संवर्धन और आनुवंशिक रूप से एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड में हेरफेर करना
Summary
एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड बैक्टीरिया के साथ सहजीवन में रहते हैं और साथ में वे अपनी जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली को कमजोर करके कीड़ों को सफलतापूर्वक संक्रमित करते हैं। सूत्रकृमि संक्रमण के आनुवंशिक आधार पर अनुसंधान को बढ़ावा देने के लिए, एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड को बनाए रखने और आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के तरीकों का वर्णन किया गया है।
Abstract
जेनेरा हेटरोरहाब्डाइटिस और स्टेनरनेमा में एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड मिट्टी में रहने वाले कीड़ों के परजीवी हैं। उनके जीवन चक्र की मुख्य विशेषता क्रमशः बैक्टीरिया फोटोरहाब्डस और ज़ेनोरहाब्डस के साथ पारस्परिक संबंध है। सूत्रकृमि परजीवी उपयुक्त कीट मेजबानों का पता लगाने और प्रवेश करने में सक्षम हैं, कीट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को नष्ट कर देते हैं, और अगली पीढ़ी का उत्पादन करने के लिए कुशलतापूर्वक गुणा करते हैं जो सक्रिय रूप से संक्रमित करने के लिए नए कीट शिकार का शिकार करेंगे। उनके जीवन चक्र के गुणों के कारण, एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड लोकप्रिय जैविक नियंत्रण एजेंट हैं, जिनका उपयोग विनाशकारी कृषि कीट कीटों को नियंत्रित करने के लिए कीटनाशकों के साथ संयोजन में किया जाता है। इसके साथ ही, ये परजीवी सूत्रकृमि सूत्रकृमि का विश्लेषण करने और विरोधी सूत्रकृमि प्रतिक्रियाओं की मेजबानी करने के लिए एक शोध उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह शोध संक्रमण के दौरान नेमाटोड स्रावित अणुओं की भूमिका को समझने के लिए आनुवंशिक तकनीकों और ट्रांसक्रिप्टोमिक दृष्टिकोणों के हालिया विकास से सहायता प्राप्त है। यहां, एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड को बनाए रखने और जीन नॉकडाउन प्रक्रिया का उपयोग करने पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। ये पद्धतियां एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड संक्रमण कारकों के कार्यात्मक लक्षण वर्णन को बढ़ावा देती हैं।
Introduction
एकीकृत कीट प्रबंधन रणनीतियों में इन परजीवियों की उपयोगिता और बुनियादी जैव चिकित्सा अनुसंधान 1,2 में उनकी भागीदारी के कारण पिछले कुछ वर्षों में एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड (ईपीएन) पर अनुसंधान तेज हो गया है। हाल के अध्ययनों ने ईपीएन को मॉडल जीवों के रूप में स्थापित किया है जिसमें संक्रमण प्रक्रिया के विभिन्न चरणों के दौरान सक्रिय होने वाले सूत्रकृमि आनुवंशिक घटकों की जांच करना है। यह जानकारी मेजबान शरीर विज्ञान को बदलने और कीट जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 3,4 को अस्थिर करने के लिए परजीवी द्वारा स्रावित अणुओं की प्रकृति और संख्या पर महत्वपूर्ण सुराग प्रदान करती है। इसके साथ ही, यह ज्ञान आमतौर पर कीट मेजबान प्रतिरक्षा सिग्नलिंग मार्गों के प्रकार और रोगजनकों 5,6 के प्रवेश और प्रसार को प्रतिबंधित करने के लिए विनियमित कार्यों पर उपन्यासविवरणों द्वारा पूरक होता है। ईपीएन और उनके कीट मेजबानों के बीच गतिशील परस्पर क्रिया के दोनों किनारों की कल्पना करने के लिए इन प्रक्रियाओं को समझना महत्वपूर्ण है। ईपीएन-कीट मेजबान संबंधों की बेहतर प्रशंसा निस्संदेह स्तनधारी परजीवी नेमाटोड के साथ समान अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगी, जिससे मानव प्रतिरक्षा प्रणाली में हस्तक्षेप करने वाले संक्रमण कारकों की पहचान और लक्षण वर्णन हो सकता है।
ईपीएन नेमाटोड हेटरोरहाब्डाइटिस एसपी और स्टेनरनेमा एसपी कीड़ों की एक विस्तृत श्रृंखला को संक्रमित कर सकते हैं, और उनके जीव विज्ञान का पहले गहन अध्ययन किया गया है। दो नेमाटोड परजीवी प्रजनन के अपने तरीके में भिन्न होते हैं हेटरोरहाब्डिटिस आत्म-निषेचित होने और स्टीनरनेमा एम्फीमिक प्रजनन से गुजरने के साथ, हालांकि हाल ही में एस हेर्मैफ्रोडाइटम को हेर्मैफ्रोडाइट्स के आत्म-निषेचन द्वारा या पार्थेनोजेनेसिस 7,8,9 के माध्यम से प्रजनन करने के लिए दिखाया गया था। हेटरोरहाब्डाइटिस और स्टेनरनेमा नेमाटोड के बीच एक और अंतर क्रमशः ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया, फोटोरहाब्डस और ज़ेनोरहाब्डस के दो अलग-अलग जेनेरा के साथ उनका सहजीवी पारस्परिकता है, जो दोनों कीड़ों के शक्तिशाली रोगजनक हैं। ये बैक्टीरिया ईपीएन के मुक्त-जीवित और गैर-खिला संक्रामक किशोर (आईजे) चरण में पाए जाते हैं, जो अतिसंवेदनशील मेजबानों का पता लगाते हैं, कीट हेमोकोएल तक पहुंच प्राप्त करते हैं जहां वे अपने संबंधित बैक्टीरिया को छोड़ते हैं जो तेजी से दोहराते हैं, और कीट ऊतकों को उपनिवेशित करते हैं। ईपीएन और उनके बैक्टीरिया दोनों विषाणु कारकों का उत्पादन करते हैं जो कीट सुरक्षा को निरस्त्र करते हैं और होमियोस्टेसिस को खराब करते हैं। कीट मृत्यु के बाद, सूत्रकृमि आईजे वयस्क ईपीएन बनने और अपने जीवन चक्र को पूरा करने के लिए विकसित होते हैं। भोजन की कमी और कीट शव के भीतर भीड़भाड़ के जवाब में गठित आईजे का एक नया समूह अंततः उपयुक्त मेजबान 9,10,11,12 का शिकार करने के लिए मिट्टी में उभरता है।
यहां, ईपीएन नेमाटोड को बनाए रखने, बढ़ाने और आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल सहजीवी एच बैक्टीरियोफोरा और एस कार्पोकैप्से आईजे की प्रतिकृति, एक्सेनिक नेमाटोड आईजे की पीढ़ी, माइक्रोइंजेक्शन के लिए एच बैक्टीरियोफोरा हेर्मैफ्रोडाइट्स का उत्पादन, डीएसआरएनए की तैयारी और माइक्रोइंजेक्शन तकनीक को रेखांकित करता है। ये विधियां नेमाटोड रोगजनकता और मेजबान विरोधी सूत्रकृमि प्रतिरक्षा के आणविक आधार को समझने के लिए आवश्यक हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड संक्रमण और कीट विरोधी सूत्रकृमि प्रतिरक्षा के आणविक आधार को समझने के लिए पारस्परिक रूप से जुड़े बैक्टीरिया13,15,16 से परजीवी के पृथक्करण की आवश्यकता ह?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए जॉर्ज वाशिंगटन विश्वविद्यालय में जैविक विज्ञान विभाग के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। सभी ग्राफिकल आंकड़े बायोरेंडर का उपयोग करके बनाए गए थे। आईई, जेएच, और डी ओ’एच में अनुसंधान। प्रयोगशालाओं द्वारा समर्थित किया गया है जॉर्ज वाशिंगटन विश्वविद्यालय तथा कोलंबियाई कॉलेज ऑफ आर्ट्स एंड साइंसेज धन और क्रॉस-डिसिप्लिनरी रिसर्च फंड की सुविधा प्रदान करता है।
Materials
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | – | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | – | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | – | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
References
- Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202 (2021).
- Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
- Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
- Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -. H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Génétique. 220 (1), (2021).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
- Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660 (2021).
- Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).
- Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
- Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
- Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568 (2020).
- Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
- Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
- McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).
