Canlı Bitki Organlarında Primer Hücre Duvarının Mekanik Özelliklerinin Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Karakterize Edilmesi
Summary
Hücre duvarı biyomekaniği çalışmaları, bitki büyümesini ve morfogenezini anlamak için gereklidir. Aşağıdaki protokol, atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak genç bitki organlarının iç dokularındaki ince primer hücre duvarlarının araştırılması için önerilmiştir.
Abstract
Birincil hücre duvarlarının mekanik özellikleri, bitki hücresi büyümesinin yönünü ve hızını ve dolayısıyla bitkinin gelecekteki boyutunu ve şeklini belirler. Bu özellikleri ölçmek için birçok sofistike teknik geliştirilmiştir; Bununla birlikte, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), hücresel düzeyde hücre duvarı elastikiyetini incelemek için en uygun olanı olmaya devam etmektedir. Bu tekniğin en önemli sınırlamalarından biri, sadece yüzeysel veya izole canlı hücrelerin incelenebilmesidir. Burada, bir bitki gövdesinin iç dokularına ait birincil hücre duvarlarının mekanik özelliklerini araştırmak için atomik kuvvet mikroskobunun kullanımı sunulmaktadır. Bu protokol, köklerdeki görünür Young’ın hücre duvarları modülünün ölçümlerini açıklar, ancak yöntem diğer bitki organlarına da uygulanabilir. Ölçümler, (i) plazmolize edici çözeltilerin veya balmumu veya reçine ile numune emprenye edilmesinin önlenmesine, (ii) deneylerin hızlı hale getirilmesine ve (iii) numunenin dehidrasyonunun önlenmesine izin veren sıvı bir hücredeki bitki materyalinin vibratom türevi bölümleri üzerinde gerçekleştirilir. Hem antiklinal hem de periklinal hücre duvarları, numunenin nasıl kesitlendiğine bağlı olarak incelenebilir. Farklı dokuların mekanik özelliklerindeki farklılıklar tek bir bölümde incelenebilir. Protokol, çalışma planlamasının ilkelerini, numune hazırlama ve ölçümlerle ilgili konuları ve ayrıca topografyanın elastik modülün elde edilen değerleri üzerindeki etkisini önlemek için kuvvet-deformasyon eğrilerini seçme yöntemini açıklar. Yöntem, örneklem büyüklüğü ile sınırlı değildir, ancak hücre boyutuna duyarlıdır (yani, büyük lümenli hücrelerin incelenmesi zordur).
Introduction
Bitki hücre duvarının mekanik özellikleri, hücrenin şeklini ve büyüme yeteneğini belirler. Örneğin, polen tüpünün büyüyen ucu, aynı tüpün büyümeyen kısımlarından daha yumuşaktır1. Arabidopsis meristemindeki primordia oluşumundan önce, gelecekteki primordium 2,3 bölgesinde hücre duvarı sertliğinde lokal bir azalma vardır. Arabidopsis hipokotilinin ana büyüme eksenine paralel olan ve daha hızlı büyüyen hücre duvarları, bu eksene dik olanlardan daha yumuşaktır ve 4,5 daha yavaş büyür. Mısır kökünde, hücrelerin bölünmeden uzamaya geçişine, kökün tüm dokularında elastik modülde bir azalma eşlik etti. Modül, uzama zonunda düşük kaldı ve geç uzama bölgesi6’da arttı.
Çeşitli yöntemlerin mevcudiyetine rağmen, hücre duvarı biyolojisi üzerine yıllık olarak elde edilen büyük biyokimyasal ve genetik bilgi dizileri, hücre duvarlarının mekanik özellikleri ile nadiren karşılaştırılmaktadır. Örneğin, hücre duvarı ile ilgili genlerdeki mutantlar genellikle büyüme ve gelişmeyi değiştirmiştir 4,7,8, ancak nadiren biyomekanik olarak tanımlanmaktadır. Bunun nedenlerinden biri, hücresel ve hücre altı seviyelerde ölçüm yapmanın zorluğudur. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) şu anda bu tür analizler için birincil yaklaşımdır9.
Son yıllarda, bitki hücre duvarı biyomekaniği üzerine AFM tabanlı çok sayıda çalışma yapılmıştır. Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 ve soğan 12’nin dış dokularının ve 13,14,15 kültürlü hücrelerin hücre duvarlarının mekanik özellikleri araştırılmıştır. Bununla birlikte, bir bitkinin yüzeysel hücreleri, mekanik özellikleri iç dokularınkinden farklı olan hücre duvarlarına sahip olabilir6. Ek olarak, bitki hücreleri turgor tarafından basınçlandırılır ve bu da onları daha sert hale getirir. Turgor basıncının etkisinden kurtulmak için araştırmacılar 2,3,4,5,10,11 plazmozlama solüsyonlarını kullanmak veya elde edilen değerleri turgor ve hücre duvarı katkılarına ayrıştırmak zorundadır 12. İlk yaklaşım numune dehidrasyonuna yol açar ve hücre duvarının kalınlığını ve özelliklerini değiştirir16, ikinci yaklaşım ise ek ölçümler ve karmaşık matematik gerektirir ve yalnızca nispeten basit şekil12’deki hücreler için geçerlidir. İç dokuların hücre duvarı özellikleri, kriyoseksiyon17 veya reçine8 ile emprenye edilmiş bitki materyali bölümleri üzerinde değerlendirilebilir. Bununla birlikte, her iki yöntem de kaçınılmaz olarak özelliklerde değişikliklere yol açan dehidrasyon ve / veya numunelerin emprenye edilmesini içerir. İzole edilmiş veya kültürlenmiş hücrelerin özelliklerinin, tüm bitkinin fizyolojisi ile ilişkilendirilmesi zordur. Bitki hücrelerinin hem ekimi hem de izolasyonu, hücre duvarlarının mekanik özelliklerini etkileyebilir.
Burada sunulan yöntem yukarıda belirtilen yaklaşımları tamamlamaktadır. Bunu kullanarak, herhangi bir dokunun birincil hücre duvarları ve bitki gelişiminin herhangi bir aşamasında incelenebilir. Kesitleme ve AFM gözlemleri, numune dehidrasyonunu önleyen sıvı içinde gerçekleştirildi. Turgor problemi, hücreler kesildikçe çözüldü. Protokol, mısır ve çavdar kökleri ile çalışmayı tanımlar, ancak vibratom kesiti için uygunsa başka herhangi bir örnek incelenebilir.
Burada anlatılan AFM çalışmaları kuvvet-hacim tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Farklı enstrümanlar bu yöntem için farklı isimler kullanır. Ancak temel ilke aynıdır; Numunenin kuvvet-hacim haritası, konsol sapmasını kaydederken, analiz edilen her noktada belirli bir yükleme kuvveti elde etmek için konsol (veya numunenin) sinüzoidal veya üçgen hareketi ile elde edilir18. Sonuç, yüzeyin topografik görüntüsünü ve kuvvet-mesafe eğrileri dizisini birleştirir. Her eğri, belirli bir noktadaki deformasyonu, sertliği, Young modülünü, yapışmayı ve enerji dağılımını hesaplamak için kullanılır. Benzer veriler, temas modu19’da tarandıktan sonra noktadan noktaya kuvvet-spektroskopi ile elde edilebilir, ancak daha fazla zaman alıcıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birincil hücre duvarlarının mekanik özellikleri, bitki hücresi büyümesinin yönünü ve hızını ve dolayısıyla bitkinin gelecekteki boyutunu ve şeklini belirler. Burada sunulan AFM tabanlı yöntem, bitki hücre duvarlarının özelliklerini incelemek için kullanılan mevcut teknikleri tamamlamaktadır. Bitkinin iç dokularına ait olan hücre duvarlarının elastikiyetinin araştırılmasını sağlar. Sunulan yöntem kullanılarak, büyüyen mısır kökünün farklı dokularındaki hücre duvarlarının m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Dmitry Suslov’a (Saint Petersburg Devlet Üniversitesi, Saint Petersburg, Rusya) ve Prof. Mira Ponomareva’ya (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Rusya) sırasıyla mısır ve çavdar tohumu sağladıkları için teşekkür ederiz. Sunulan yöntem, LK’ya verilen 18-14-00168 sayılı Rus Bilim Vakfı Projesi çerçevesinde geliştirilmiştir. Çalışmanın bir kısmı (sunulan sonuçların elde edilmesi), RAS FRC Kazan Bilim Merkezi için hükümet görevinin mali desteğiyle AP tarafından gerçekleştirildi.
Materials
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | – | – | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | – | – | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | – | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | – | – | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | – | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | – | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | – |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | – |
| Ultrapure water | – | – | – |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. Plos One. 8 (3), 57813 (2013).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).
- Daher, F. B., et al. Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry. Elife. 7, 38161 (2018).
- Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl. Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).
- Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize. Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).
- Chiniquy, D., et al. Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis. Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Peaucelle, A. AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Yakubov, G. E., et al. Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls. Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).
- Zdunek, A., Kurenda, A. Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope. Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).
- Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L). Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).
- Garcia, R. Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications. Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).
- Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots. Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).
- Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues. Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).
- Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
- Braunsmann, C., Schaffer, T. E. Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).
