Autoimmun encefalit är en ny kategori av antikroppsmedierade sjukdomar i centrala nervsystemet. Hippocampusneuroner kan användas för att upptäcka och karakterisera dessa antikroppar. Denna artikel tillhandahåller ett protokoll för primär cellodling och immunfärgning för att bestämma autoantikroppar i serum och cerebrospinalvätska hos patienter.
Under de senaste 15 åren har en ny kategori av antikroppsmedierade sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS) karakteriserats och definieras nu som “autoimmun encefalit” (AE). Det finns för närvarande 17 kända AE-syndrom, och alla är associerade med antikroppar mot neuroncellytan eller synaptiska proteiner. De kliniska syndromen är komplexa och varierar beroende på typen av associerad antikropp. Den mest kända av dessa sjukdomar är anti-N-metyl D-aspartatreceptor (NMDAR) encefalit, som är en framträdande neuropsykiatrisk störning i samband med allvarliga minnes- och beteendestörningar. De associerade antikropparna reagerar med GluN1-underenheten i NMDAR vid den N-terminala domänen. Det tillvägagångssätt som oftast används för upptäckt och karakterisering av AE-antikroppar innefattar kulturen av dissocierade, foster-, gnagar-hippocampusneuroner. Under processen med antikroppskarakterisering utsätts levande neuroner i kulturen för patienternas serum eller CSF, och detekteringen av reaktivitet indikerar att patientens serum- eller CSF-prover innehåller antikroppar mot neuronala ytantigener. Hippocampuskulturer kan också användas för att avgöra om antikropparna hos patienter är potentiellt patogena genom att undersöka om de orsakar strukturella eller funktionella förändringar av neuronerna. Framgångsnivån för dessa studier beror på kulturernas kvalitet och på de protokoll som används för att erhålla och detektera reaktiviteten hos patientprover. Denna artikel ger ett optimerat protokoll för primär cellodling av fosterråtta hippocampusneuroner i kombination med immunfärgning för att bestämma närvaron av antikroppar i serum eller CSF hos patienter. Ett exempel på hur man kan undersöka de potentiella patogena effekterna av NMDAR-antikroppar med hjälp av odlade neuroner och kalciumavbildning presenteras också.
Autoimmun encefalit (AE) är en nyligen upptäckt kategori av sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS) medierade av antikroppar som riktar sig mot neuronala ytor eller synaptiska proteiner 1,2. De kliniska egenskaperna varierar beroende på antikroppen men inkluderar vanligtvis nedsatt minne och kognition, förändrat beteende och psykiatriska symtom, onormala rörelser, sömndysfunktion, minskad medvetenhetsnivå och anfall. Dessa störningar kan drabba individer i alla åldrar, med vissa typer av AE som främst drabbar barn och unga vuxna2.
Under de senaste 15 åren har 17 AE-syndrom med antikroppar mot specifika neuronala yt-/synaptiska proteiner beskrivits (tabell 1). Några exempel på de neuronala målen inkluderar de synaptiska excitatoriska receptorerna NMDAR3,4 och AMPAR5, den synaptiska hämmande receptorn GABAbR6, det neuronala utsöndrade proteinet LGI17 och celladhesionsmolekylen IgLON58. För de flesta av dessa AE har studier visat att antikropparna stör strukturen eller funktionen hos deras målantigen, vilket starkt stöder en patogen roll. Till exempel, i anti-NMDAR-encefalit, reagerar antikropparna med den N-terminala domänen för GluN1-underenheten i NMDAR, vilket ger en selektiv och reversibel internalisering av dessa receptorer som resulterar i framträdande neuropsykiatriska förändringar 4,9,10,11. Således kan identifieringen av någon av de 17 kända antikropparna i serumet eller CSF hos en patient också användas som ett diagnostiskt test som fastställer diagnosen av en specifik AE.
En av de tekniker som oftare används för identifiering och karakterisering av dessa antikroppar innefattar användning av kulturer av dissocierade, foster-, gnagare hippocampusneuroner. Dessa kulturer är användbara av flera skäl: embryonal hjärna är lätt att dissociera och innehåller en låg nivå av glialceller, den största källan till kontaminering i neuronala kulturer12; cellpopulationen i hippocampus är relativt homogen jämfört med de flesta andra regioner i CNS, med pyramidala celler som representerar den stora majoriteten13,14; kulturer framställs från embryon i sent stadium när genereringen av pyramidala neuroner är fullständig men granulatceller ännu inte har utvecklats, vilket ytterligare ökar kulturens homogenitet; när de odlas uttrycker pyramidala neuroner de flesta av sina huvudsakliga fenotypiska egenskaper, kan bilda välutvecklade dendriter och etablera synaptiskt anslutna nätverk som kan användas för strukturella och elektrofysiologiska undersökningar12,13; Eftersom antikroppar inte kan penetrera levande neuroner möjliggör användningen av levande kulturer identifiering av antigena mål som finns på cellytan; och immunoprecipitering av antikroppsantigenkomplexet från neuronala kulturer möjliggör identifiering av målantigenet5.
Framgången för studier med neuronala kulturer är mycket beroende av kvaliteten på kulturerna och de protokoll som används för att bedöma immunreaktiviteten hos en patients serum eller cerebrospinalvätska (CSF). Variabler som kan påverka kulturerna inkluderar förfarandena för isolering av hippocampus före odlingsutveckling, dissociation av vävnaden, pläteringstätheten, den använda tillväxtytan och mediets sammansättning13,15,16. Denna artikel ger ett optimerat protokoll för primär cellodling av fostrets hippocampusneuroner i kombination med fluorescerande immunfärgning som kan användas för att bestämma närvaron av antikroppar mot kända AE-antigener och potentiellt nya ytmål. Det ger också ett exempel på hur man undersöker de patogena effekterna av NMDAR-antikroppar genom levande cellavbildningstekniker med odlade hippocampusneuroner som uttrycker en genetiskt kodad kalciumindikator (GECI) från GCaMP-familjen, GCaMP5G.
Målprotein | Protein funktion | Cell fack | Huvud syndrom |
NMDAR | Jon Chanel | Synaptiskt protein | Anti-NMDAR encefalit |
AMPAR | Jon Chanel | Synaptiskt protein | Limbisk encefalit |
GluK2 | Jon Chanel | Synaptiskt protein | Hjärninflammation |
GABAaR | Jon Chanel | Synaptiskt protein | Hjärninflammation |
GABAbR | Metabotrop receptor | Synaptiskt protein | Limbisk encefalit |
mGluR1 | Metabotrop receptor | Synaptiskt protein | Hjärninflammation |
mGluR2 | Metabotrop receptor | Synaptiskt protein | Hjärninflammation |
mGluR5 | Metabotrop receptor | Synaptiskt protein | Hjärninflammation |
D2R | Metabotrop receptor | Synaptiskt protein | Basal ganglier encefalit |
LGI1 | Vidhäftningsmolekyl | Protein från cellytan | Limbisk encefalit |
CASPR2 | Vidhäftningsmolekyl | Protein från cellytan | Limbisk encefalit |
IgLON5 | Vidhäftningsmolekyl | Protein från cellytan | Anti-IgLON5 sjukdom |
Neurexin-3α | Vidhäftningsmolekyl | Protein från cellytan | Hjärninflammation |
DNER (Tr) | Transmembran protein | Protein från cellytan | Hjärninflammation |
SEZ6L | Transmembran protein | Protein från cellytan | Hjärninflammation |
Amfifysin | Strukturell molekyl | Protein från cellytan | Limbisk encefalit |
DPPX | Peptidas | Protein från cellytan | Hjärninflammation |
Tabell 1: Antikroppar mot neuroncellytan och synaptiska proteiner.
Det växande fältet av antikroppsmedierad autoimmunitet har öppnat ett fönster av möjligheter för identifiering av neuronala autoantikroppar som kan användas för att förbättra diagnos och behandling av patienter. Kulturer av hippocampusneuroner är ett viktigt verktyg för identifiering av antikroppar; Därför är det viktigt att utföra ett standardiserat protokoll för att få tillförlitliga och reproducerbara resultat. De viktigaste stegen att tänka på, begränsningar och felsökning diskuteras här.
De kritiska stegen i detta protokoll kan grupperas i tre kategorier beroende på om de påverkar renheten, homogeniteten eller livskraften hos hippocampusneuronerna.
Renhet – För att få optimala primära cellkulturer måste utredaren vara säker, utbildad och kunna arbeta snabbt, särskilt för att minimera dissektionstiden. Även om pyramidala neuroner är den huvudsakliga celltypen, innehåller hippocampus en mängd olika interneuroner14. För att generera kulturer med minimala gliaceller måste hippocampus extraheras med den minimala omgivande vävnaden. Användningen av en svart bakgrund under dissektion hjälper till att identifiera gränserna för hippocampus under stereomikroskopet. Dessutom bör det beaktas att lägre celltätheter resulterar i mindre parakrint stöd och gör det svårare att upprätthålla kulturen13. Så det är viktigt att ha denna balans i åtanke. Detta är viktigt i bildstudier som använder ett lågt antal celler (50 000 neuroner per 3,5 cm skål). För att kunna få ytterligare tid för hippocampusextraktionen bör viloläge som bevarar vävnaden användas17. Att arbeta med adekvata kirurgiska verktyg är också viktigt. Verktyg med hög precision är känsliga, så teknikens reproducerbarhet bör säkerställas genom att noggrant skydda dem.
Homogenitet – För att utveckla en kultur utan cellaggregat har den mekaniska celldissociationen uppgraderats genom att kombinera användningen av en fördragen glaspipett med en standard 1,000 μL pipett.
Viabilitet – I detta protokoll tillsattes inga antibiotika eftersom de påverkar neuronal excitabilitet och förändrar de elektrofysiologiska egenskaperna hos de odlade neuronerna18. Därför är kontaminering mycket sannolikt om de högsta standarderna för sterilitet inte upprätthålls. Temperaturen är också en nyckelfaktor. Att hålla vävnaden kall under hippocampusisoleringen saktar ner ämnesomsättningen och minskar cellnedbrytningen. Vävnaden hölls därför på is tills celldissociationsprocessen. Dessutom är det viktigt att hitta rätt balans under den enzymatiska celldissociationen som disaggregerar cellerna utan markerad celllys. I detta protokoll har tidpunkterna för inkubation med trypsin och de efterföljande tvättstegen optimerats för att erhålla enskilda celler med tillräckligt med utrymme för att möjliggöra skapandet av ett lämpligt neuronalt nätverk.
Kritiska steg finns också i fluorescerande levande immunfärgning och kalciumaktivitetsinspelningar från neuronala kulturer. För att utföra framgångsrik levande immunfärgning för att bestämma närvaron av antikroppar mot cellytproteiner i patientprover måste man undvika permeabilisering av cellerna som skulle ge antikropparna tillgång till intracellulära proteiner. Baserat på antikropparnas titer måste dessutom inkubationstiden och provutspädningen justeras i enlighet med detta (t.ex. kan mycket höga titerantikroppar ge bakgrundsfärgning som gör det svårt att tolka resultaten). När man utför patogenicitetsbedömningen av autoantikropparna med kalciumavbildning måste man använda ett medium som är optimalt för cellulära aktivitetsmätningar (t.ex. är Mg2+ undertryckande i odlingsmediet viktigt för god prestanda). För fluorescensavbildning bör dessutom media med pH-indikatorer som fenolrött undvikas eftersom det introducerar en ospecifik bakgrundssignal.
Det finns två huvudsakliga begränsningar av användningen av hippocampus neuronala kulturer. För det första, jämfört med stabila cellinjer, måste primära kulturer genereras kontinuerligt, vilket innebär att laboratoriedjur används regelbundet. Inducerade pluripotenta stamcellslinjer (iPSC) skulle kunna ersätta behovet av att använda djurmodeller, men differentieringsprotokollen för iPSC är fortfarande inte optimala. För det andra uttrycker neuroner härledda från iPSC inte de fullständiga spektra av ytproteiner och därför, om de används, innebär frånvaron av reaktivitet inte nödvändigtvis negativiteten hos provet19.
Det finns tre metoder för att screena för närvaron av autoantikroppar i serumet eller CSF hos patienter som misstänks ha AE: vävnadsbaserad analys (TBA) med hjälp av råtthjärnvävnad, cellbaserad analys (CBA) med HEK-celler transfekterade för att uttrycka neuronala proteiner, och applikationen rapporterad här med levande kulturer av hippocampusneuroner19. Betydelsen av den odlade hippocampala neuronmetoden ligger i dess förmåga att differentiera reaktivitet med yt- och intracellulära antigener som inte lätt kan särskiljas av TBA. Dessutom är primära neuronala kulturer, till skillnad från CBA i HEK-transfekterade celler, inte begränsade av repertoaren av transfekterade proteiner. Dessutom kan odlade hippocampusneuroner användas för att identifiera nya antikroppar och deras målantigener i kombination med immunoprecipitation och masspektrometri och därför bredda spektrumet av identifierbara antikroppar. Slutligen möjliggör det bedömning av de patogena effekterna av autoantikropparna genom levande avbildningsmetoder som kan övervaka förändringar i cellulär aktivitet. Sammanfattningsvis möjliggör identifieringen av nya autoantikroppar så småningom initiering av specifika immunterapier för att förbättra patientresultaten.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Merche Rivas, Maria Marsal, Gustavo Castro, Jordi Cortés, Alina Hirschmann och Angel Sandoval (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) och Mercedes Alba, Marija Radosevic, David Soto, Xavier Gasull, Mar Guasp och Lidia Sabater (IDIBAPS, Hospital Clínic, Barcelonas universitet) för deras tekniska support och för tillhandahållande av reagenser, och Josep Dalmau och Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Hospital Clínic, Barcelonas universitet) för deras kritiska granskning av manuskriptet och mentorskapet. Denna studie finansierades av Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) och medfinansierades av Europeiska unionen, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad – Severo Ochoa-programmet för kompetenscentrum inom FoU (CEX2019-000910-S, P.L-A.); CERCA-programmet och Laserlab-Europe (871124, P.L-A.); Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); och Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Beaker 100 mL | Pirex | – | |
Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Curved forceps | FST | 11009-13 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | – | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
Forceps | FST | 11000-12 | |
Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | – | |
Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | – | |
ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
Microscope cell chamber | Custom-build | – | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
NBQX | Tocris | 373 | |
Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | – | |
Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
Polystyrene ice tray | – | – | re-used cap of a polysterene box |
Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
Scissors | FST | 14068-12 | |
Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |