原子間力顕微鏡を用いた生きた植物器官の初代細胞壁の力学特性評価
Summary
細胞壁バイオメカニクスの研究は、植物の成長と形態形成を理解するために不可欠です。原子間力顕微鏡を用いて、若い植物器官の内部組織における薄い一次細胞壁を調べるために、以下のプロトコルが提案されている。
Abstract
一次細胞壁の機械的性質は、植物細胞の成長の方向と速度、したがって植物の将来のサイズと形状を決定します。これらの特性を測定するために、多くの高度な技術が開発されています。ただし、原子間力顕微鏡(AFM)は、細胞レベルで細胞壁の弾力性を研究するのに最も便利です。この技術の最も重要な制限の1つは、表面的または単離された生細胞しか研究できないことでした。ここでは、植物体の内部組織に属する初代細胞壁の機械的性質を調べるための原子間力顕微鏡の使用が提示される。このプロトコルは、根の細胞壁の見かけのヤング率の測定を記述しますが、この方法は他の植物器官にも適用できます。測定は、液体セル内の植物材料のビブラトーム由来の切片に対して行われるため、(i)プラスモライザー溶液の使用やワックスや樹脂の試料含浸の回避、(ii)実験の迅速化、(iii)試料の脱水防止が可能です。標本の切片化方法に応じて、背斜細胞壁と臆細胞壁の両方を研究することができます。異なる組織の機械的特性の違いは、単一のセクションで調査することができます。このプロトコルでは、研究計画の原則、試験片の準備と測定に関する問題、および得られた弾性率の値に対するトポグラフィーの影響を回避するための力変形曲線の選択方法について説明します。この方法はサンプルサイズによって制限されませんが、細胞サイズに敏感です(すなわち、大きな内腔を有する細胞は検査が困難である)。
Introduction
植物細胞壁の機械的性質は、細胞の形状およびその成長能力を決定する。例えば、花粉管の成長先端は、同じ管1の非成長部分よりも柔らかい。シロイヌナズナ分裂組織上の原基形成は、将来の原基2,3の部位における細胞壁剛性の局所的な減少によって先行される。シロイヌナズナの胚軸の細胞壁は、主成長軸に平行で成長が速く、この軸に垂直で成長が遅い細胞壁よりも柔らかくなっています4,5。トウモロコシの根では、分裂から伸長への細胞の移行は、根のすべての組織における弾性率の低下を伴っていた。弾性率は伸長帯では低いままであり、後期伸長帯6で増加した。
様々な方法が利用可能であるにもかかわらず、毎年得られる細胞壁生物学に関する生化学的および遺伝学的情報の大規模な配列は、細胞壁の機械的特性と比較されることはめったにありません。例えば、細胞壁関連遺伝子上の変異体は、しばしば成長および発達を変化させるが4,7,8、バイオメカニクスの観点から記述されることはめったにない。その理由の1つは、細胞レベルおよび細胞内レベルでの測定を行うことの難しさです。原子間力顕微鏡(AFM)は現在、そのような分析の主要なアプローチです9。
近年、植物細胞壁のバイオメカニクスに関するAFMベースの研究が数多く行われています。シロイヌナズナ2,3,4,5,10,11およびタマネギ12の外側組織、ならびに培養細胞13,14,15の細胞壁の機械的性質が調べられている。しかしながら、植物の表在細胞は、内部組織のそれらとは異なる機械的性質を有する細胞壁を有し得る6。さらに、植物細胞は膨圧によって加圧され、植物細胞をより硬くします。turgor圧の影響を取り除くために、研究者はプラスモライザー溶液2,3,4,5,10,11を使用するか、得られた値をturgorと細胞壁の寄与に分解する必要があります12。第1のアプローチは、試料の脱水をもたらし、細胞壁16の厚さおよび特性を変化させるが、第2のアプローチは、追加の測定および複雑な数学を必要とし、比較的単純な形状の細胞にのみ適用される12。内部組織の細胞壁特性は、凍結切片17または樹脂8を含浸させた植物材料の切片で評価することができる。ただし、どちらの方法でもサンプルの脱水や含浸が必要であり、必然的に特性が変化します。単離または培養された細胞の特性は、植物全体の生理機能に関連付けることは困難です。植物細胞の培養と単離の両方が、それらの細胞壁の機械的性質に影響を与える可能性があります。
ここで紹介する方法は、前述のアプローチを補完するものです。それを使用して、あらゆる組織の一次細胞壁および植物発生のあらゆる段階で調べることができる。切片作製およびAFM観察は、サンプルの脱水を回避する液体中で行った。細胞が切断されるにつれて、turgorの問題は解決されました。プロトコルはトウモロコシとライ麦の根での作業について説明していますが、他のサンプルは、ビブラトームの切片化に適しているかどうかを調べることができます。
ここで説明するAFM研究は、力-体積技術を使用して実行されました。このメソッドには、異なる機器が異なる名前を使用します。ただし、基本原則は同じです。試料の力−体積マップは、カンチレバー(または試料)の正弦波または三角形の運動によって得られ、カンチレバーのたわみ18を記録しながら、分析された各点で特定の荷重力を達成する。結果は、サーフェスの地形図と力-距離曲線の配列を組み合わせたものです。各曲線は、特定のポイントでの変形、剛性、ヤング率、接着力、およびエネルギー散逸を計算するために使用されます。同様のデータは、接触モード19でスキャンした後のポイントバイポイントフォース分光法によって得ることができるが、それはより時間がかかる。
Protocol
Representative Results
Discussion
一次細胞壁の機械的性質は、植物細胞の成長の方向と速度、したがって植物の将来のサイズと形状を決定します。ここで紹介するAFMベースの方法は、植物細胞壁の特性を研究するために使用される既存の技術を補完します。それは植物の内部組織に属する細胞壁の弾力性を調査することを可能にする。提示された方法を用いて、成長するトウモロコシの根の異なる組織における細胞壁の機械?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ドミトリー・スースロフ博士(サンクトペテルブルク国立大学、ロシア、サンクトペテルブルク)とミラ・ポノマレワ教授(タタール科学研究所、FRC KazSC RAS、カザン、ロシア)にそれぞれトウモロコシとライ麦の種子を提供してくださったことに感謝します。提示された方法は、LKに授与されたロシア科学財団プロジェクト番号18-14-00168の枠組みの中で開発されました。作業の一部(提示された結果の入手)は、RASのFRCカザン科学センターへの政府の割り当ての財政的支援を受けてAPによって実行されました。
Materials
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | – | – | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | – | – | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | – | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | – | – | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | – | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | – | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | – |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | – |
| Ultrapure water | – | – | – |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
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