La encefalitis autoinmune es una nueva categoría de enfermedades mediadas por anticuerpos del sistema nervioso central. Las neuronas del hipocampo se pueden utilizar para descubrir y caracterizar estos anticuerpos. Este artículo proporciona un protocolo para el cultivo celular primario y la inmunotinción para determinar los autoanticuerpos en el suero y el líquido cefalorraquídeo de los pacientes.
En los últimos 15 años, se ha caracterizado una nueva categoría de enfermedades mediadas por anticuerpos del sistema nervioso central (SNC) y ahora se define como “encefalitis autoinmune” (EA). Actualmente hay 17 síndromes de EA conocidos, y todos están asociados con anticuerpos contra la superficie celular neuronal o proteínas sinápticas. Los síndromes clínicos son complejos y varían según el tipo de anticuerpo asociado. La más conocida de estas enfermedades es la encefalitis anti-N-metil D-aspartato (NMDAR), que es un trastorno neuropsiquiátrico prominente asociado con graves trastornos de memoria y comportamiento. Los anticuerpos asociados reaccionan con la subunidad GluN1 del NMDAR en el dominio N-terminal. El enfoque más utilizado para el descubrimiento y caracterización de anticuerpos EA incluye el cultivo de neuronas disociadas, fetales y roedores del hipocampo. Durante el proceso de caracterización de anticuerpos, las neuronas vivas en cultivo se exponen al suero o LCR de los pacientes, y la detección de reactividad indica que las muestras de suero o LCR del paciente contienen anticuerpos contra antígenos de superficie neuronal. Los cultivos del hipocampo también se pueden usar para determinar si los anticuerpos en pacientes son potencialmente patógenos examinando si causan alteraciones estructurales o funcionales de las neuronas. El nivel de éxito de estos estudios depende de la calidad de los cultivos y de los protocolos utilizados para obtener y detectar la reactividad de las muestras de pacientes. Este artículo proporciona un protocolo optimizado para el cultivo celular primario de neuronas del hipocampo de ratas fetales combinadas con inmunotinción para determinar la presencia de anticuerpos en el suero o LCR de los pacientes. También se presenta un ejemplo de cómo examinar los posibles efectos patogénicos de los anticuerpos NMDAR utilizando neuronas cultivadas e imágenes de calcio.
La encefalitis autoinmune (EA) es una categoría recientemente descubierta de enfermedades del sistema nervioso central (SNC) mediadas por anticuerpos que se dirigen a la superficie neuronal o proteínas sinápticas 1,2. Las características clínicas varían según el anticuerpo, pero comúnmente incluyen deterioro de la memoria y la cognición, alteración del comportamiento y síntomas psiquiátricos, movimientos anormales, disfunción del sueño, disminución del nivel de conciencia y convulsiones. Estos trastornos pueden afectar a individuos de todas las edades, con algunos tipos de EA que afectan predominantemente a niños y adultos jóvenes2.
En los últimos 15 años, se han descrito 17 síndromes de EA con anticuerpos contra proteínas sinápticas específicas de superficie neuronal (Tabla 1). Algunos ejemplos de las dianas neuronales incluyen los receptores excitatorios sinápticos NMDAR3,4 y AMPAR5, el receptor inhibidor sináptico GABAbR6, la proteína neuronal secretada LGI17 y la molécula de adhesión celular IgLON58. Para la mayoría de estos EA, los estudios han demostrado que los anticuerpos interrumpen la estructura o función de su antígeno diana, apoyando fuertemente un papel patogénico. Por ejemplo, en la encefalitis anti-NMDAR, los anticuerpos reaccionan con el dominio N-terminal de la subunidad GluN1 del NMDAR, produciendo una internalización selectiva y reversible de estos receptores que resulta en alteraciones neuropsiquiátricas prominentes 4,9,10,11. Así, la identificación de cualquiera de los 17 anticuerpos conocidos en el suero o LCR de un paciente también puede utilizarse como prueba diagnóstica que establece el diagnóstico de un EA específico.
Una de las técnicas más utilizadas para la identificación y caracterización de estos anticuerpos incluye el uso de cultivos de neuronas disociadas, fetales y roedores del hipocampo. Estos cultivos son útiles por varias razones: el cerebro embrionario es fácil de disociar y contiene un bajo nivel de células gliales, la principal fuente de contaminación en los cultivos neuronales12; la población celular del hipocampo es relativamente homogénea en comparación con la mayoría de las otras regiones del SNC, con células piramidales que representan la gran mayoría13,14; los cultivos se preparan a partir de embriones en etapa tardía cuando la generación de neuronas piramidales está completa pero las células granulares aún no se han desarrollado, lo que aumenta aún más la homogeneidad del cultivo; Cuando se cultivan, las neuronas piramidales expresan la mayoría de sus principales características fenotípicas, son capaces de formar dendritas bien desarrolladas y establecer redes sinápticamente conectadas que pueden ser utilizadas para investigaciones estructurales y electrofisiológicas12,13; Como los anticuerpos no pueden penetrar en las neuronas vivas, el uso de cultivos vivos permite la identificación de objetivos antigénicos que residen en la superficie celular; y la inmunoprecipitación del complejo anticuerpo-antígeno de cultivos neuronales permite la identificación del antígeno diana5.
El éxito de los estudios que utilizan cultivos neuronales depende en gran medida de la calidad de los cultivos y de los protocolos utilizados para evaluar la inmunorreactividad del suero o líquido cefalorraquídeo (LCR) de un paciente. Las variables que pueden afectar los cultivos incluyen los procedimientos de aislamiento del hipocampo antes del desarrollo del cultivo, la disociación del tejido, la densidad de placa, la superficie de crecimiento utilizada y la composición de los medios13,15,16. Este artículo proporciona un protocolo optimizado para el cultivo celular primario de neuronas del hipocampo de rata fetal combinadas con inmunotinción fluorescente que se puede utilizar para determinar la presencia de anticuerpos contra antígenos AE conocidos y objetivos de superficie potencialmente novedosos. También proporciona un ejemplo de cómo examinar los efectos patogénicos de los anticuerpos NMDAR mediante técnicas de imagen de células vivas utilizando neuronas cultivadas del hipocampo que expresan un indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) de la familia GCaMP, GCaMP5G.
Proteína diana | Función proteica | Compartimento celular | Síndrome de Main |
NMDAR (en inglés) | Ion Chanel | Proteína sináptica | Encefalitis anti-NMDAR |
AMPAR | Ion Chanel | Proteína sináptica | Encefalitis límbica |
GluK2 | Ion Chanel | Proteína sináptica | Encefalitis |
GABAaR | Ion Chanel | Proteína sináptica | Encefalitis |
GABAbR | Receptor metabotrópico | Proteína sináptica | Encefalitis límbica |
mGluR1 | Receptor metabotrópico | Proteína sináptica | Encefalitis |
mGluR2 | Receptor metabotrópico | Proteína sináptica | Encefalitis |
mGluR5 | Receptor metabotrópico | Proteína sináptica | Encefalitis |
D2R | Receptor metabotrópico | Proteína sináptica | Encefalitis de los ganglios basales |
LGI1 | Molécula de adhesión | Proteína de la superficie celular | Encefalitis límbica |
CASPR2 | Molécula de adhesión | Proteína de la superficie celular | Encefalitis límbica |
IgLON5 | Molécula de adhesión | Proteína de la superficie celular | Enfermedad anti-IgLON5 |
Neurexina-3α | Molécula de adhesión | Proteína de la superficie celular | Encefalitis |
DNER (Tr) | Proteína transmembrana | Proteína de la superficie celular | Encefalitis |
SEZ6L | Proteína transmembrana | Proteína de la superficie celular | Encefalitis |
Anfifisina | Molécula estructural | Proteína de la superficie celular | Encefalitis límbica |
DPPX | Peptidasa | Proteína de la superficie celular | Encefalitis |
Tabla 1: Anticuerpos contra la superficie celular neuronal y proteínas sinápticas.
El creciente campo de la autoinmunidad mediada por anticuerpos ha abierto una ventana de oportunidad para la identificación de autoanticuerpos neuronales que pueden utilizarse para mejorar el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes. Los cultivos de neuronas del hipocampo son una herramienta esencial para la identificación de anticuerpos; Por lo tanto, es importante realizar un protocolo estandarizado para obtener resultados confiables y reproducibles. Los pasos más importantes a considerar, las limitaciones y la solución de problemas se discuten aquí.
Los pasos críticos de este protocolo se pueden agrupar en tres categorías dependiendo de si afectan la pureza, la homogeneidad o la viabilidad de las neuronas del hipocampo.
Pureza: para obtener cultivos celulares primarios óptimos, el investigador debe tener confianza, capacitación y capacidad para trabajar rápidamente, especialmente para minimizar el tiempo de la disección. Incluso si las neuronas piramidales son el tipo celular principal, el hipocampo contiene una variedad de interneuronas14. Para generar cultivos con células gliales mínimas, el hipocampo debe extraerse con el mínimo tejido circundante. El uso de un fondo negro durante la disección ayuda a identificar los límites del hipocampo bajo el microscopio estereoscópico. Además, debe tenerse en cuenta que las densidades celulares más bajas resultan en un menor soporte paracrino y dificultan el mantenimiento del cultivo13. Por lo tanto, es importante tener en cuenta este equilibrio. Esto es importante en estudios de imagen que utilizan un número bajo de células (50.000 neuronas por plato de 3,5 cm). Para poder tener tiempo adicional para la extracción del hipocampo, se deben utilizar medios de hibernación que preserven el tejido17. Trabajar con herramientas quirúrgicas adecuadas también es esencial. Las herramientas de alta precisión son delicadas, por lo que la reproducibilidad de la técnica debe garantizarse protegiéndolas cuidadosamente.
Homogeneidad – Para desarrollar un cultivo sin agregados celulares, la disociación celular mecánica se ha mejorado combinando el uso de pipetas de vidrio pre-tiradas con una pipeta estándar de 1.000 μL.
Viabilidad – En este protocolo, no se agregaron antibióticos porque influyen en la excitabilidad neuronal y alteran las propiedades electrofisiológicas de las neuronas cultivadas18. Por lo tanto, la contaminación es muy probable si no se mantienen los más altos estándares de esterilidad. La temperatura también es un factor clave. Mantener el tejido frío durante el aislamiento del hipocampo ralentiza el metabolismo y disminuye la degradación celular. Por lo tanto, el tejido se mantuvo en hielo hasta el proceso de disociación celular. Además, es crucial encontrar el equilibrio correcto durante la disociación celular enzimática que desagrega las células sin una marcada lisis celular. En este protocolo, se han optimizado los tiempos de incubación con tripsina y los pasos de lavado posteriores para obtener células individuales con suficiente espacio para permitir la creación de una red neuronal adecuada.
También se encuentran pasos críticos en la inmunotinción fluorescente en vivo y en los registros de actividad de calcio de los cultivos neuronales. Para realizar con éxito la inmunotinción viva para determinar la presencia de anticuerpos contra las proteínas de la superficie celular en muestras de pacientes, se debe evitar la permeabilización de las células que permitirían el acceso de los anticuerpos a las proteínas intracelulares. Además, en función del título de los anticuerpos, el tiempo de incubación y la dilución de la muestra deben ajustarse en consecuencia (por ejemplo, los anticuerpos de título muy alto pueden dar una tinción de fondo que dificulta la interpretación de los resultados). Al llevar a cabo la evaluación de patogenicidad de los autoanticuerpos con imágenes de calcio, es necesario utilizar un medio que sea óptimo para las mediciones de la actividad celular (por ejemplo, la supresión de Mg2+ en el medio de cultivo es importante para un buen rendimiento). Además, para las imágenes de fluorescencia, se deben evitar los medios con indicadores de pH como el rojo fenol, ya que introducen una señal de fondo no específica.
Hay dos limitaciones principales del uso de cultivos neuronales del hipocampo. En primer lugar, en comparación con las líneas celulares estables, los cultivos primarios deben generarse continuamente, y esto implica el uso regular de animales de laboratorio. Las líneas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) podrían reemplazar la necesidad de usar modelos animales, pero los protocolos de diferenciación para iPSC aún no son óptimos. En segundo lugar, las neuronas derivadas de iPSC no expresan los espectros completos de las proteínas de superficie y, por lo tanto, si se utilizan, la ausencia de reactividad no implica necesariamente la negatividad de la muestra19.
Existen tres métodos para detectar la presencia de autoanticuerpos en el suero o LCR de pacientes sospechosos de tener EA: ensayo basado en tejidos (TBA) utilizando tejido cerebral de rata, ensayo basado en células (CBA) utilizando células HEK transfectadas para expresar proteínas neuronales, y la aplicación reportada aquí usando cultivos vivos de neuronas del hipocampo19. La importancia del método de la neurona del hipocampo cultivada radica en su capacidad para diferenciar la reactividad con antígenos de superficie e intracelulares que no pueden distinguirse fácilmente por TBA. Además, los cultivos neuronales primarios, a diferencia del CBA en las células transfectadas con HEK, no están limitados por el repertorio de proteínas transfectadas. Además, las neuronas cultivadas del hipocampo se pueden utilizar para identificar nuevos anticuerpos y sus antígenos diana cuando se combinan con inmunoprecipitación y espectrometría de masas y, por lo tanto, ampliar el espectro de anticuerpos identificables. Por último, permite la evaluación de los efectos patogénicos de los autoanticuerpos mediante métodos de imagen en vivo que pueden monitorizar alteraciones en la actividad celular. En conclusión, la identificación de nuevos autoanticuerpos eventualmente permite el inicio de inmunoterapias específicas para mejorar los resultados de los pacientes.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Merche Rivas, Maria Marsal, Gustavo Castro, Jordi Cortés, Alina Hirschmann y Angel Sandoval (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) y Mercedes Alba, Marija Radosevic, David Soto, Xavier Gasull, Mar Guasp y Lidia Sabater (IDIBAPS, Hospital Clínic, Universidad de Barcelona) por su apoyo técnico y por el suministro de reactivos, y Josep Dalmau y Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Hospital Clínic, Universidad de Barcelona) por su revisión crítica del manuscrito y tutoría. Este estudio ha sido financiado por el Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) y cofinanciado por la Unión Europea, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad – Programa Severo Ochoa para Centros de Excelencia en I&D (CEX2019-000910-S, P.L-A.); Programa CERCA y Laserlab-Europe (871124, P.L-A.); Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); y Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Beaker 100 mL | Pirex | – | |
Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Curved forceps | FST | 11009-13 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | – | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
Forceps | FST | 11000-12 | |
Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | – | |
Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | – | |
ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
Microscope cell chamber | Custom-build | – | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
NBQX | Tocris | 373 | |
Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | – | |
Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
Polystyrene ice tray | – | – | re-used cap of a polysterene box |
Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
Scissors | FST | 14068-12 | |
Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |