Summary
Detta protokoll beskriver begreppen och den tekniska tillämpningen av den tensometriska myograftekniken med hjälp av ett flerkammarmyografsystem i den experimentella ex vivo-bedömningen av musens aortaendotelfunktion.
Abstract
Tensomerisk myografi med liten volymkammare är en vanligt förekommande teknik för att utvärdera den vaskulära kontraktiliteten hos små och stora blodkärl hos laboratoriedjur och små artärer isolerade från mänsklig vävnad. Tekniken gör det möjligt för forskare att upprätthålla isolerade blodkärl i en tätt kontrollerad och standardiserad (nästan fysiologisk) miljö, med möjlighet att anpassa sig till olika miljöfaktorer, samtidigt som de isolerade kärlen utmanas med olika farmakologiska medel som kan inducera vasokonstriktion eller vasodilatation. Myografkammaren ger också en plattform för att mäta vaskulär reaktivitet som svar på olika hormoner, hämmare och agonister som kan påverka funktionen hos glatt muskulatur och endotelskikt separat eller samtidigt. Blodkärlsväggen är en komplex struktur som består av tre olika lager: intima (endotelskiktet), media (glatt muskulatur och elastinfibrer) och adventitia (kollagen och annan bindväv). För att få en tydlig förståelse för de funktionella egenskaperna hos varje lager är det viktigt att ha tillgång till en experimentell plattform och ett system som möjliggör en kombinationsmetod för att studera alla tre lagren samtidigt. Ett sådant tillvägagångssätt kräver tillgång till ett semifysiologiskt tillstånd som skulle efterlikna in vivo-miljön i en ex vivo-miljö. Tensomemetrisk myografi med liten volymkammare har gett en idealisk miljö för att utvärdera effekterna av miljösignaler, experimentella variabler eller farmakologiska agonister och antagonister på vaskulära egenskaper. Under många år har forskare använt den tensometriska myograftekniken för att mäta endotelfunktion och glatt muskelkontraktilitet som svar på olika medel. I denna rapport används ett tensometriskt myografsystem med liten volym för att mäta endotelfunktionen i den isolerade musaortan. Denna rapport fokuserar på hur tensomemetrisk myografi med liten volymkammare kan användas för att utvärdera endotelets funktionella integritet i små segment av en stor artär, såsom bröstkorgsaorta.
Introduction
Under de senaste decennierna har det lilla kammarmyografisystemet använts för att mäta reaktiviteten hos olika lager av blodkärlsväggar som svar på olika farmakologiska medel och neurotransmittorer i en ex vivo realtidsinställning. Vaskulär reaktivitet är en viktig komponent i ett friskt funktionellt blodkärl och är avgörande för regleringen av blodflöde och perfusion i perifer och cerebral vaskulatur1. Inom blodkärlsväggen är interaktionen mellan endotel- och glattmuskelskikt en viktig faktor för vaskulär ton, som också ständigt påverkas av strukturella förändringar i bindvävsskiktet som omger blodkärlsväggen (adventitia).
Endotelskiktet kontrollerar vasomotion genom att frigöra några vasodilaterande faktorer, inklusive kväveoxid (NO), prostacyklin (PGI2) och endotel-härledd hyperpolariserande faktor (EDHF), eller genom att producera vasokonstriktiva medel såsom endotelin-1 (ET-1) och tromboxan (TXA2)2,3,4. Bland dessa faktorer har NO studerats omfattande, och dess viktiga reglerande roller i andra kritiska cellulära funktioner som inflammation, migration, överlevnad och proliferation har citerats mycket i vetenskaplig litteratur 2,5.
Inom kärlbiologin har kammarmyografi gett vaskulära fysiologer och farmakologer ett värdefullt och pålitligt verktyg för att mäta endotelfunktion i ett tätt kontrollerat halvfysiologiskt system1. För närvarande finns det två olika myografsystem tillgängliga för forskare: tråd (eller stift) tensometrisk (isometrisk) myografi och tryckmyografi. I ett trådmyografisystem sträcker sig blodkärlet mellan två ledningar eller stift, vilket möjliggör isometrisk mätning av kraft- eller spänningsutveckling i blodkärlets vägg, medan tryckmyografi är en föredragen plattform för mätningar av vaskulär reaktivitet i små motståndsartärer, där förändringar i blodtrycket anses vara den främsta stimulansen för förändringar i vaskulär ton och vasomotion. Det finns en allmän överenskommelse om att för små motståndsartärer som mesenteriska och cerebrala artärer skapar tryckmyografi ett tillstånd som ligger närmare de fysiologiska förhållandena i människokroppen. Den lilla kammarens myograf kan användas för kärl med mycket små diametrar (200-500 μm) till mycket större kärl som aorta.
Medan trådmyografen är ett kraftfullt system för att registrera blodkärlsspänning under isometriska förhållanden, är tryckmyografen ett mer lämpligt system för att mäta förändringar i kärldiameter som svar på förändringar i isobariska förhållanden. Diameterförändringarna i kärlet som svar på förändringar i tryck eller flöde är mycket större i en liten muskelartär (arteriol) jämfört med stora elastiska artärer som aorta. Av dessa skäl anses tryckmyografen vara ett bättre verktyg för små blodkärl med betydande vasoreaktivitet1. En av de andra praktiska styrkorna med tensomemetrisk myografi med små volymer med flera kammare är att man kan urskilja bidraget från olika mekanismer till vaskulär reaktivitet genom att studera flera (upp till fyra) segment av samma artär och från samma djur för att minska variationen och producera robusta och avgörande data. Det är också relativt enkelt att installera och underhålla tekniskt. Fartyg av nästan vilken storlek som helst kan studeras med en trådmyograf. Det är en mer kostnadseffektiv lösning för att bedöma vaskulär funktion och är ett bra alternativ till tryckmyografi i experiment där längden på det dissekerade kärlet är för kort för tryckmyografprotokollet.
Denna rapport ger ett detaljerat protokoll för bedömning av endotelfunktionen i den isolerade musens bröstkorgsaorta-ring med hjälp av monteringsstift i den tensometriska myografitekniken med liten volymkammare med DMT-620 flerkammarmyografsystem (DMT-USA). Detta protokoll använder en 6 månader gammal manlig C57BL6-mus med en genomsnittlig vikt mellan 25-35 g. Lyckligtvis kan detta protokoll tillämpas på olika djurtyper och vikter, med tanke på det breda utbudet av kärltyper och diametrar som detta protokoll kan användas för.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla kirurgiska ingrepp och djurvård godkändes av Institutional Animal Care and Use and Care Committee (IACUC) vid Midwestern University (IACUC # AZ-3006, AZ-2936).
1. Buffertberedning
OBS: Även om HEPES fysiologiska saltlösningsbuffert (HEPES-PSS) är stabil vid 4 ° C i 7 dagar, rekommenderas att alla buffertar är nygjorda på dagen för varje experiment. Alla andra reagenser och agonister måste förberedas nyligen för varje experiment. HEPES-PSS-bufferten som används i detta protokoll är en väletablerad buffert för ex vivo-vaskulära studier som har visat sig vara cytoprotektiva i mer än 12 timmar samtidigt som kärlets vasodilaterande svar bevaras - huvudfokus för detta experimentella protokoll 6,7.
- Förbered HEPES-PSS-lösning (pH 7.4) enligt följande: Blanda 10 mmol / L HEPES, 6 mmol / L glukos, 1,5 mmol / L CaCl 2, 130 mmol / L NaCl, 4 mmol / L KCl, 4 mmol / L NaHCO3, 1,2 mmol / L MgSO 4, 1,2 mmol / L KH2 PO4 och 0,03 mmol / L EDTA.
- Förbered HEPES-PSS hög K + buffert. Detta är identiskt med HEPES-PSS-lösningen, förutom att den innehåller 5 mmol / L HEPES, 65 mmol / L NaCl, 10 mmol / L glukos, 1 mmol / L MgCl2, 80 mmol / L KCl och inte innehåller MgSO4 och EDTA.
2. Förberedelse av myografenhet
- Slå på och ställ in vattenbadet på 37 °C. Se till att vattennivån är lämplig.
- Placera två bägare märkta på lämpligt sätt i vattenbadet, en med 600 ml HEPES-PSS-lösning och en med 150 ml hög K + -lösning.
- Lufta en bägare på 300 ml HEPES-PSS-lösning med kälkgas (5%CO2 och 95% O2) i minst 10 min.
- Tillsätt 30 ml av den luftade HEPES-PSS-lösningen till ett 50 ml centrifugrör, märk på lämpligt sätt (bröstkorg, musidentifieringsnummer) och placera den på is. Håll den återstående luftade HEPES-PSS-lösningen på is som ska användas under aortadissektionsprocessen.
- Slå på myografenheten med fyra kammare; tillsätt 6 ml HEPES-PSS-lösning till varje myografkammare och ställ in värmen på 37 °C. Låt lösningen i varje kammare luftas (med karmosblandning) i 30 minuter och kontrollera att kamrarna har nått önskade 37 °C (använd denna väntetid för att dissekera musens aorta).
- Slå på myografens datainsamlingshårdvara och dator.
3. Isolering av musaorta
- Bedöva experimentmusen med 5% isofluraninandning och avliva genom cervikal dislokation (en 6 månader gammal manlig C57BL / 6J-mus används för denna demonstration).
- Lägg musen på ett kirurgiskt kort i ryggläge och säkra bilagorna till brädet med kirurgisk tejp.
- Spraya bukregionen med 70% alkohol så att pälsen är helt våt och eventuella lösa/torra hårstrån inte kommer in i snittet. Torka försiktigt bort överflödig lösning.
- Använd pincett för att lokalisera och isolera bukhuden som är sämre än bröstbenets xiphoidprocess.
- Skapa spänning genom att lyfta huden rakt upp. Gör ett trubbigt snitt med sax och ta bort den ytliga huden och exponera brösthålan.
- Lyft xiphoidprocessen och gör laterala snitt bara sämre än processen längs de subkostala marginalerna.
- Förläng de laterala snitten kranialt för att ta bort den främre delen av bröstkorgen.
- Ta bort bröstkorgen genom att göra ett trubbigt snitt genom ryggraden, under membranet och i nacken.
OBS: Forskare kan också ta bort aortan direkt från djuret, men man bör se till att skydda kärlet och spola det koagulerade blodet från aortan. Detta protokoll använder exemplet att ta bort bröstkorgen och försiktigt rengöra och dissekera aortan. Med övning kan denna metod utföras snabbt och effektivt och är fördelaktigt för att bevara den extra vävnaden för andra studier som immunhistokemi, histologi och western blotting. - Överför bröstkorgen till en klar silikonelastomerbelagd petriskål fylld med iskall luftad HEPES-PSS-buffert och fäst den på båda sidor.
OBS: Använd en silikonelastomersats (Materialtabell). Blanda bas och härdningsmedel (10:1 vikt), häll sedan i en petriskål i glas och låt härda i 24 timmar vid 25 °C. - Placera petriskålen under ett stereozoommikroskop, klipp försiktigt och ta bort hjärtat och fäst aorta från bröstkorgen och överför till en ren, klar silikonelastomerbelagd skål (figur 1) .
- Ta sedan försiktigt bort fett och bindväv och eventuellt koagulerat blod från aortan. Använd skarp, liten sax, dissekera och isolera hela aortan från bågområdet till den nedre delen av den nedåtgående aortan. Kom ihåg att aortabågen inte är lämplig för myografiexperiment men kan användas för histologiska studier.
- Använd kallluftad HEPES-PSS-lösning under hela dissektionen. Ändra lösningen var 10:e minut eller när sikten äventyras, vad som än kommer först. Det rekommenderas att varje aortaring monteras på myografkammaren inom 20 min efter dissektion (max 60 min).
4. Montering av aortasegmenten på myografkamrarna
- Skär den dissekerade aortan i fyra segment på 2 mm vardera med en skarp liten kirurgisk sax. Använd minilinjalen i skålen som referens.
- Placera myografkammaren under stereozoommikroskopet för att enkelt visualisera stiften och ställ in mikrometrarna så att stiften nästan vidrörs (figur 2).
- Se till att båda vävnadshållande stiften är ordentligt inriktade.
- Var uppmärksam och undvik att klämma aortan medan du monterar segmenten för att förhindra skador på endotelet.
- I kammare som redan innehåller 5 ml uppvärmd och luftad HEPES-PSS-buffert, skjut försiktigt vart och ett av de 2 mm aortasegmenten på de två monteringsstiften med pincett. Var mycket försiktig när du skjuter aortasegmenten över stiften. Endotelskiktet är mycket bräckligt och lossnar mycket lätt från den luminala sidan.
- Flytta långsamt isär stiften genom att rotera mikrometern moturs så att aortasegmentet inte glider av stiften när du placerar kammaren tillbaka i myografenheten (figur 3).
- Använd det tidigare kalibrerade okularet i dissekeringsmikroskopet för att mäta den sanna och exakta längden på den monterade aortaringen genom att placera linjalens början i ena änden av segmentet (markerad som vävnadsänd α1) och notera mätningen i den andra änden av aortasegmentet i okulära divisioner (markerad som vävnadsänd α2)8. Dessa värden kommer att användas under normaliseringsstegen i avsnitt 5.
- Återför varje myografkammare till enheten och börja lufta kamrarna vid 37 °C i 30 minuter.
OBS: De fyra segmenten av aortan kan användas som replikat för samma behandling, eller så kan varje segment av aortan användas samtidigt för olika experiment.
5. Normalisering
OBS: Ett normaliseringsförfarande är nödvändigt för att säkerställa att de experimentella förhållandena är korrekt standardiserade och att de insamlade uppgifterna är tillförlitliga och reproducerbara. "IC1 / IC100", eller "Normaliseringsfaktor", definieras som förhållandet mellan artärens inre omkrets vid vilken det är möjligt att registrera det maximala svaret på en vasokonstriktor (t.ex. 60 mM KCl) dividerat med den inre omkretsen vid vilken ett transmuralt väggtryck på 100 mm Hg (dvs. IC100) registreras. Genom att multiplicera IC100 med detta förhållande kan vi därför bestämma artärens inre omkrets vid vilken ett optimalt svar (dvs IC1) kan fastställas.
- Ställ in mikrometern så att stiften nästan vidrör.
- Ställ in krafterna på noll för alla myografkammare och låt den balansera i ytterligare 1-2 minuter.
- Anteckna den första diameteravläsningen från mikrometern. Detta är den position där klyftan mellan två stift anses vara noll (behövs för steg 5.7.).
- Öppna datainsamlingsprogramvaran Normaliseringsinställningar under DMT-rullgardinsmenyn; En ny skärm öppnas med följande inställningar och standardvärden:
Kalibrering av okularet (mm/div): 0,36
Måltryck (kPa): 13,3
IC1/IC100: 0,9
Medelvärdestid online (er): 2
Fördröjningstid(er): 60
Spela upp ljud när förseningen är klar (kryssruta)
Ljud (med rullgardinsmenyn eller bläddringsfunktionen) - Beroende på antalet segment väljer du rätt antal tillgängliga kanaler på skärmen och startar diagraminspelningen.
- Använd rullgardinsmenyn för att välja kanal av intresse; Normaliseringsskärmen visas.
- Ange de konstanta värdena i fönstren enligt följande: Vävnadsändpunkter α1; Vävnadens slutpunkter α2; Stiftets diameter: 40 μm; Mikrometeravläsningsvärde från den analoga mikrometerskalan.
- För att spela in den första punkten (det ursprungliga värdet på X eller X0), klicka på knappen Lägg till punkt . Efter en fördröjning på 60 s visas värdena för kraften och det effektiva trycket (ERTP) som motsvarar denna mikrometer, och rutan för mikrometeravläsningen blir aktiv och tillgänglig.
- Börja sträcka kärlet genom att vrida mikrometern moturs. Använd mikrometeravläsningsrutan för att ange värdet och klicka på knappen Lägg till punkt (det kommer att finnas en fördröjningstid på 60 s igen).
- Fortsätt sträcka kärlet och fortsätt att lägga till mikrometervärden tills värdet på Micrometer X1 ses, vilket är den beräknade mikrometerinställningen som används för att sträcka kärlet till dess IC1.
- Ställ in mikrometern på X1-värdet.
OBS: Den normaliserade (optimala) spänningen för en 6 månader gammal C57BL6-mus är 6 mN. - Efter normalisering, låt vävnaden vila och balansera i 30 min. Det finns inget behov av att ändra HEPES-PSS-lösningen i kamrarna vid denna tidpunkt.
OBS: Varje kammare kan hålla 8 ml lösning. Detta protokoll är skrivet med användning av 5 ml, vilket möjliggör full nedsänkning av kärlet och monteringsstiften. - Använd resten och jämviktstiden för att förbereda följande.
- Bered arbetsbeståndet av seriella acetylkolinutspädningar i destillerat vatten (RO-vatten) från lägsta till högsta koncentrationer enligt följande: 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM och 1 mM. Håll alla rör på is under experimentets varaktighet.
- Bered en 100 mM arbetslösning av N-nitro-L-argininmetylester (L-NAME) i dubbeldestillerat vatten och håll lösningen på is under hela experimentet.
- Förbered den submaximala dosen fenylefrin (10 μM) bestämd i en separat uppsättning experiment.
OBS: Jämviktsperioden är nödvändig för att blodkärlssegmentet ska kunna anpassa sig till den nya miljön i myografkammaren, återställa jongradienter och uppnå en stabil nivå av passiv spänning innan den utsätts för olika farmakologiska och mekaniska utmaningar.
6. Mätning av endotelberoende vasorelaxation i aortaringar
- I slutet av 30-minuters jämviktsperioden, dränera kamrarna och tillsätt 5 ml färsk, varm, luftad HEPES-PSS-lösning till varje kammare. Töm en kammare i taget för att minimera vävnadsexponering för luft. Tömning av kamrarna utförs med hjälp av en vakuumpump inställd på 60 cmHg och myografventilerna inställda på en 6 s fördröjning för att säkerställa avlägsnandet av 5 ml lösning.
- Om det behövs, justera kraftmätningarna för att läsa den optimala spänningen på 6 mN. Det är mycket viktigt att justera kraften till optimal spänning under varje inkubationsperiod, liksom före varje ny uppsättning experiment. Vila vävnaden i ytterligare 15-20 min.
- Öppna datainsamlingsprogramvaran, ändra spårningsnumren från 50: 1 till 500: 1 och tryck på Start. I detta skede kan den registrerade kraften för varje kammare ses i programvara.
- Omedelbart före starten av ett nytt experiment, var noga med att lägga till lämplig etikett på datainsamlingsprogramvaran.
- Töm kamrarna en gång till innan du tillsätter 5 ml hög K + -lösning till varje kammare. Detta är lämpligt för att testa livskraften hos aortavävnad och integriteten hos glattmuskelkontraktilsvaret på membrandepolarisering innan vävnaden används för något annat experimentellt protokoll. Detta hjälper till att avgöra om blodkärlssegmentet är användbart för ytterligare experiment.
- Töm kamrarna igen så snart kontraktilsvaret på den höga K + -lösningen når en platå för kraftgenerering (figur 4).
OBS: Lämna inte den höga K + -lösningen i kamrarna i mer än 3 minuter, eftersom det skulle skada vävnaden. - Tvätta vävnaden med HEPES-PSS-lösning 3x. Tillsätt 5 ml hög K + -lösning till varje kammare. Töm kamrarna så snart kontraktilsvaret på hög K + -lösning når en platå för kraftgenerering och tvätta vävnaden 3x med HEPES-PSS innan du låter vävnaden vila i ytterligare 15 minuter.
OBS: I vissa laboratorier utsätts blodsegmenten för en hög K + -lösning tre gånger i rad för att säkerställa blodkärlets variabilitet innan myografexperimenten inleds. I detta protokoll utsätts de nyligen isolerade aortasegmenten för en hög K + -lösning två gånger innan vävnaden används för ytterligare experiment. Det är viktigt att hålla detta konsekvent i alla experiment. - Använd medelvärdet av de två registrerade topparna av kraftutveckling (sammandragningskraft) som svar på en hög K + -lösning för att normalisera de registrerade värdena som svar på andra vasokonstriktor- och vasodilatormedel som används i experimentet.
- Vila vävnaden i 15-20 min.
- Pre-kontraktera aortasegmenten med vasokonstriktormedlet fenylefrin (PE) vid en redan fastställd submaximal dos (10 μM slutlig koncentration i kammaren).
OBS: Den submaximala dosen fenylefrin (10 μM) bestämdes i en separat uppsättning experiment, där aortasegment utsattes för ökande koncentrationer av fenylefrinlösning vid slutliga koncentrationer av 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM och 50 μM. Som ett resultat bestämdes att en slutlig koncentration av 10 μM fenylefrin kunde generera den submaximala sammandragningskraften (90% av den maximala kraften) i 2 mm aortasegment, vilket är precis innan sammandragningskraften når en platå. Anledningen till att använda den sub-maximala koncentrationen av fenylefrin är att undvika problem relaterade till aortavävnadsmättnad eller desensibilisering mot den vasokonstriktiva agonisten. - Låt den PE-inducerade kontraktionskurvan nå en platå för spänningsutveckling (kraft) (figur 5).
- På en platå av spänningsutveckling till fenylefrin, utför acetylkolindos-responskurvan genom att tillsätta 5 μL ökande doser av acetylkolinarbetsstamlösningar i 3 minuters intervall för att fastställa slutliga koncentrationer av acetylkolin i myografkammaren enligt följande: 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM och 1 μM (figur 6).
OBS: Efter att ha tillsatt varje dos acetylkolin, vänta i minst 3 min (för spänningen att nå en platå) innan du lägger till nästa dos. - Vid varje steg, pipettera acetylkolinstamlösningen in i kammaren mycket långsamt och långt från aortaringarna för att undvika vävnadsstörningar.
- Efter att ha slutfört dos-responsexperimentet, dränera kamrarna och tvätta aortasegmenten med varm och luftad HEPES-PSS-lösning 3x för att avlägsna eventuella återstående rester av läkemedlet.
- Vila vävnaden i 30 minuter innan du påbörjar nästa experimentsteg. Aortans livskraft kontrolleras före varje experimentellt steg med HEPES-PSS hög K + -lösning. Om alla förberedelse- och experimentsteg följs korrekt, kommer aortavävnadens livskraft att förbli densamma under hela experimentets varaktighet (4-6 h).
7. Effekter av generella hämmare av NO-produktion på endotelmedierad vasorelaxation
- Använd samma aortavävnad för denna del av experimentet efter noggrann tvättning och vila segmenten i minst 30 minuter.
OBS: Använd vilotiden på 30 minuter för att förbereda en 100 mM arbetslösning av N-nitro-L-argininmetylester (L-NAME) i dubbeldestillerat vatten och håll lösningen på is under hela experimentet. - Efter att ha vilat aortasegmenten i 30 minuter, dränera kamrarna och tillsätt färsk, varm hög K + (60 mM KCl) lösning till varje kammare.
OBS: Det är viktigt att aortavävnaden för varje del av experimentet utmanas med en hög K + -lösning minst en gång. Den registrerade kontraktionstoppen kommer att användas för att normalisera de data som samlats in under den delen av experimentet. - Töm kamrarna igen så snart sammandragningssvaret på hög K + -lösning når en platå och tvätta vävnaden med HEPES-PSS-lösning 3x.
- För att bedöma bidraget från NO-produktion till den observerade acetylkolininducerade vasorelaxationen (se avsnitt 6.), preinkubera i detta skede aortasegmenten med en allmän inhibitor av NO-produktion (L-NAME) genom att tillsätta 10 μL av den beredda 100 mM arbetsstamlösningen av L-NAME till varje myografkammare (innehållande 5 ml buffertlösning) för att uppnå en slutlig koncentration på 200 μM i varje myografkammare.
OBS: L-NAME är en icke-selektiv och potent hämmare av alla isoformer av NOS (ett enzym som är ansvarigt för NO-produktion), och därför anses det vara ett effektivt verktyg för att blockera produktionen av NO i blodkärlsväggen9. - Låt aortasegmenten vila under tiden före inkubationen med L-NAME (30 min).
- Tvätta inte vid denna tidpunkt.
- Utan att ta bort L-NAME, tillsätt den sub-maximala dosen fenylefrin (10 μM slutlig koncentration) till kammaren för att inducera aortakontraktion.
OBS: På grund av den hämmande verkan av L-NAME på endogen NO-produktion kommer den nyregistrerade toppen för fenylefrininducerad aortakontraktion att vara mycket högre än den initiala toppen som registrerades innan vävnaden inkuberades med L-NAME. Detta förväntas på grund av L-NAME: s effekt på basal NO-produktion i aortaväggen, vilket leder till högre kraftgenerering (på grund av högre kontraktil kraftgenerering av glatt muskulatur). - Vänta tills den fenylefrininducerade sammandragningskurvan når en platå för spänningsutveckling (kontraktil kraft).
- Vid denna tidpunkt tillsätt acetylkolin till myografkammaren för att uppnå en slutlig koncentration av 500 nM (detta är den submaximala koncentrationen av acetylkolin som fastställdes under experimenten som beskrivs i avsnitt 5. i protokollet).
- Vänta några minuter för att registrera eventuella förändringar i kraftutvecklingen tills den bildade platån är stabil (figur 7).
OBS: På grund av den hämmande verkan av L-NAME på endotelskiktets förmåga att producera NO som svar på acetylkolin, Det förväntas inte se några förändringar i registrerad kraftgenerering som svar på fenylefrin, eftersom aorta endotel NOS (eNOS) inte kan generera NO som svar på acetylkolin ansökan. - Töm kamrarna och tvätta vävnaden med varm, luftad HEPES-PSS-lösning 3x.
8. Bidrag från endotelskiktet till aorta vasorelaxation
- För att understryka endotelskiktets roll i aorta vasorelaxation, testa acetylkolininducerad vasorelaxation i endotel-denuderade aortasegment, där endotelskikten avlägsnas.
- Placera myografkammaren under mikroskopet och passera försiktigt en liten tråd (samma tråd som används för trådmyografi kan användas här) genom aortans lumen. Flytta försiktigt tråden genom lumen (mild cirkulär rörelse) under en kort tid. Detta räcker för att ta bort endotelet eller intima.
- Skär aortan i 2 mm aortaringar och montera dessa ringar på myografkammaren som beskrivits tidigare.
- Ställ in den optimala spänningen på 6 mN och låt vävnaden vila i 30 min i luftad, varm HEPES-PSS-buffert
- I slutet av jämviktsperioden på 30 minuter dränerar du kamrarna och tillsätter 5 ml färsk, varm, luftad HEPES-PSS-lösning till varje kammare.
- Nollställ kraften för alla myografkammare genom att vrida mikrometern moturs.
- Rotera långsamt mikrometern moturs för att öka avståndet mellan stiften tills den registrerade kraften når önskad optimal spänning för musaortan (6 mN för C57BL / 6J musaorta). Vila vävnaden i ytterligare 15-20 min vid optimal spänning (6 mN).
- Töm kamrarna 1x mer innan du tillsätter 5 ml hög K + -lösning till varje kammare.
- Töm kamrarna igen så snart sammandragningssvaret på hög K + -lösning når en platå och tvätta vävnaden med HEPES-PSS-lösning 3x. Vila vävnaden i 15-20 min
- Pre-kontrakt aorta segmenten med vasokonstriktormedlet fenylefrin (10 μM slutlig koncentration i kammaren).
OBS: På grund av avlägsnandet av endotelet minskar basal NO-produktionen i aortaväggen avsevärt; Därför förväntas toppen för fenylefrininducerad sammandragning (toppen av kraftgenerering) vara högre i aortavävnad som saknar endotelskiktet. - När den fenylefrininducerade kraften når en platå, tillsätt den submaximala koncentrationen av acetylkolin till myografkammaren för att uppnå en slutlig koncentration av 500 nM.
OBS: Om avlägsnandet av endotelskiktet görs ordentligt kommer det inte att ske några förändringar i den registrerade fenylefrininducerade kraften, eftersom den acetylkolininducerade NO-produktionen av endotelet kommer att ha minskat på grund av avlägsnandet av endotelskiktet. Det inspelade spåret kommer att vara mycket likt det som observerats i närvaro av L-NAME (avsnitt 7.). - Vänta i 3 minuter för att säkerställa att den registrerade platån för fenylefrininducerad kraftutveckling inte förändras innan du avslutar experimentet (figur 8).
OBS: Om appliceringen av acetylkolin orsakar någon droppe i fenylefrininducerad sammandragning under platån, är detta en indikation på att endotelskiktet inte har tagits bort helt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det tensometriska myografiprotokollet för små kammare som förklaras här är standardmetoden för att mäta vaskulär reaktivitet i små och stora artärer och möjliggör samtidiga mätningar av vaskulär reaktivitet i upp till fyra blodkärlssegment från samma experimentella lilla laboratoriedjur. I den här rapporten använder vi specifikt systemet för att mäta endotelfunktion i den isolerade musaortan (figur 1). I detta protokoll monteras isolerade aortasegment på en liten organkammare (figur 2) mellan två små stift av rostfritt stål (figur 3). Myografkammaren kan rymma upp till 8 ml buffertlösning och tillhandahålla en halvfysiologisk miljö för de isolerade kärlen under experimentens varaktighet. Det är mycket viktigt att varje enskilt segments livskraft testas och verifieras före varje experiment. Standardprotokollet för att fastställa integriteten och livskraften hos varje isolerat kärlsegment är att utmana vävnaden med en hög koncentration av kaliumklorid för att inducera depolarisering av glattmuskelmembran. I scenariot att det isolerade kärlet är friskt och lyhört skulle vi kunna registrera kontraktil kraftgenerering på displayen (figur 4). Toppen av den registrerade kraften används senare för att normalisera kraftgenereringen för samma segment som svar på de agonister som används under protokollet (t.ex. fenylefrin). För att mäta endotelmedierad vasorelaxation är det nödvändigt att förkontraktera aortavävnaden med den submaximala koncentrationen (10 μM) av fenylefrin, vilket orsakar glatt muskelmedierad sammandragning och kraftgenerering (Figur 5). När den fenylefrininducerade sammandragningen når en platå (figur 6) appliceras ökande doser acetylkolin i flera steg för att uppnå maximal vasorelaxation i det isolerade segmentet (figur 6). Nivån av kärlavslappning är en indirekt mätning av endotelmedierad kväveoxidproduktion. För att ytterligare bekräfta att acetylkolininducerad vasorelaxation i aortaringar beror på produktionen av kväveoxid, förbehandlas aortasegment med en allmän hämmare av kväveoxidproduktion (200 μM L-NAME) i 30 minuter före fenylefrin ansökan. Som visas i figur 7, L-NAME är kunna helt blockera acetylkolin-inducerad vasorelaxation i den pre-kontrakterade aorta, belyser det faktum att acetylkolin inducerar aorta vasorelaxation genom att öka kväveoxid produktion. Å andra sidan blockerar avlägsnandet av endotelskiktet från aortasegmenten också acetylkolininducerad vasorelaxation, vilket understryker den roll som endotelet spelar vid blodkärlsavslappning (Figur 8).
Figur 1: Grov anatomisk bild av hjärtat, aortaroten och fallande aorta isolerad från en 6 månader gammal kontrollmus. Efter att ha tagit bort ribbburet från musen isoleras hjärtat och aortan från bröstkorgen och överförs till en ren silikonelastomerbelagd petriskål. Innan du isolerar aortan är det viktigt att ta bort allt fett och bindväv och eventuell blodpropp från aortans lumen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: En representativ bild av en kammare i myografenheten som visar monteringsstiften på 200 μm. Som visas rör de två stiften inuti myografkammaren knappt. Innan du använder kammaren är det viktigt att se till att stiften är ordentligt inriktade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Förankring av aortasegmenten i myografkammaren. Ett 2 mm musaortasegment isolerat från en 6 månader gammal C57BL / 6-mus hålls av två stift inuti en myografkammare. Detta uppnås genom att försiktigt skjuta aortan på de två monteringsstiften med pincett. Den röda prickade rutan visar den inzoomade bilden av 2 mm aortasegmentet som är monterat mellan två stift inuti myografkammaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Aortakontraktion på grund av depolarisering av glattmuskelmembran. Representativ bild som visar spåret för musaortakontraktion (kraftgenerering) som svar på en hög koncentration av K + (60 mM KCl) som skulle inducera depolarisering och sammandragning av glattmuskelmembran inom det mediala skiktet i aortan. Appliceringen av hög K + -lösning följs omedelbart av tre på varandra följande tvättar med varm, luftad HEPES-PSS-lösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Aortakontraktion som svar på det vasokonstriktiva medlet fenylefrin. Representativt myografspår som visar kraftgenerering (sammandragning) av aortaringen som svar på den submaximala koncentrationen av fenylefrin (10 μM). Som visat når toppen av fenylefrininducerad sammandragning så småningom en platå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Dos-respons effekter av acetylkolin på den förkontrakterade aortaringen. Representativt myografspår som visar dos-respons (50 pM-1 μM) vasodilaterande effekt av vasodilatorns neurotransmittor acetylkolin på en 2 mm pre-kontrakterad aortaring. Aortaringen är förkontrakterad med 10 μM fenylefrin före applicering av acetylkolin. Den första dosen acetylkolin tillsätts när den fenylefrininducerade spänningen når en platå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Effekter av en allmän hämmare av NO-produktion (L-NAME) på endotelmedierad vasorelaxation i musaorta. Representativt myografspår som visar att preinkubation av aortasegment med en allmän hämmare av NO-produktion (L-NAME, 200 μM slutlig koncentration) blockerar acetylkolininducerad vasodilatation i en förkontrakterad aortaring. Detta beror på hämningen av NO-produktion av endotelet på grund av den hämmande verkan av L-NAME på eNOS. Acetylkolin tillsattes till det förkontrakterade aortasegmentet vid den submaximala koncentrationen av 500 nM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Effekter av mekanisk borttagning av endotel på endotelmedierad vasorelaxation i musaorta. Representativt myografspår som visar att avlägsnande av endotelet från aortasegment med hjälp av tråddenudation blockerar acetylkolininducerad vasodilatation i en förkontrakterad aortaring. Detta beror på hämningen av endotelmedierad vasorelaxation. Acetylkolin tillsattes till det förkontrakterade aortasegmentet vid den submaximala koncentrationen av 500 nM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Området vaskulär biologi är starkt beroende av verktyg som hjälper forskare att bedöma blodkärlsväggens funktionella och strukturella integritet. Det kräver också särskild uppmärksamhet på de direkta och indirekta interaktionerna mellan de tre lagren av blodkärl: intima, media och adventitia. Bland dessa tre lager bildas intima av ett monolager av endotelceller och har en mycket viktig funktion för att reglera vaskulär hälsa och hemostas.
Det är väl etablerat att eventuella skador på endotelskiktet kan påverka dess förmåga att frigöra NO och andra vasodilaterande faktorer negativt, vilket leder till dysreglering av vaskulär funktion, vilket observeras vid olika vaskulära störningar såsom ateroskleros, aneurysm och vaskulit10,11,12. För att förstå de underliggande mekanismerna som styr normal endotelfunktion och bedöma endotelets vasodilaterande funktion och integritet i kärlväggen är det absolut nödvändigt att använda ett standardexperimentellt system som efterliknar de fysiologiska förhållandena in vivo.
För stora artärer, såsom aorta, är den lilla kammarens tensometriska (isometriska) myografi mycket erkänd som ett pålitligt verktyg som skapar de bästa tillgängliga, nästan fysiologiska förhållandena för blodkärlet i en ex vivo-inställning . Systemet gör det också möjligt att bibehålla vävnadens livskraft under en betydligt lång tid (upp till 6-8 timmar) i laboratoriemiljön, vilket gör tekniken till ett värdefullt och mångsidigt verktyg. En annan fördel är att myografkammaren gör att blodkärlsringarna kan behållas och återanvändas för back-to-back olika experiment, vilket gör det till ett kostnadseffektivt tillvägagångssätt samtidigt som behovet av ett stort antal experimentella möss minskar. Upp till fyra blodkärlssegment kan testas samtidigt med hjälp av ett myografsystem med fyra kammare, vilket ökar konsistensen samtidigt som variationerna mellan experiment minskar.
Olika farmakologiska och mekaniska verktyg kan användas för att studera endotelskiktets funktion i blodkärl. Den viktigaste markören för ett funktionellt endotel är den normala produktionen av NO, vilket är känt som det viktigaste vasodilaterande medlet som produceras och frigörs av endotelskiktet. Endotelial dysfunktion är huvudsakligen förknippad med en signifikant minskning av NO-produktionen och har visat sig vara involverad i utvecklingen av olika vaskulära störningar såsom högt blodtryck, trombos och åderförkalkning.
Inom kärlbädden styrs NO-produktionen huvudsakligen av förändringar i blodflöde och blodtryck, eller av andra intracellulära händelser som kan leda till förändringar i cytoplasmatisk kalciumkoncentration eller aktivering av signalvägar som svar på hormoner och tillväxtfaktorer13,14. Förändringar i NO-produktion anses vara en av de tidiga och pålitliga markörerna för endotelial dysfunktion, och de är vanligtvis detekterbara tidigt under utvecklingen av kardiovaskulära störningar. Oavsett sjukdomsmodell är vaskulära biologer mycket intresserade av verktyg och analyser som möjliggör mätning av endotelfunktion. Det är särskilt viktigt att man kan skilja mellan bidraget från olika lager av blodkärlet med hjälp av en plattform som efterliknar de fysiologiska förhållandena.
I en liten kammarmyograf kan forskare använda farmakologiska och mekaniska verktyg för att mäta endotelfunktion i en tätt kontrollerad miljö. Inuti myografkammaren skapas en konstgjord miljö som kan stödja blodkärlets normala funktion. I en sådan artificiell miljö, eftersom de isolerade blodkärlssegmenten inte stöds av den omgivande bindväven och andra organ, är det viktigt att bestämma den optimala passiva spänningen vid vilken de isolerade segmenten kan generera maximal möjlig sammandragning som svar på vasopressorer. Vid optimal spänning kan man mäta det normala maximala kontraktila svaret på vasokonstriktionsmedel såsom fenylefrin eller noradrenalin för att testa den strukturella och funktionella integriteten hos det glatta muskelskiktet i blodkärlsväggen. I laboratoriet bestämdes att den passiva spänningen på 6 mN är en korrekt spänning för 2 mm musaortasegment15. Den optimala passiva spänningen måste dock bestämmas för olika typer av artärer hos olika arter16.
Dessutom, innan du utför några experiment med isolerade blodkärl, är det absolut nödvändigt att testa livskraften hos isolerade ringar för att se till att de uppfyller inklusions- och uteslutningskriterierna för livskraftig och användbar vävnad. Detta uppnås vanligtvis genom att de isolerade ringarna utsätts för K+ -lösning med hög koncentration (60 mM KCl). Detta resulterar i depolarisering av glattmuskelmembranet på grund av öppningen av spänningsstyrda kalciumkanaler (VGCC), vilket leder till glatt muskelkontraktion och aorta vasokonstriktion. Denna metod används för att validera aortasegmentens livskraft innan dessa segment används för ytterligare experiment.
Å andra sidan kan vasodilaterande medel såsom acetylkolin användas för att testa endotelskiktets funktionella egenskaper. Om endotelskiktet är intakt och funktionellt kan en submaximal koncentration av acetylkolin inducera avslappning i ett förkontrakterat blodkärlssegment17. Storleken på acetylkolininducerad avslappning är en indikation på nivån av NO-frisättning från endotelskiktet. Eventuella skador på endotelskiktet (mekaniskt eller funktionellt) kommer att påverka NO-produktionen och kärlets vasodilaterande svar. I detta protokoll visar de tillhandahållna uppgifterna att acetylkolin kan inducera avslappning i den förkontrakterade musaortan på ett dosberoende sätt, med submaximal avslappning uppnådd vid den slutliga koncentrationen av 500 nM (Figur 6).
I vissa experiment är forskare intresserade av att mäta glatt muskulaturens direkta svar på vasodilatorn NO. Eftersom fokus för sådana experiment endast är på glattmuskelfunktion finns det ett protokoll på plats som gör det möjligt för forskare att kringgå endotelbidraget genom att ta bort (förneka) endotelskiktet från blodkärlssegmentet. Endotelet kan avlägsnas genom olika metoder, inklusive luft, rullning mellan fingrarna eller avlägsnande med tråd. I sådana experimentella miljöer utsätts det denuderade blodkärlet (utan endotelskikt) för NO-givare såsom nitroglycerin och natriumnitroprussid. Detta gör det möjligt att avgöra om den glattmuskelcykliska GMP-proteinkinas G-signalvägen som svarar på NO är intakt och funktionell 7,18. Detta manuskript förklarade hur avlägsnandet av endotelskiktet i det isolerade aortasegmentet helt blockerar acetylkolinvasodilaterande effekter, vilket belyser vikten av NO-frisättning vid blodkärlsavslappning och vasodilatation (Figur 8).
Medan tråd- och tensometriska myograftekniker har stor nytta i vaskulära biologiska experiment, är det värt att notera de potentiella begränsningarna. Specifikt har det tensometriska systemet vävnadsstorleksbegränsningar (dvs mindre vaskulatur). Dessutom tillåter denna tekniks ex vivo-natur inte manipulering av det intraluminala trycket och flödet för mer exakt efterlikning av in vivo vaskulär funktion och hemodynamiska parametrar. Tryckmyografinställningar skulle i själva verket redogöra för dessa variabler och simulera vaskulär dynamik i realtid samtidigt som det möjliggör användning av mindre motståndsartärer. Dessutom kan trådmyografexperiment inte helt replikera fysiologiska förhållanden eller exakt modellera interaktionerna mellan cirkulerande blod, kärlväggar och omgivande vävnad, som också spelar viktiga roller för att reglera vaskulär funktion i kroppen.
Oavsett det experimentella protokoll som används i myografiexperimenten eller den valda vasokonstriktorn / vasodilatorn i experimentet, ger det lilla kammarens myografisystem en pålitlig, reproducerbar och stabil halvfysiologisk plattform för mätning av blodkärlsreaktivitet och funktionell integritet. Även om fokus i denna rapport endast var på den grundläggande mätningen av endotelfunktionen, kan myografisystemet användas för att bedöma många andra funktionella egenskaper hos blodkärlet, såsom stress / töjningsförhållandet, vaskulär väggstyrka, bristningspunkt och passiv och aktiv sammandragning för att nämna några. Detta belyser värdet av myografsystemet som ett tillförlitligt verktyg inom vaskulär biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av finansiering från National Institutes of Health (R15HL145646) och Midwestern University College of Graduate Studies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
References
- Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Lerman, A., Zeiher, A. M.
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Galley, H. F., Webster, N. R.
- Orita, H., et al. In vitro evaluation of phosphate, bicarbonate, and Hepes buffered storage solutions on hypothermic injury to immature myocytes. Cardiovascular Drugs and Therapy. 8 (6), 851-859 (1994).
- Liu, Y. H., Bian, J. S. Bicarbonate-dependent effect of hydrogen sulfide on vascular contractility in rat aortic rings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (4), 866-872 (2010).
- Griffiths, K., Madhani, M. The use of wire myography to investigate vascular tone and function. Methods in Molecular Biology: Atherosclerosis. 2419, 361-367 (2022).
- Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): Requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. British Journal of Pharmacology. 118 (6), 1433-1440 (1996).
- Bacon, P. A. Endothelial cell dysfunction in systemic vasculitis: New developments and therapeutic prospects. Current Opinion in Rheumatology. 17 (1), 49-55 (2005).
- Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: Current concepts and clinical implications. Frontiers in Medicine. 8, 798958 (2021).
- Mikolajczyk, K., et al. The important role of endothelium and extracellular vesicles in the cellular mechanism of aortic aneurysm formation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13157 (2021).
- Vallance, P., Hingorani, A. Endothelial nitric oxide in humans in health and disease. International Journal of Experimental Pathology. 80 (6), 291-303 (1999).
- Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris, C., Papageorgiou, N., Stefanadis, C. The role of nitric oxide on endothelial function. Current Vascular Pharmacology. 10 (1), 4-18 (2012).
- Gibson, C., et al. Mild aerobic exercise blocks elastin fiber fragmentation and aortic dilatation in a mouse model of Marfan syndrome associated aortic aneurysm. Journal of Applied Physiology. 123 (1), 147-160 (2017).
- Xiao, X., Ping, N. N., Li, S., Cao, L., Cao, Y. X. An optimal initial tension for rat basilar artery in wire myography. Microvascular Research. 97, 156-158 (2015).
- Chung, A. W., Yang, H. H., Yeung, K. A., van Breemen, C. Mechanical and pharmacological approaches to investigate the pathogenesis of Marfan syndrome in the abdominal aorta. Journal of Vascular Research. 45 (4), 314-322 (2008).
- Zhong, C., et al. Age impairs soluble guanylyl cyclase function in mouse mesenteric arteries. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11412 (2021).
