परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके जीवित पौधों के अंगों में प्राथमिक कोशिका भित्ति के यांत्रिक गुणों की विशेषता
Summary
कोशिका भित्ति बायोमैकेनिक्स का अध्ययन पौधे के विकास और मोर्फोजेनेसिस को समझने के लिए आवश्यक है। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके युवा पौधों के अंगों के आंतरिक ऊतकों में पतली प्राथमिक कोशिका दीवारों की जांच करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्रस्तावित है।
Abstract
प्राथमिक सेल की दीवारों के यांत्रिक गुण पौधे की कोशिका वृद्धि की दिशा और दर निर्धारित करते हैं और इसलिए, पौधे के भविष्य के आकार और आकार को निर्धारित करते हैं। इन गुणों को मापने के लिए कई परिष्कृत तकनीकों को विकसित किया गया है; हालांकि, सेलुलर स्तर पर सेल दीवार लोच का अध्ययन करने के लिए परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) सबसे सुविधाजनक बनी हुई है। इस तकनीक की सबसे महत्वपूर्ण सीमाओं में से एक यह रही है कि केवल सतही या पृथक जीवित कोशिकाओं का अध्ययन किया जा सकता है। यहां, एक पौधे के शरीर के आंतरिक ऊतकों से संबंधित प्राथमिक सेल दीवारों के यांत्रिक गुणों की जांच करने के लिए परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रस्तुत किया गया है। यह प्रोटोकॉल जड़ों में कोशिका भित्ति के स्पष्ट यंग के मापांक के माप का वर्णन करता है, लेकिन विधि को अन्य पौधों के अंगों पर भी लागू किया जा सकता है। माप एक तरल कोशिका में पौधे सामग्री के विब्राटोम-व्युत्पन्न वर्गों पर किए जाते हैं, जो (i) प्लास्मोलाइजिंग समाधान के उपयोग से बचने या मोम या राल के साथ नमूना प्रत्यारोपण से बचने की अनुमति देता है, (ii) प्रयोगों को तेज करना, और (iii) नमूने के निर्जलीकरण को रोकना। एंटीक्लिनल और पेरिक्लिनल सेल की दीवारों दोनों का अध्ययन किया जा सकता है, यह इस बात पर निर्भर करता है कि नमूना कैसे विभाजित किया गया था। विभिन्न ऊतकों के यांत्रिक गुणों में अंतर की जांच एक ही खंड में की जा सकती है। प्रोटोकॉल अध्ययन योजना के सिद्धांतों, नमूना तैयारी और माप के साथ मुद्दों के साथ-साथ लोचदार मापांक के प्राप्त मूल्यों पर स्थलाकृति के प्रभाव से बचने के लिए बल-विरूपण वक्रों का चयन करने की विधि का वर्णन करता है। विधि नमूना आकार तक सीमित नहीं है, लेकिन सेल आकार के प्रति संवेदनशील है (यानी, एक बड़े लुमेन वाली कोशिकाओं की जांच करना मुश्किल है)।
Introduction
प्लांट सेल की दीवार के यांत्रिक गुण सेल के आकार और इसके बढ़ने की क्षमता निर्धारित करते हैं। उदाहरण के लिए, पराग ट्यूब की बढ़ती नोक एक ही ट्यूब1 के गैर-बढ़ते भागों की तुलना में नरम है। एराबिडोप्सिस मेरिस्टेम पर प्रिमोर्डिया गठन भविष्य के प्रिमोर्डियम 2,3 की साइट पर कोशिका भित्ति कठोरता में स्थानीय कमी से पहले होता है। एराबिडोप्सिस हाइपोकोटिल की कोशिका भित्ति, जो मुख्य विकास अक्ष के समानांतर हैं और तेजी से बढ़ती हैं, उन लोगों की तुलना में नरम होती हैं जो इस अक्ष के लंबवत होती हैं और धीमीगति से बढ़ती हैं। मक्का की जड़ में, विभाजन से बढ़ाव तक कोशिकाओं का संक्रमण जड़ के सभी ऊतकों में लोचदार मोडुलिन में कमी के साथ था। मोडुलिन बढ़ाव क्षेत्र में कम रहा और देर से बढ़ाव क्षेत्र6 में बढ़ गया।
विभिन्न तरीकों की उपलब्धता के बावजूद, सालाना प्राप्त सेल दीवार जीव विज्ञान पर जैव रासायनिक और आनुवंशिक जानकारी के बड़े सरणी की तुलना शायद ही कभी सेल की दीवारों के यांत्रिक गुणों से की जाती है। उदाहरण के लिए, सेल की दीवार से संबंधित जीन पर उत्परिवर्ती ने अक्सर विकास और विकास 4,7,8 को बदल दिया है, लेकिन बायोमैकेनिक्स के संदर्भ में शायद ही कभी वर्णित किया जाता है। इसका एक कारण सेलुलर और उपकोशिकीय स्तरों पर माप करने में कठिनाई है। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) वर्तमान में इस तरह के विश्लेषणके लिए प्राथमिक दृष्टिकोण है।
हाल के वर्षों में, प्लांट सेल वॉल बायोमैकेनिक्स पर कई एएफएम-आधारित अध्ययन किए गए हैं। एराबिडोप्सिस 2,3,4,5,10,11 और प्याज 12 के बाहरी ऊतकों की कोशिका भित्ति के यांत्रिक गुणों के साथ-साथ सुसंस्कृत कोशिकाओं13,14,15 की जांच की गई है। हालांकि, एक पौधे की सतही कोशिकाओं में कोशिका भित्ति हो सकती है जिनके यांत्रिक गुण आंतरिक ऊतकों से भिन्न होतेहैं। इसके अलावा, पौधों की कोशिकाओं को टर्गोर द्वारा दबाव डाला जाता है जो उन्हें कठोर बनाता है। टर्गोर दबाव के प्रभाव से छुटकारा पाने के लिए, शोधकर्ताओं को प्लास्मोलाइजिंग समाधान 2,3,4,5,10,11 का उपयोग करना होगा या टर्गोर और सेल दीवार योगदान 12 में प्राप्त मूल्यों को विघटित करना होगा। पहला दृष्टिकोण नमूना निर्जलीकरण की ओर जाता है और सेल की दीवार16 की मोटाई और गुणों को बदलता है, जबकि दूसरे दृष्टिकोण के लिए अतिरिक्त माप और जटिल गणित की आवश्यकता होती है, और केवल अपेक्षाकृत सरल आकार12 की कोशिकाओं पर लागू होता है। आंतरिक ऊतकों के सेल दीवार गुणों का मूल्यांकन क्रायोसेक्शन17 या राल 8 के साथ प्रभावित पौधे सामग्री के वर्गों पर किया जा सकताहै। हालांकि, दोनों तरीकों में निर्जलीकरण और / या नमूनों का प्रत्यारोपण शामिल है, जो अनिवार्य रूप से गुणों में परिवर्तन की ओर जाता है। पृथक या सुसंस्कृत कोशिकाओं के गुणों को पूरे पौधे के शरीर विज्ञान से संबंधित करना मुश्किल है। पौधों की कोशिकाओं की खेती और अलगाव दोनों उनके सेल की दीवारों के यांत्रिक गुणों को प्रभावित कर सकते हैं।
यहां प्रस्तुत विधि उपर्युक्त दृष्टिकोणों का पूरक है। इसका उपयोग करके, किसी भी ऊतक की प्राथमिक कोशिका भित्ति और पौधे के विकास के किसी भी चरण की जांच की जा सकती है। सेक्शनिंग और एएफएम अवलोकन तरल में किए गए थे जो नमूना निर्जलीकरण से बचाता है। टर्गोर की समस्या हल हो गई क्योंकि कोशिकाओं को काट दिया जाता है। प्रोटोकॉल मक्का और राई की जड़ों के साथ काम का वर्णन करता है, लेकिन किसी भी अन्य नमूने की जांच की जा सकती है कि क्या यह विब्राटोम सेक्शनिंग के लिए उपयुक्त है।
यहां वर्णित एएफएम अध्ययन बल-मात्रा तकनीक का उपयोग करके किए गए थे। विभिन्न उपकरण इस विधि के लिए विभिन्न नामों का उपयोग करते हैं। हालांकि, मूल सिद्धांत समान है; नमूने का एक बल-आयतन मानचित्र कैंटिलीवर (या नमूना) की साइनसॉइडल या त्रिकोणीय गति द्वारा प्राप्त किया जाता है ताकि प्रत्येक विश्लेषण बिंदु पर एक निश्चित लोडिंग बल प्राप्त किया जा सके, जबकि कैंटिलीवर विक्षेपण18 को रिकॉर्ड किया जा सके। परिणाम सतह की स्थलाकृतिक छवि और बल-दूरी वक्रों की सरणी को जोड़ता है। प्रत्येक वक्र का उपयोग एक विशिष्ट बिंदु पर विरूपण, कठोरता, यंग के मापांक, आसंजन और ऊर्जा अपव्यय की गणना करने के लिए किया जाता है। संपर्क मोड19 में स्कैनिंग के बाद बिंदु-दर-बिंदु बल-स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा इसी तरह के डेटा प्राप्त किए जा सकते हैं, हालांकि यह अधिक समय लेने वाला है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्राथमिक सेल की दीवारों के यांत्रिक गुण पौधे की कोशिका वृद्धि की दिशा और दर निर्धारित करते हैं, और इसलिए पौधे का भविष्य का आकार और आकार। यहां प्रस्तुत एएफएम-आधारित विधि मौजूदा तकनीकों का पूरक है जिसका ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम क्रमशः मक्का और राई के बीज प्रदान करने के लिए डॉ दिमित्री सुस्लोव (सेंट पीटर्सबर्ग स्टेट यूनिवर्सिटी, सेंट पीटर्सबर्ग, रूस) और प्रोफेसर मीरा पोनोमेरेवा (तातार साइंटिफिक रिसर्च इंस्टीट्यूट ऑफ एग्रीकल्चर, एफआरसी काज़एससी आरएएस, कज़ान, रूस) को धन्यवाद देना चाहते हैं। प्रस्तुत विधि को एलके को दिए गए रूसी विज्ञान फाउंडेशन परियोजना संख्या 18-14-00168 के ढांचे के भीतर विकसित किया गया था। काम का हिस्सा (प्रस्तुत परिणामों को प्राप्त करना) एपी द्वारा आरएएस के एफआरसी कज़ान वैज्ञानिक केंद्र के लिए सरकारी असाइनमेंट के वित्तीय समर्थन के साथ किया गया था।
Materials
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | – | – | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | – | – | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | – | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | – | – | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | – | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | – | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | – |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | – |
| Ultrapure water | – | – | – |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
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