية فحص الآثار المسببة للأمراض المحتملة للأجسام المضادة NMDAR باستخدام الخلايا العصبية المستزرعة وتصوير الكالسيوم.
التهاب الدماغ المناعي الذاتي (AE) هو فئة تم اكتشافها مؤخرا من أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS) بوساطة الأجسام المضادة التي تستهدف سطح الخلايا العصبية أو البروتينات المشبكية 1,2. تختلف السمات السريرية وفقا للجسم المضاد ولكنها تشمل عادة ضعف الذاكرة والإدراك ، والسلوك المتغير والأعراض النفسية ، والحركات غير الطبيعية ، وضعف النوم ، وانخفاض مستوى الوعي ، والنوبات. يمكن أن تؤثر هذه الاضطرابات على الأفراد من جميع الأعمار ، مع بعض أنواع AE التي تؤثر في الغالب على الأطفال والشباب2.
على مدى السنوات ال 15 الماضية ، تم وصف 17 متلازمات AE مع أجسام مضادة ضد بروتينات محددة على السطح العصبي / المتشابك (الجدول 1). بعض الأمثلة على الأهداف العصبية تشمل المستقبلات المثيرة المشبكية NMDAR 3,4 و AMPAR5 ، والمستقبل المثبط المشبكي GABAbR6 ، والبروتين المفرز العصبي LGI17 ، وجزيء التصاق الخلية IgLON58. بالنسبة لمعظم هذه AE ، أظهرت الدراسات أن الأجسام المضادة تعطل بنية أو وظيفة المستضد المستهدف ، مما يدعم بقوة دورا مسببا للأمراض. على سبيل المثال ، في التهاب الدماغ المضاد ل NMDAR ، تتفاعل الأجسام المضادة مع المجال الطرفي N للوحدة الفرعية GluN1 في NMDAR ، مما ينتج عنه استيعاب انتقائي وعكسي لهذه المستقبلات ينتج عنه تغييرات عصبية نفسية بارزة 4,9,10,11. وبالتالي ، يمكن أيضا استخدام تحديد أي من الأجسام المضادة المعروفة ال 17 في المصل أو السائل الدماغي الشوكي للمريض كاختبار تشخيصي يحدد تشخيص AE معين.
واحدة من التقنيات المستخدمة بشكل متكرر لتحديد وتوصيف هذه الأجسام المضادة تشمل استخدام ثقافات الخلايا العصبية الحصين المنفصلة والجنينية والقوارض. هذه الثقافات مفيدة لعدة أسباب: الدماغ الجنيني سهل الانفصال ويحتوي على مستوى منخفض من الخلايا الدبقية ، المصدر الرئيسي للتلوث في الثقافات العصبية12 ؛ عدد خلايا الحصين متجانس نسبيا مقارنة بمعظم المناطق الأخرى في الجهاز العصبي المركزي ، حيث تمثل الخلايا الهرمية الغالبية العظمى13,14 ؛ يتم تحضير الثقافات من الأجنة في المراحل المتأخرة عندما يكتمل توليد الخلايا العصبية الهرمية ولكن الخلايا الحبيبية لم تتطور بعد ، مما يزيد من تجانس الثقافة ؛ عندما تعبر الخلايا العصبية الهرمية المستزرعة عن معظم ميزاتها الظاهرية الرئيسية ، وتكون قادرة على تشكيل تشعبات متطورة ، وإنشاء شبكات متصلة بشكل متشابك يمكن استخدامها في التحقيقات الهيكلية والكهروفسيولوجية12,13 ؛ نظرا لأن الأجسام المضادة لا يمكنها اختراق الخلايا العصبية الحية ، فإن استخدام الثقافات الحية يسمح بتحديد الأهداف المستضدية الموجودة على سطح الخلية ؛ ويسمح الترسيب المناعي لمركب مستضد الأجسام المضادة من الثقافات العصبية بتحديد المستضد المستهدف5.
يعتمد نجاح الدراسات التي تستخدم الثقافات العصبية بشكل كبير على جودة الثقافات والبروتوكولات المستخدمة لتقييم التفاعل المناعي لمصل المريض أو السائل الدماغي الشوكي (CSF). تشمل المتغيرات التي يمكن أن تؤثر على الثقافات إجراءات عزل الحصين قبل تطور الثقافة ، وتفكك الأنسجة ، وكثافة الطلاء ، وسطح النمو المستخدم ، وتكوين الوسائط 13،15،16. توفر هذه المقالة بروتوكولا محسنا لزراعة الخلايا الأولية للخلايا العصبية الحصين الفئران الجنينية جنبا إلى جنب مع تلطيخ المناعة الفلورسنت الذي يمكن استخدامه لتحديد وجود الأجسام المضادة ضد مستضدات AE المعروفة والأهداف السطحية الجديدة المحتملة. كما يقدم مثالا على كيفية فحص الآثار المسببة للأمراض للأجسام المضادة NMDAR بواسطة تقنيات تصوير الخلايا الحية باستخدام الخلايا العصبية الحصينية المستزرعة التي تعبر عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا (GECI) من عائلة GCaMP ، GCaMP5G.
البروتين المستهدف | وظيفة البروتين | حجرة الخلية | المتلازمة الرئيسية |
نمدار | أيون شانيل | البروتين المشبكي | التهاب الدماغ المضاد ل NMDAR |
أمبار | أيون شانيل | البروتين المشبكي | التهاب الدماغ الحوفي |
غلوك2 | أيون شانيل | البروتين المشبكي | التهاب الدماغ |
GABAaR | أيون شانيل | البروتين المشبكي | التهاب الدماغ |
GABAbR | مستقبلات التمثيل الغذائي | البروتين المشبكي | التهاب الدماغ الحوفي |
mGluR1 | مستقبلات التمثيل الغذائي | البروتين المشبكي | التهاب الدماغ |
mGluR2 | مستقبلات التمثيل الغذائي | البروتين المشبكي | التهاب الدماغ |
إم غلور5 | مستقبلات التمثيل الغذائي | البروتين المشبكي | التهاب الدماغ |
D2R | مستقبلات التمثيل الغذائي | البروتين المشبكي | التهاب الدماغ العقد القاعدية |
إل جي آي1 | جزيء الالتصاق | بروتين سطح الخلية | التهاب الدماغ الحوفي |
كاسبر2 | جزيء الالتصاق | بروتين سطح الخلية | التهاب الدماغ الحوفي |
إيغلون5 | جزيء الالتصاق | بروتين سطح الخلية | مكافحة مرض IgLON5 |
نيوريكسين-3α | جزيء الالتصاق | بروتين سطح الخلية | التهاب الدماغ |
DNER (Tr) | البروتين عبر الغشاء | بروتين سطح الخلية | التهاب الدماغ |
SEZ6L | البروتين عبر الغشاء | بروتين سطح الخلية | التهاب الدماغ |
الأمفيفيسين | جزيء هيكلي | بروتين سطح الخلية | التهاب الدماغ الحوفي |
DPPX | الببتيداز | بروتين سطح الخلية | التهاب الدماغ |
الجدول 1: الأجسام المضادة لسطح الخلية العصبية والبروتينات المتشابكة.
لقد فتح المجال المتنامي للمناعة الذاتية بوساطة الأجسام المضادة نافذة من الفرص لتحديد الأجسام المضادة الذاتية العصبية التي يمكن استخدامها لتحسين تشخيص المرضى وعلاجهم. ثقافات الخلايا العصبية الحصين هي أداة أساسية لتحديد الأجسام المضادة. لذلك ، من المهم إجراء بروتوكول موحد للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. تتم مناقشة أهم الخطوات التي يجب مراعاتها والقيود واستكشاف الأخطاء وإصلاحها هنا.
يمكن تجميع الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول في ثلاث فئات اعتمادا على ما إذا كانت تؤثر على نقاء أو تجانس أو بقاء الخلايا العصبية الحصينية.
النقاء – للحصول على مزارع الخلايا الأولية المثلى ، يجب أن يكون المحقق واثقا ومدربا وقادرا على العمل بسرعة ، خاصة لتقليل وقت التشريح. حتى لو كانت الخلايا العصبية الهرمية هي نوع الخلايا الرئيسية ، فإن الحصين يحتوي على مجموعة متنوعة من الخلايا العصبية الداخلية14. لتوليد ثقافات ذات خلايا دبقية صغيرة ، يجب استخراج الحصين مع الحد الأدنى من الأنسجة المحيطة. يساعد استخدام خلفية سوداء أثناء التشريح على تحديد حدود الحصين تحت المجهر المجسم. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي أن يؤخذ في الاعتبار أن انخفاض كثافة الخلايا يؤدي إلى دعم أقل للباراكرين ويجعل من الصعب الحفاظ على الثقافة13. لذلك ، من المهم الحفاظ على هذا التوازن في الاعتبار. هذا مهم في دراسات التصوير التي تستخدم عددا منخفضا من الخلايا (50000 خلية عصبية لكل طبق 3.5 سم). لتكون قادرة على الحصول على وقت إضافي لاستخراج الحصين ، يجب استخدام وسائط السبات التي تحافظ على الأنسجة17. العمل مع الأدوات الجراحية الكافية ضروري أيضا. الأدوات عالية الدقة حساسة ، لذلك يجب ضمان قابلية تكرار التقنية من خلال حمايتها بعناية.
التجانس – لتطوير ثقافة بدون مجاميع الخلايا ، تمت ترقية تفكك الخلايا الميكانيكية من خلال الجمع بين استخدام ماصات زجاجية مسحوبة مسبقا مع ماصة قياسية سعة 1000 ميكرولتر.
الجدوى – في هذا البروتوكول ، لم تتم إضافة أي مضادات حيوية لأنها تؤثر على استثارة الخلايا العصبية وتغير الخصائص الكهروفسيولوجية للخلايا العصبية المستزرعة18. لذلك ، من المحتمل جدا حدوث تلوث إذا لم يتم الحفاظ على أعلى معايير العقم. درجة الحرارة هي أيضا عامل رئيسي. الحفاظ على الأنسجة باردة أثناء عزل الحصين يبطئ عملية التمثيل الغذائي ويقلل من تدهور الخلايا. لذلك ، تم الاحتفاظ بالأنسجة على الجليد حتى عملية تفكك الخلية. علاوة على ذلك ، من الأهمية بمكان إيجاد التوازن الصحيح أثناء تفكك الخلايا الأنزيمية التي تفكك الخلايا دون تحلل خلوي ملحوظ. في هذا البروتوكول ، تم تحسين توقيت الحضانة بالتريبسين وخطوات الغسيل اللاحقة للحصول على خلايا فردية ذات مساحة كافية للسماح بإنشاء شبكة عصبية مناسبة.
تم العثور على خطوات حاسمة أيضا في الفلورسنت المناعي الحي وتسجيلات نشاط الكالسيوم من الثقافات العصبية. لإجراء تلطيخ مناعي حي ناجح لتحديد وجود الأجسام المضادة لبروتينات سطح الخلية في عينات المرضى ، يجب على المرء تجنب اختراق الخلايا التي من شأنها أن تسمح للأجسام المضادة بالوصول إلى البروتينات داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، استنادا إلى عيار الأجسام المضادة ، يجب تعديل وقت الحضانة وتخفيف العينة وفقا لذلك (على سبيل المثال ، يمكن للأجسام المضادة ذات العيار العالي جدا أن تعطي تلطيخا في الخلفية يجعل تفسير النتائج صعبا). عند إجراء تقييم الإمراض للأجسام المضادة الذاتية باستخدام تصوير الكالسيوم ، يحتاج المرء إلى استخدام وسائط مثالية لقياسات النشاط الخلوي (على سبيل المثال ، قمع Mg2+ في وسط الثقافة مهم للأداء الجيد). علاوة على ذلك ، بالنسبة للتصوير الفلوري ، يجب تجنب الوسائط التي تحتوي على مؤشرات الأس الهيدروجيني مثل الفينول الأحمر لأنها تقدم إشارة خلفية غير محددة.
هناك نوعان من القيود الرئيسية لاستخدام الثقافات العصبية الحصين. أولا ، بالمقارنة مع خطوط الخلايا المستقرة ، يجب إنشاء الثقافات الأولية باستمرار ، وهذا يعني استخدام المختبر بانتظام. يمكن أن تحل خطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSC) محل الحاجة إلى استخدام النماذج الحيوانية ، لكن بروتوكولات التمايز الخاصة ب iPSC لا تزال غير مثالية. ثانيا ، لا تعبر الخلايا العصبية المشتقة من iPSC عن الأطياف الكاملة للبروتينات السطحية ، وبالتالي ، إذا تم استخدامها ، فإن عدم وجود تفاعل لا يعني بالضرورة سلبية العينة19.
هناك ثلاث طرق للكشف عن وجود الأجسام المضادة الذاتية في المصل أو السائل الدماغي الشوكي للمرضى المشتبه في إصابتهم ب AE: الفحص القائم على الأنسجة (TBA) باستخدام أنسجة دماغ الفئران ، والفحص القائم على الخلايا (CBA) باستخدام خلايا HEK المنقولة للتعبير عن البروتينات العصبية ، والتطبيق المذكور هنا باستخدام الثقافات الحية للخلايا العصبية الحصين19. تكمن أهمية طريقة الخلايا العصبية الحصينية المستزرعة في قدرتها على التمييز بين التفاعل مع المستضدات السطحية وداخل الخلايا التي لا يمكن تمييزها بسهولة بواسطة TBA. إلى جانب ذلك ، فإن الثقافات العصبية الأولية ، على عكس CBA في الخلايا المنقولة HEK ، لا تقتصر على ذخيرة البروتينات المنقولة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الخلايا العصبية الحصينية المستزرعة لتحديد الأجسام المضادة الجديدة ومستضداتها المستهدفة عند دمجها مع الترسيب المناعي وقياس الطيف الكتلي ، وبالتالي توسيع نطاق الأجسام المضادة التي يمكن تحديدها. وأخيرا ، فإنه يسمح بتقييم الآثار المسببة للأمراض للأجسام المضادة الذاتية عن طريق طرق التصوير الحية التي يمكنها مراقبة التغيرات في النشاط الخلوي. في الختام ، فإن تحديد الأجسام المضادة الذاتية الجديدة يمكن في النهاية من بدء علاجات مناعية محددة لتحسين نتائج المرضى.
The authors have nothing to disclose.
نشكر ميرشي ريفاس وماريا مارسال وغوستافو كاسترو وجوردي كورتيس وألينا هيرشمان وأنخيل ساندوفال (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) ومرسيدس ألبا وماريا رادوسيفيتش وديفيد سوتو وكزافييه غاسول ومار غواسب وليديا ساباتير (IDIBAPS، مستشفى كلينيك، جامعة برشلونة) على دعمهم الفني وعلى توفير الكواشف، وجوزيب دالماو وميرنا ر. روزنفيلد (IDIBAPS، مستشفى كلينيك ، جامعة برشلونة) لمراجعتهم النقدية للمخطوطة والإرشاد. وقد مول هذه الدراسة معهد كارلوس الثالث (ISCIII) وشارك في تمويلها الاتحاد الأوروبي، ومؤسسة (PI20/00280، J.P.)، ومؤسسة CELLEX (P.L-A.)؛ وزارة الاقتصاد والمنافسة – برنامج سيفيرو أوتشوا لمراكز التميز في البحث والتطوير (CEX2019-000910-S, P.L-A.)؛ برنامج CERCA و Laserlab-Europe (871124 ، P.L-A.) ؛ وزارة العلوم والابتكار (MCIN/AEI/10.13039/501100011033, P.L-A.)؛ وفوندو سوشال يوروبيو (PRE2020-095721, M.C.).
10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Beaker 100 mL | Pirex | – | |
Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Curved forceps | FST | 11009-13 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | – | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
Forceps | FST | 11000-12 | |
Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | – | |
Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | – | |
ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
Microscope cell chamber | Custom-build | – | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
NBQX | Tocris | 373 | |
Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | – | |
Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
Polystyrene ice tray | – | – | re-used cap of a polysterene box |
Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
Scissors | FST | 14068-12 | |
Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |