Summary
本协议描述了使用多腔肌图系统在小鼠主动脉内皮功能的实验 离体 评估中的张力肌图技术的概念和技术应用。
Abstract
小容量腔张力肌图是一种常用的技术，用于评估实验动物和从人体组织分离的小动脉中大小血管的血管收缩力。该技术允许研究人员在严格控制和标准化（近生理）的环境中维持孤立的血管，并可以选择适应各种环境因素，同时用可能诱导血管收缩或血管舒张的不同药理学药物挑战分离的血管。肌图室还提供了一个平台来测量血管反应性，以响应可能单独或同时影响平滑肌和内皮层功能的各种激素、抑制剂和激动剂。血管壁是一个复杂的结构，由三个不同的层组成：内膜（内皮层）、介质（平滑肌和弹性蛋白纤维）和外膜（胶原蛋白和其他结缔组织）。为了清楚地了解每一层的功能特性，访问实验平台和系统至关重要，该平台和系统将允许采用组合方法同时研究所有三层。这种方法需要进入一种半生理条件，该条件将模仿离体环境中的体内环境。小容量腔室张力肌成像为评估环境线索、实验变量或药理激动剂和拮抗剂对血管特性的影响提供了理想的环境。多年来，科学家们一直使用张力肌图技术来测量内皮功能和平滑肌收缩力，以响应不同的药物。在本报告中，使用小容量腔张力肌图系统来测量分离的小鼠主动脉中的内皮功能。本报告重点介绍如何使用小容量腔张力肌图来评估大动脉（如胸主动脉）小段内皮的功能完整性。
Introduction
在过去的几十年里，小腔肌图系统已被用于在 离体实时设置中测量不同层血管壁对各种药理学试剂和神经递质的反应性。血管反应性是健康功能性血管的主要组成部分，对于调节外周和脑血管的血流和灌注至关重要1。在血管壁内，内皮和平滑肌层之间的相互作用是血管张力的主要决定因素，血管张力也不断受到血管壁周围结缔组织层结构变化（外膜）的影响。
内皮层通过释放一些血管舒张因子（包括一氧化氮 （NO）、前列环素 （PGI2） 和内皮衍生的超极化因子 （EDHF））或通过产生血管收缩剂（如内皮素-1 （ET-1） 和血栓素 （TXA2））来控制血管运动2，3，4。在这些因素中，NO已被广泛研究，其在其他关键细胞功能（如炎症，迁移，存活和增殖）中的重要调节作用已在科学文献中被高度引用2，5。
在血管生物学领域，腔室肌图为血管生理学家和药理学家提供了一种有价值和可靠的工具，用于在严格控制的半生理系统中测量内皮功能1。目前，科学家可以使用两种不同的肌图系统：线（或针）张力（等距）肌图和压力肌图。在线肌造影系统中，血管在两根导线或针之间拉伸，允许对血管壁中的力或张力发展进行等长测量，而压力肌图是测量小阻力动脉血管反应性的首选平台，其中血压的变化被认为是血管张力和血管运动变化的主要刺激。人们普遍认为，对于肠系膜和脑动脉等小阻力动脉，压力肌造影会产生更接近人体生理状况的状况。小腔肌图可用于直径非常小（200-500μm）的血管到更大的血管，例如主动脉。
虽然线肌图是在等距条件下记录血管张力的强大系统，但压力肌图是测量血管直径变化以响应同量异位条件变化的更合适的系统。与主动脉等大弹性动脉相比，小肌肉动脉（小动脉）中血管中响应压力或流量变化的血管直径变化要大得多。由于这些原因，压力肌图被认为是具有大量血管反应性的小血管的更好工具1。多腔小容量腔张力肌图的另一个实际优势是，人们可以通过研究同一动脉和同一动物的多个（最多四个）段来识别不同机制对血管反应性的贡献，以减少变异性并产生可靠和确凿的数据。它在技术上也相对容易设置和维护。几乎任何大小的血管都可以用钢丝肌图仪进行研究。它是评估血管功能的一种更具成本效益的解决方案，并且在解剖血管的长度对于压力肌图方案来说太短的实验中是压力肌图的良好替代方案。
本报告提供了使用DMT-620多腔肌图系统（DMT-USA）的小容量腔张力肌成像技术中的安装销评估孤立的小鼠胸主动脉环内皮功能的详细方案。该协议使用6个月大的雄性C57BL6小鼠，平均重量在25-35g之间。幸运的是，考虑到该协议可用于广泛的血管类型和直径，该协议可以应用于各种动物类型和重量。
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Protocol
所有外科手术和动物护理均由中西部大学机构动物护理和使用和护理委员会（IACUC）（IACUC# AZ-3006，AZ-2936）批准。
1. 缓冲液制备
注意：尽管HEPES生理盐溶液（HEPES-PSS）缓冲液在4°C下稳定7天，但建议在每次实验当天新鲜制作所有缓冲液。所有其他试剂和激动剂必须为每次实验新鲜制备。本协议中使用的HEPES-PSS缓冲液是 用于离体 血管研究的成熟缓冲液，已被证明具有细胞保护作用超过12小时，同时保留血管的血管舒张反应 - 该实验方案的主要焦点6，7。
- 制备HEPES-PSS溶液（pH 7.4），如下所示：混合10毫摩尔/升HEPES，6毫摩尔/升葡萄糖，1.5毫摩尔/升氯化钙2，130毫摩尔/升氯化钠，4毫摩尔/升氯化钾，4毫摩尔/升氢氧化钠3，1.2毫摩尔/升镁SO 4，1.2毫摩尔/升KH2 PO4和0.03毫摩尔/升EDTA。
- 准备HEPES-PSS高K + 缓冲液。这与HEPES-PSS溶液相同，只是它含有5毫摩尔/升HEPES，65毫摩尔/升氯化钠，10毫摩尔/升葡萄糖，1毫摩尔/升氯化镁2，80毫摩尔/升氯化钾，不含镁SO4 和EDTA。
2.肌图单元准备
- 打开并将水浴设置为37°C。 确保适当的水位。
- 将两个适当标记的烧杯放入水浴中，一个装有 600 mL HEPES-PSS 溶液，另一个装有 150 mL 高 K+ 溶液。
- 用碳原气体（5%CO2 和95%O2）给300mL HEPES-PSS溶液的烧杯充气至少10分钟。
- 将 30 mL 充气的 HEPES-PSS 溶液加入 50 mL 离心管中，适当标记（胸廓、小鼠识别号），并将其放在冰上。将剩余的充气HEPES-PSS溶液放在冰上，以便在主动脉夹层过程中使用。
- 打开四室肌图仪装置;向每个肌图室中加入6mL的HEPES-PSS溶液，并将热量设置为37°C。 让每个腔室中的溶液充气（用碳原混合物）30分钟，并检查以确保腔室达到所需的37°C（使用此等待期解剖小鼠主动脉）。
- 打开肌图数据采集硬件和计算机。
3.小鼠主动脉隔离
- 用5%异氟醚吸入麻醉实验小鼠并通过颈椎脱位实施安乐死（6个月大的雄性C57BL / 6J小鼠用于本演示）。
- 将鼠标仰卧放在手术板上，并使用手术胶带将附件固定在板上。
- 用70%的酒精喷洒腹部区域，使皮毛完全湿润，任何松散/干燥的毛发都不会进入切口。轻轻擦去多余的溶液。
- 使用镊子定位和隔离仅次于胸骨剑突的腹部皮肤。
- 通过直接向上提升皮肤来产生紧张感。用剪刀做一个钝切口，去除浅表皮肤，露出胸腔。
- 抬起剑突，沿肋下缘做侧切口稍逊于突。
- 颅骨延伸侧切口以切除胸腔的前部。
- 通过钝切脊椎、横膈膜下方和颈部来移除胸廓。
注意：研究人员也可以直接从动物身上切除主动脉，但应注意保护血管并从主动脉冲洗凝结的血液。该协议使用移除胸廓并仔细清洁和解剖主动脉的示例。通过实践，该方法可以快速有效地进行，并且有利于保存额外的组织以进行其他研究，例如免疫组织化学，组织学和蛋白质印迹。 - 将胸廓转移到装有冰冷充气HEPES-PSS缓冲液的透明有机硅弹性体涂层培养皿中，并将其固定在两侧。
注意：使用有机硅弹性体套件（材料表）。混合碱和固化剂（重量10：1），然后倒入玻璃培养皿中，并在25°C下固化24小时。 - 将培养皿置于立体变焦显微镜下，轻轻切割并从肋骨中取出心脏和附着的主动脉，然后转移到干净，透明的有机硅弹性体涂层培养皿中（图1）。
- 然后，轻轻地从主动脉中去除脂肪和结缔组织以及任何凝结的血液。使用锋利的小剪刀，解剖并隔离从弓区到降主动脉底部的整个主动脉。请记住，主动脉弓不适合肌图实验，但可用于组织学研究。
- 在整个解剖过程中使用冷充气HEPES-PSS溶液。每 10 分钟或在可见性受到影响时更改解决方案，无论先到什么。建议在夹层后 20 分钟内（最多 60 分钟）将每个主动脉环安装到肌室上。
4. 将主动脉瓣安装到肌室上
- 使用锋利的小手术剪刀将解剖的主动脉切成四段，每段 2 毫米。使用盘子内的迷你尺作为参考。
- 将肌图室放在立体变焦显微镜下，以轻松显示针脚并设置千分尺，使针脚几乎接触（图2）。
- 确保两个组织固定针正确对齐。
- 安装节段时注意并避免挤压主动脉，以防止损坏内皮。
- 在已经含有 5 mL 加热和充气的 HEPES-PSS 缓冲液的腔室中，使用镊子小心地将 2 mm 主动脉段中的每个滑到两个安装销上。将主动脉瓣滑过销钉时要非常轻柔。内皮层非常脆弱，很容易从管腔侧脱落。
- 通过逆时针旋转千分尺来缓慢地将针脚分开，以便在将腔室放回肌图单元时主动脉段不会从针上滑落（图3）。
- 使用先前校准的解剖显微镜目镜刻度测量已安装的主动脉环的真实和准确长度，方法是将尺子的起点定位在节段的一端（标记为组织端α1），并记下主动脉瓣另一端的测量值（标记为组织端α2）8。这些值将在第 5 节的规范化步骤中使用。
- 将每个肌图室返回到装置中，并开始在37°C下给室充气30分钟。
注意：主动脉的四个段可以用作同一治疗的重复，或者主动脉的每个段可以同时用于不同的实验。
5. 规范化
注意：标准化程序是必要的，以确保实验条件正确标准化，收集的数据可靠且可重复。“IC1/IC100”或“归一化因子”定义为可以记录对血管收缩剂（例如，60 mM KCl）的最大反应的动脉内周长除以记录透壁壁壁压力为 100 mm Hg（即 IC100）的内周长之比。因此，通过将IC100乘以该比率，我们可以确定可以建立最佳反应（即IC1）的动脉内周长。
- 设置千分尺，使引脚几乎接触。
- 将所有肌图室的力设置为零，并让它再平衡 1-2 分钟。
- 记下千分尺的第一个直径读数。这是两个引脚之间的间隙被视为零的位置（步骤5.7需要）。
- 打开DMT下拉菜单下的数据采集软件归一化设置;将打开一个新屏幕，其中包含以下设置和默认值：
目镜校准（毫米/格）：0.36
目标压力（千帕）： 13.3
IC1/IC100： 0.9
在线平均时间： 2
延迟时间： 60
延迟完成时播放声音（复选框）
声音（带下拉选择菜单或浏览功能） - 根据段数，选择屏幕上可用的正确通道数并开始图表录制。
- 使用下拉菜单选择感兴趣的频道;将出现规范化屏幕。
- 在窗口中输入常量值，如下所示：组织终点α1;组织终点α2;引脚直径： 40 μm;来自模拟千分尺刻度的千分尺读数值。
- 要记录第一个点（X 或 X0 的初始值），请单击“ 添加点 ”按钮。延迟 60 秒后，将显示与此千分尺对应的力和有效压力 （ERTP） 值，并且千分尺读数框变为活动状态并可用。
- 通过逆时针方向转动千分尺开始拉伸容器。使用千分尺读数框输入值，然后单击 添加点 按钮（再次会有 60 秒的延迟时间）。
- 继续拉伸容器并继续添加千分尺值，直到看到千分尺 X1 的值，这是用于将容器拉伸到其 IC1 的计算千分尺设置。
- 将千分尺设置为 X1 值。
注意：6个月大的C57BL6小鼠的归一化（最佳）张力为6 mN。 - 正常化后，让组织休息并平衡30分钟。此时无需更改腔室中的HEPES-PSS溶液。
注意：每个腔室能够容纳 8 mL 溶液。该协议是使用 5 mL 编写的，允许容器和安装销完全浸没。 - 利用休息和平衡时间准备以下内容。
- 在蒸馏水（RO水）中从最低到最高浓度制备乙酰胆碱系列稀释液的工作储备液，如下所示：50 nM，100 nM，500 nM，1 μM，5 μM，10 μM，50 μM，100 μM，500 μM和1 mM。在实验期间将所有试管放在冰上。
- 在双蒸水中制备N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）的100mM工作溶液，并在实验期间将溶液保持在冰上。
- 准备在一组单独的实验中测定的去氧肾上腺素（10μM）的次最大剂量。
注意：平衡期对于血管段适应肌图室中的新环境、重置离子梯度并在遭受不同的药理学和机械挑战之前达到稳定的被动张力水平是必要的。
6.主动脉环内皮依赖性血管松弛的测量
- 在30分钟平衡期结束时，排干腔室并向每个腔室中加入5mL新鲜，温热，充气的HEPES-PSS溶液。一次排干一个腔室，以尽量减少组织暴露在空气中。使用设置为 60 cmHg 的真空泵和设置为 6 s 延迟的肌图阀进行腔室的排空，以确保去除 5 mL 的溶液。
- 如果需要，重新调整力测量值以读取 6 mN 的最佳张力。在每个潜伏期以及每组新实验之前将力重新调整到最佳张力非常重要。将纸巾再静置15-20分钟。
- 打开数据采集软件，将跟踪号从 50：1 更改为 500：1，然后按 开始。在此阶段，可以在软件中看到每个腔室的注册力。
- 在新实验开始之前，请务必在数据采集软件上添加适当的标签。
- 再次排干腔室，然后向每个腔室中加入 5 mL 高 K+ 溶液。这适用于在将组织用于任何其他实验方案之前测试主动脉组织的活力和平滑肌对膜去极化收缩反应的完整性。这有助于确定血管段是否可用于进一步实验。
- 一旦对高K + 溶液的收缩响应达到力产生的平台，再次排空腔室（图4）。
注意：不要将高K + 溶液留在腔室中超过3分钟，因为它会损坏组织。 - 用HEPES-PSS溶液清洗纸巾3次。向每个腔室中加入 5 mL 高 K+ 溶液。一旦对高K + 溶液的收缩反应达到力产生的平台，立即排出腔室，并用HEPES-PSS清洗组织3倍，然后让组织再休息15分钟。
注意：在一些实验室中，在开始肌图实验之前，连续三次对血段进行高K + 溶液，以确保血管的可变性。在该协议中，在使用组织进行进一步实验之前，将新分离的主动脉段经受高K + 溶液两次。在所有实验中保持一致这一点很重要。 - 使用响应高K + 溶液的两个注册力发展峰值（收缩力）的平均值来标准化响应实验中使用的其他血管收缩剂和血管扩张剂的注册值。
- 将组织休息15-20分钟。
- 用血管收缩剂去氧肾上腺素（PE）预先收缩主动脉瓣，达到已经确定的次最大剂量（腔室中的10μM终浓度）。
注意：去氧肾上腺素（10μM）的次最大剂量是在一组单独的实验中确定的，其中主动脉段以1nM，5nM，10nM，50nM，100nM，500nM，1μM，5μM，10μM和50μM的最终浓度增加的去氧肾上腺素溶液。结果，确定最终浓度为10μM的去氧肾上腺素可以在2mm主动脉段中产生次最大收缩力（最大力的90%），这是在收缩力达到平台之前。使用次最大浓度去氧肾上腺素的原因是为了避免与主动脉组织饱和或对血管收缩激动剂脱敏相关的问题。 - 允许PE诱导的收缩曲线达到张力（力）发展的平台（图5）。
- 在去氧肾上腺素紧张发展的平台期，通过在 3 分钟间隔内加入 5 μL 增加剂量的乙酰胆碱工作储备溶液来执行乙酰胆碱剂量反应曲线，以便确定肌图室中乙酰胆碱的最终浓度如下：50 pM、100 pM、500 pM、1 nM、5 nM、10 nM、50 nM、 100 nM、500 nM 和 1 μM（图 6）。
注意：加入每剂乙酰胆碱后，等待至少3分钟（张力达到平台），然后再添加下一剂。 - 在每一步中，将乙酰胆碱储备溶液非常缓慢地移入腔室中，远离主动脉环，以避免任何组织紊乱。
- 完成剂量反应实验后，排干腔室并用温热和充气的HEPES-PSS溶液清洗主动脉瓣3x，以去除任何残留的药物。
- 在开始下一个实验步骤之前，将组织休息30分钟。在每个实验步骤之前，使用HEPES-PSS高K + 溶液检查主动脉的活力。如果正确遵循所有准备和实验步骤，则主动脉组织活力将在整个实验期间（4-6小时）保持不变。
7. NO产生的一般抑制剂对内皮介导的血管松弛的影响
- 在仔细清洗和休息节段至少30分钟后，在实验的这一部分使用相同的主动脉组织。
注意：使用30分钟的休息时间在双蒸水中制备N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）的100mM工作溶液，并在实验期间将溶液保持在冰上。 - 将主动脉段静置30分钟后，引流腔室并向每个腔室中加入新鲜，温暖的高K +（60mM KCl）溶液。
注意：重要的是，对于实验的每个部分，主动脉组织至少用高K + 溶液挑战一次。记录的收缩峰值将用于标准化实验该部分收集的数据。 - 一旦对高K + 溶液的收缩反应达到平台期，再次排出腔室，并用HEPES-PSS溶液3x洗涤组织。
- 为了评估NO产生对观察到的乙酰胆碱诱导的血管松弛的贡献（见第6节），在此阶段，通过向每个肌图室（含有5mL缓冲溶液）中加入10μL制备的100mM工作储备溶液，用一般NO产生抑制剂（L-NAME）预孵育主动脉段，以便在每个肌图室中达到200μM的最终浓度。
注意：L-NAME是NOS（负责NO产生的酶）所有亚型的非选择性和有效抑制剂，因此，它被认为是阻止血管壁中NO产生的有效工具9。 - 用L-NAME（30分钟）在预孵育时间内让主动脉段休息。
- 此时不要洗。
- 在不去除L-NAME的情况下，将次最大剂量的去氧肾上腺素（10μM终浓度）添加到腔室中以诱导主动脉收缩。
注意：由于L-NAME对内源性NO产生的抑制作用，去氧肾上腺素诱导的主动脉收缩的新注册峰将远高于用L-NAME孵育组织之前记录的初始峰。这是意料之中的，因为L-NAME对主动脉壁基底NO产生的影响，这导致更高的力产生（由于平滑肌产生更高的收缩力）。 - 等到去氧肾上腺素诱导的收缩曲线达到张力（收缩力）发展的平台期。
- 此时，将乙酰胆碱添加到肌图室中以达到500nM的最终浓度（这是在协议第5节中描述的实验中确定的乙酰胆碱的次最大浓度）。
- 等待几分钟以记录力发展的任何可能变化，直到形成的平台稳定（图7）。
注意：由于L-NAME对内皮层响应乙酰胆碱产生NO的能力的抑制作用，预计不会看到响应去氧肾上腺素的注册力产生任何变化，因为主动脉内皮NOS（eNOS）不能产生NO响应乙酰胆碱应用。 - 排干腔室并用温热的充气HEPES-PSS溶液清洗纸巾3倍。
8.内皮层对主动脉血管松弛的贡献
- 为了强调内皮层在主动脉血管松弛中的作用，在内皮剥落的主动脉段中测试乙酰胆碱诱导的血管松弛，其中内皮层被移除。
- 将肌图室置于显微镜下，轻轻地将一根小线（此处可以使用用于线肌造影的相同导线）穿过主动脉腔。在短时间内轻轻地将电线穿过腔（轻柔的圆周运动）。这足以去除内皮或内膜。
- 如前所述，将主动脉切成 2 mm 的主动脉环，并将这些环安装到肌室上。
- 将最佳张力设置为6 mN，并让组织在充气，温暖的HEPES-PSS缓冲液中休息30分钟
- 在30分钟平衡期结束时，排干腔室并向每个腔室中加入5mL新鲜，温热，充气的HEPES-PSS溶液。
- 通过逆时针方向转动千分尺来将所有肌图室的力归零。
- 逆时针缓慢旋转千分尺以增加引脚之间的距离，直到记录的力达到小鼠主动脉所需的最佳张力（C57BL / 6J小鼠主动脉为6 mN）。将组织以最佳张力（6mN）再休息15-20分钟。
- 在向每个腔室中加入 5 mL 高 K+ 溶液之前，将腔室再排干 1 倍。
- 一旦对高K + 溶液的收缩反应达到平台期，再次排出腔室，并用HEPES-PSS溶液3x洗涤组织。让组织休息15-20分钟
- 用血管收缩剂去氧肾上腺素（腔室中的最终浓度为10μM）预先收缩主动脉瓣。
注意：由于去除内皮，主动脉壁中的基础NO产生显着减少;因此，在缺乏内皮层的主动脉组织中，去氧肾上腺素诱导的收缩峰值（力产生的峰值）预计更高。 - 当去氧肾上腺素诱导的力达到平台时，将乙酰胆碱的次最大浓度添加到肌图室中，以达到500nM的最终浓度。
注意：如果内皮层的去除正确完成，注册的去氧肾上腺素诱导力不会有任何变化，因为乙酰胆碱诱导的内皮产生的NO将由于内皮层的去除而减少。记录的轨迹将与存在L-NAME时观察到的轨迹非常相似（第7节）。 - 在结束实验之前，等待3分钟以确保去氧肾上腺素诱导的力发展的注册平台不会改变（图8）。
注意：如果乙酰胆碱的应用导致去氧肾上腺素诱导的收缩在平台期下降，这表明内皮层尚未完全去除。
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Representative Results
这里解释的张力小腔肌图方案是测量小动脉和大动脉血管反应性的标准方法，允许同时测量来自同一实验小型实验动物的多达四个血管段的血管反应性。在本报告中，我们专门使用该系统来测量分离的小鼠主动脉的内皮功能（图1）。在该协议中，孤立的主动脉瓣安装在两个小不锈钢引脚之间的小器官室（图2）（图3）。肌图室可容纳多达 8 mL 的缓冲溶液，并在实验期间为分离的血管提供半生理环境。在每次实验之前，对每个分离片段的可行性进行测试和验证非常重要。建立每个分离血管段的完整性和活力的标准方案是用高浓度的氯化钾挑战组织以诱导平滑肌膜去极化。在隔离容器健康且响应迅速的情况下，我们将能够在显示屏上记录收缩力的产生（图4）。记录的力峰值随后用于标准化同一段的力生成，以响应方案期间使用的激动剂（例如去氧肾上腺素）。为了测量内皮介导的血管松弛，有必要用去氧肾上腺素的次最大浓度（10μM）预先收缩主动脉组织，这会导致平滑肌介导的收缩和力的产生（图5）。当去氧肾上腺素诱导的收缩达到平台期（图6）时，分多个步骤施用增加剂量的乙酰胆碱，以实现分离段的最大血管松弛（图6）。血管松弛水平是内皮介导的一氧化氮产生的间接测量。为了进一步确认乙酰胆碱诱导的主动脉环血管松弛是由于一氧化氮的产生，在施用去氧肾上腺素之前，用一氧化氮产生的一般抑制剂（200μM的L-NAME）预处理主动脉段30分钟。 如图7所示，L-NAME能够完全阻断乙酰胆碱诱导的预收缩主动脉血管松弛，突出了乙酰胆碱通过增加一氧化氮的产生诱导主动脉血管松弛的事实。另一方面，从主动脉瓣去除内皮层也会阻断乙酰胆碱诱导的血管松弛，强调了内皮在血管松弛中的作用（图8）。
图 1：从 6 个月大的对照小鼠分离的心脏、主动脉根部和降主动脉的大体解剖视图。 从小鼠身上取出肋骨后，将心脏和主动脉从肋骨中分离出来，并转移到干净的有机硅弹性体涂层培养皿中。在分离主动脉之前，重要的是从主动脉腔中去除所有脂肪和结缔组织以及任何血凝块。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：肌图单元腔室的代表性图像，显示了 200 μm 安装销。如图所示，肌图室内的两个针几乎没有接触。在使用腔室之前，确保销钉正确对齐至关重要。请点击此处查看此图的大图。
图 3：将主动脉段固定在肌室上。 从6个月大的C57BL / 6小鼠分离的2 mm小鼠主动脉段由肌图室内的两个针固定。这是通过使用镊子将主动脉轻轻滑动到两个安装销上来实现的。红色虚线框显示安装在肌图室内两个针脚之间的 2 mm 主动脉段的放大图像。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：平滑肌膜去极化引起的主动脉收缩。 代表性图像显示了小鼠主动脉收缩（力产生）的痕迹，以响应高浓度的K + （60mM KCl），这将诱导主动脉内侧层内的平滑肌膜去极化和收缩。应用高K + 溶液后，立即使用温热的充气HEPES-PSS溶液连续洗涤三次。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：对血管收缩剂去氧肾上腺素的反应主动脉收缩。 代表性肌图迹线显示主动脉环响应去氧肾上腺素（10μM）次最大浓度的力产生（收缩）。如图所示，去氧肾上腺素诱导的收缩峰值最终达到平台期。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：乙酰胆碱对预收缩主动脉环的剂量反应影响。 代表性肌图迹线显示血管扩张剂神经递质乙酰胆碱对2mm预收缩主动脉环的剂量反应（50pM-1μM）血管舒张作用。在施用乙酰胆碱之前，主动脉环预先收缩10μM去氧肾上腺素。当去氧肾上腺素诱导的张力达到平台时，加入第一剂乙酰胆碱。 请点击此处查看此图的大图。
图7：一般NO产生抑制剂（L-NAME）对小鼠主动脉内皮介导的血管松弛的影响。 代表性肌图迹线显示，主动脉段与NO产生的一般抑制剂（L-NAME，200μM终浓度）的预孵育阻断乙酰胆碱诱导的预收缩主动脉环中的血管舒张。这是由于L-NAME对eNOS的抑制作用，内皮抑制NO产生。将乙酰胆碱以500nM的次最大浓度添加到预先收缩的主动脉段中。 请点击此处查看此图的大图。
图8：机械内皮去除对小鼠主动脉内皮介导的血管松弛的影响。 代表性肌图痕迹显示，使用线剥离术从主动脉段去除内皮可阻断乙酰胆碱诱导的预收缩主动脉环中的血管舒张。这是由于抑制内皮介导的血管松弛。将乙酰胆碱以500nM的次最大浓度添加到预先收缩的主动脉段中。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
血管生物学领域严重依赖帮助研究人员评估血管壁的功能和结构完整性的工具。它还需要特别注意三层血管之间的直接和间接相互作用：内膜、介质和外膜。在这三层中，内膜由单层内皮细胞形成，在调节血管健康和止血方面具有非常重要的功能。
众所周知，内皮层的任何损伤都会对其释放NO和其他血管舒张因子的能力产生负面影响，导致血管功能失调，这在动脉粥样硬化，动脉瘤和血管炎等各种血管疾病中观察到10，11，12。为了了解控制正常内皮功能的潜在机制并评估血管壁内内皮的血管舒张功能和完整性，必须使用模拟体内生理条件的标准实验系统。
对于大动脉，如主动脉，小腔张力（等长）肌图被广泛认为是一种可靠的工具，可在 离体 环境中为血管创造最佳的近乎生理的条件。该系统还允许在实验室环境中保持组织的活力相当长的时间（长达6-8小时），使该技术成为一种有价值且用途广泛的工具。另一个优点是肌图室允许保留血管环并重新用于背靠背的不同实验，从而使其成为一种具有成本效益的方法，同时减少了对大量实验小鼠的需求。使用四腔肌图系统可以同时测试多达四个血管段，从而提高一致性，同时减少实验之间的差异。
各种药理学和机械工具可用于研究血管中内皮层的功能。功能性内皮的主要标志物是NO的正常产生，NO被称为内皮层产生和释放的最重要的血管扩张剂。内皮功能障碍主要与NO产生显着下降有关，并且已被证明与不同血管疾病（如高血压，血栓形成和动脉粥样硬化）的进展有关。
在血管床内，NO的产生主要由血流量和压力的变化或其他细胞内事件控制，这些事件可能导致细胞质钙浓度的变化或响应激素和生长因子的信号通路激活13，14。NO产生的变化被认为是内皮功能障碍的早期和可靠的标志物之一，它们通常在心血管疾病进展的早期可检测到。无论疾病模型如何，血管生物学家都对允许测量内皮功能的工具和测定非常感兴趣。尤其重要的是，人们可以使用模拟生理条件的平台来区分血管各层的贡献。
在小腔肌图仪中，研究人员可以利用药理学和机械工具在严格控制的环境中测量内皮功能。在肌图室内，创建了一个可以支持血管正常功能的人工环境。在这样的人工环境中，由于分离的血管段不受周围结缔组织和其他器官的支持，因此确定最佳的被动张力非常重要，在该张力下，孤立的节段可以响应于血管加压药产生最大可能的收缩。在最佳张力下，可以测量对去氧肾上腺素或去甲肾上腺素等血管收缩剂的正常最大收缩反应，以测试血管壁平滑肌层的结构和功能完整性。在实验室中，确定6mN的被动张力是2mm小鼠主动脉段15的适当张力。然而，必须为不同物种的不同类型的动脉确定最佳的被动张力16。
此外，在对分离的血管进行任何实验之前，必须测试分离环的活力，以确保它们符合活组织和可用组织的包含和排除标准。这通常是通过将分离的环置于高浓度K+ 溶液（60mM KCl）中来实现的。由于电压门控钙通道（VGCC）的开放，这导致平滑肌膜去极化，导致平滑肌收缩和主动脉血管收缩。该方法用于在使用这些主动脉段进行进一步实验之前验证主动脉节段的活力。
另一方面，血管舒张剂如乙酰胆碱可用于测试内皮层的功能特性。如果内皮层完整且功能正常，则乙酰胆碱的次最大浓度可以在预先收缩的血管段中诱导松弛17。乙酰胆碱诱导的松弛程度是内皮层NO释放水平的指标。内皮层（机械或功能）的任何损伤都会对NO产生和血管舒张反应产生影响。在该协议中，提供的数据显示乙酰胆碱可以以剂量依赖性方式诱导预先收缩的小鼠主动脉中的松弛，在最终浓度为500nM时实现次最大松弛（图6）。
在一些实验中，研究人员对测量平滑肌对血管扩张剂NO的直接反应感兴趣。由于此类实验的重点仅放在平滑肌功能上，因此有一个协议允许研究人员通过从血管段中去除（剥离）内皮层来绕过内皮贡献。内皮可以通过各种方法去除，包括空气、手指间滚动或用电线去除。在这样的实验环境中，剥落的血管（没有内皮层）经受NO供体，如硝酸甘油和硝普钠。这允许确定对NO有反应的平滑肌环GMP蛋白激酶G信号通路是否完整且功能正常7，18。这份手稿解释了去除孤立主动脉段中的内皮层如何完全阻断乙酰胆碱血管舒张作用，强调了NO释放在血管松弛和血管舒张中的重要性（图8）。
虽然线和张力肌图技术在血管生物学实验中具有广泛的用途，但值得注意的是潜在的局限性。具体而言，张力测量系统具有组织大小限制（即较小的脉管系统）。此外，该技术的 离体 性质不允许操纵腔内压力和流量以更精确地模拟 体内 血管功能和血流动力学参数。事实上，压力肌图设置将考虑这些变量并模拟实时血管动力学，同时还允许使用较小的阻力动脉。此外，线肌图实验不能完全复制生理条件或准确模拟循环血液、血管壁和周围组织之间的相互作用，这些相互作用在调节体内血管功能方面也起着重要作用。
无论肌图实验中使用的实验方案还是实验中选择的血管收缩剂/血管扩张剂，小腔肌图系统都为测量血管反应性和功能完整性提供了一个可靠、可重复且稳定的半生理平台。虽然本报告的重点只是内皮功能的基本测量，但肌图系统可用于评估血管的许多其他功能特性，例如应力/应变关系、血管壁强度、破裂点以及被动和主动收缩等等。这突出了肌图系统作为血管生物学领域可靠工具的价值。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院（R15HL145646）和中西部大学研究生院的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
References
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