昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作
Summary
昆虫病原性線虫は細菌と共生して生きており、一緒になって自然免疫系を損なうことによって昆虫に感染することに成功しています。線虫感染の遺伝的基盤に関する研究を促進するために、昆虫病原性線虫を維持し、遺伝的に操作する方法が記載されている。
Abstract
ヘテロラブディティス属およびSteinernma属の昆虫病原性線虫は、土壌に生息する昆虫の義務性寄生虫である。それらのライフサイクルの主な特徴は、それぞれ細菌PhotorhabdusおよびXenorhabdusとの相互主義的な関連である。線虫寄生虫は、適切な昆虫宿主を見つけて侵入し、昆虫の免疫応答を覆し、効率的に増殖して、感染する新しい昆虫の獲物を積極的に狩る次世代を作り出すことができる。そのライフサイクルの特性のために、昆虫病原性線虫は、破壊的な農業害虫を防除するために殺虫剤と組み合わせて使用される一般的な生物学的防除剤である。同時に、これらの寄生性線虫は、線虫病原性および宿主抗線虫応答を分析するための研究ツールを表す。この研究は、感染中の線虫分泌分子の役割を理解するための遺伝学的技術およびトランスクリプトーム的アプローチの最近の開発によって支援されている。ここでは、昆虫病原性線虫の維持および遺伝子ノックダウン手順の使用に関する詳細なプロトコルが提供される。これらの方法論は、昆虫病原性線虫感染因子の機能的特徴付けをさらに促進する。
Introduction
昆虫病原性線虫(EPN)に関する研究は、主に統合された害虫管理戦略におけるこれらの寄生虫の有用性と基本的な生物医学研究への関与のために、過去数年間で強化されています1,2。最近の研究では、感染プロセスのさまざまな段階で活性化される線虫の遺伝的成分を調べるためのモデル生物としてEPNが確立されています。この情報は、宿主の生理機能を変え、昆虫の自然免疫応答を不安定化させるために寄生虫によって分泌される分子の性質と数に関する重要な手がかりを提供します3,4。同時に、この知識は、昆虫宿主免疫シグナル伝達経路の種類と、病原体の侵入と拡散を制限するために調節する機能に関する新しい詳細によって一般的に補完される5,6。これらのプロセスを理解することは、EPNとその昆虫宿主との間の動的相互作用の両側を想像するために不可欠です。EPNと昆虫の宿主関係をよりよく理解することは、間違いなく哺乳類寄生線虫との同様の研究を促進し、ヒト免疫系を妨げる感染因子の同定および特徴付けにつながる可能性がある。
EPN線虫ヘテロラブディティス属およびSteinernema sp.は広範囲の昆虫に感染することができ、その生物学は以前に激しく研究されてきた。2つの線虫寄生虫は、ヘテロラブディティスが自己受精し、Steinernemaが両生繁殖を起こして生殖様式が異なるが、最近S. hermaphroditumは雌雄同体の自己受精または単為生殖を介して繁殖することが示された7,8,9。ヘテロラブドリティスとスタイナーネマ線虫のもう一つの違いは、グラム陰性菌の2つの異なる属、フォトラブダスとキセノラブドゥスとの共生的相互主義であり、これらは両方とも昆虫の強力な病原体である。これらの細菌は、EPNの自由生活および非摂食感染性幼若(IJ)段階で発見され、感受性宿主を検出し、昆虫ヘモコエルにアクセスし、そこで急速に複製する関連細菌を放出し、昆虫組織に定着する。EPNとその細菌の両方が、昆虫の防御を武装解除し、恒常性を損なう病原性因子を産生する。昆虫の死に続いて、線虫IJは成体EPNになり、そのライフサイクルを完了するために発達する。昆虫の死体内の食糧不足と過密化に対応して形成されたIJの新しいコホートは、適切な宿主9,10,11,12を狩るために土壌中に最終的に出現する。
ここでは、EPN線虫を維持、増幅、および遺伝的に操作するための効率的なプロトコルが記載されている。特に、このプロトコールは、共生性H.バクテリオフォラおよびS.カルポカプサエIJの複製、軸索線虫IJの生成、マイクロインジェクションのためのH.バクテリオフォラ雌雄同体の生産、dsRNAの調製、およびマイクロインジェクション技術を概説する。これらの方法は、線虫病原性および宿主抗線虫免疫の分子基盤を理解するために不可欠である。
Protocol
Representative Results
Discussion
昆虫病原性線虫感染および昆虫抗線虫免疫の分子基盤を理解するには、相互に関連する細菌から寄生虫を分離することが必要である13、15、16。昆虫病原性線虫H.バクテリオフォラおよびS.カルポカプセは、それぞれグラム陰性菌P.ルミネッセンスおよびX.線虫と共に生息する17。?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ジョージワシントン大学生物科学部のメンバーに、原稿を批判的に読んでくれたことに感謝します。すべてのグラフィカルな図はBioRenderを使用して作成されました。I.E.、J.H.、D.O’H.の研究研究室は、ジョージワシントン大学とコロンビア芸術科学大学によって支援されており、資金と学際的な研究資金を促進しています。
Materials
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | – | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | – | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | – | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
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