Summary
여기에서는 물에서 항생제 내성 박테리아의 분리 및 식별과 항생제 내성 유전자(ARG)의 분자 특성 분석을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 배양 기반 및 비배양 기반(메타게놈 분석) 기술을 사용하면 인도 뭄바이의 담수에 존재하는 다양한 ARG의 총 박테리아 다양성과 총 풀에 대한 완전한 정보를 얻을 수 있습니다.
Abstract
담수 체와 관련된 미생물총을 통한 항생제 내성(AR)의 개발 및 확산은 주요 글로벌 건강 문제입니다. 본 연구에서는 기존의 배양 기반 기술과 고처리량 배양 독립적 메타게놈 접근 방식을 모두 사용하여 담수 샘플을 수집하고 총 박테리아 다양성 및 AR 유전자(ARG)와 관련하여 분석했습니다. 이 논문은 담수 샘플에서 전체 및 항생제 내성 배양 가능한 박테리아를 열거하고 배양 가능한 분리 물에서 표현형 및 유전형 내성을 측정하기위한 체계적인 프로토콜을 제시합니다. 또한, 우리는 배양 불가능한 박테리아를 포함한 전체 박테리아 다양성의 식별과 수역에서 다른 ARG (resistome)의 총 풀을 식별하기 위해 담수 샘플에서 추출한 전체 메타 게놈 DNA의 전체 메타 게놈 분석의 사용을보고합니다. 이러한 상세한 프로토콜에 따라 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU / mL 범위에서 높은 항생제 내성 박테리아 부하를 관찰했습니다. 대부분의 분리주는 세포탁심, 암피실린, 레보플록사신, 클로람페니콜, 세프트리악손, 겐타마이신, 네오마이신, 트리메토프림 및 시프로플록사신을 포함한 여러 테스트된 항생제에 내성이 있었으며 다중 항생제 내성(MAR) 지수는 ≥0.2로 분리균주에서 높은 수준의 내성을 나타냅니다. 16S rRNA 시퀀싱은 폐렴 클렙시엘라와 같은 잠재적인 인간 병원체와 코마모나스 종, 마이크로코커스 종, 아르트로박터 종 및 아에로모나스 종과 같은 기회주의적 박테리아를 확인했습니다. 분리 물의 분자 특성 분석은 blaTEM, blaCTX-M (β- 락탐), aadA, aac (6 ') -Ib (아미노 글리코 시드) 및 dfr1 (트리 메토 프림)과 같은 다양한 ARG의 존재를 보여 주었으며, 이는 또한 전체 메타 게놈 DNA 분석에 의해 확인되었다. 항생제 유출 펌프를 암호화하는 다른 ARGs의 높은 유병률-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-락타마제-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자 catB10, 및 리팜피신 내성 유전자 rphB-메타게놈 DNA에서도 검출되었다. 이 연구에서 논의된 프로토콜의 도움으로 다양한 AR 표현형 및 유전형 특성을 가진 수인성 MAR 박테리아의 존재를 확인했습니다. 따라서 전체 메타게놈 DNA 분석은 수역의 전반적인 AR 상태를 결정하기 위해 기존의 배양 기반 기술에 보완적인 기술로 사용될 수 있습니다.
Introduction
항생제 내성 (AMR)은 가장 시급한 글로벌 문제 중 하나로 확인되었습니다. AMR의 급속한 진화와 전 세계적인 확산은 이와 관련된 건강 비용 측면에서 인간의 건강과 세계 경제에 대한 가장 큰 위협 중 하나입니다1. 항생제의 남용과 오용은 AR의 증가로 이어졌습니다. 이것은 COVID-19 대유행에 의해 강조되었으며, 그 동안 많은 경우 관련 2 차 감염의 치료가 영향을받은 환자의 AMR로 인해 크게 손상되었습니다2. 인간에 의한 항생제의 직접적인 사용 / 오용 외에도 농업 및 축산업에서 항생제의 남용 및 오용과 수역을 포함한 환경으로의 부적절한 배출이 주요 관심사입니다3. 박테리아에서 새로운 내성 특성과 다제 내성의 증가는 AR의 발달과 보급으로 이어지는 요인에 대한 더 나은 이해의 필요성을 시급히 강조합니다. 플라스미드와 같은 이동성 유전 요소에 종종 여러 AR 유전자 (ARG)를 운반하는 여러 항생제 내성 박테리아는 이러한 내성 유전자를 잠재적 인 인간 병원체를 포함한 비 내성 미생물로 전달할 수 있으므로 최후의 수단 항생제로도 치료할 수없는 슈퍼 버그가 출현 할 수 있습니다4. 이러한 여러 항생제 내성 박테리아는 물 생태계에 존재하는 경우 물고기, 게 및 연체 동물과 같은 오염 된 수성 식품의 섭취를 통해 인간의 장에 직접 들어갈 수 있습니다. 이전 연구에 따르면 자연적으로 발생하는 수계에서 AR 박테리아의 확산은 식수를 포함한 다른 물 공급에도 도달 할 수 있으므로 인간 먹이 사슬에 들어갈 수 있습니다 5,6,7.
본 연구의 목적은 인도 뭄바이의 수역에 존재하는 총 박테리아 다양성 및 다양한 ARG의 총 풀에 대한 완전한 정보를 얻기 위해 배양 기반 및 비 배양 기반 (전체 메타 게놈 분석) 기술의 조합을 사용하는 포괄적 인 프로토콜을 제공하는 것입니다. 전통적으로 배양 기반 기술은 수역의 박테리아 다양성을 연구하는 데 사용되었습니다. 배양 가능한 미생물은 모든 틈새 시장에서 전체 미생물총의 작은 비율에 불과하므로 박테리아 다양성의 전반적인 상태와 모든 샘플에 만연한 다양한 내성 특성을 더 잘 이해하려면 다양한 배양 기반 및 배양 독립적 기술을 함께 사용해야 합니다. 이러한 강력하고 신뢰할 수 있는 배양 독립적 기술 중 하나는 전체 메타게놈 DNA 분석입니다. 이 고 처리량 방법은 박테리아 다양성 또는 다양한 ARG 8,9의 기능 주석에 대한 다양한 연구에서 성공적으로 활용되었습니다. 이 기술은 메타게놈(샘플의 전체 유전 물질)을 다양한 분석을 위한 출발 물질로 사용하므로 배양 독립적입니다. 본 연구의 프로토콜은 물 샘플에서 전체 박테리아 다양성 및 다양한 ARGs(resistome)에 대한 정보를 얻기 위해 전체 메타게놈 DNA 분석에 사용될 수 있다.
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Protocol
1. 샘플 수집 및 처리
- 샘플 수집
- 멸균 시료 용기에 적절한 양의 물 시료를 수집하여 용기의 3/4 이하가 채워지지 않도록하십시오.
- 수집 후 가능한 한 빨리 무균 조건에서 샘플을 실험실로 운반하고 즉시 처리하십시오.
- 샘플 처리
- 멸균 모슬린 천을 통해 물 샘플을 무균 여과하여 미립자 물질을 제거합니다.
- 추가 분석을 위해 여과된 물의 적절한 연속 희석을 수행합니다.
2. 총 박테리아 부하 및 항생제 내성 박테리아 수 추정
- 총 박테리아 부하의 결정
- R2A 한천 18.12g, 변성 분말을 이중 증류수 1,000mL에 현탁하고 가열하여 용해시킵니다. 용해된 혼합물을 121°C, 15psi에서 20분 동안 오토클레이브합니다. 적절한 양의 오토클레이브 혼합물을 멸균 페트리 플레이트에 부어 R2A 한천, 변형 플레이트를 준비합니다(예: 90mm 멸균 페트리 플레이트에 약 20mL의 오토클레이브 멸균 배지 추가).
- 여과된 물 샘플의 적절한 희석액 100μL를 R2A 한천에 고르게 펴고 매체가 응고되면 수정된 플레이트에 뿌립니다. 실험을 반복적으로 수행하십시오.
- 위의 모든 플레이트를 35-37 ° C에서 48 시간 동안 배양합니다 (분리에 사용되는 배지에 따라 온도 및 배양 시간이 다름).
- 방정식 (1)을 사용하여 밀리리터당 집락 형성 단위(CFU/mL)로 총 박테리아 부하를 표현합니다.
(1)
- AR 박테리아 수 측정
- 2.1.1-2.1.4 단계를 따르십시오. 그러나 R2A 한천, 변형 플레이트 대신 R2A 한천, 수정 플레이트는 5 가지 항생제, 즉 세포 탁심 (3 μg / mL), 시프로플록사신 (0.5 μg / mL), 에리스로 마이신 (20 μg / mL), 카나마이신 (15 μg / mL) 및 반코마이신 (3 μg / mL).
- 2.2.1단계에서 언급한 최종 항생제 농도를 달성하기 위해 20mL의 멸균 용융 R2A 한천, 변형된(용융된 R2A 한천의 온도로, ≤40°C에서 수정된) 2mL가 포함된 튜브에 항생제를 별도로 추가합니다.
- 균일하게 혼합하기 위해 소용돌이 치고 한천이 고형화되기 전에 멸균 페트리 플레이트에 붓습니다. 실험을 반복적으로 수행하십시오.
- 위의 모든 플레이트를 35-37 ° C에서 48 시간 동안 배양합니다 (다른 배지를 사용하는 경우 온도 및 배양 시간이 다를 수 있음).
- 품질 관리 및 항생제의 효능 확인을 위해 대장균 ATCC 25922 및 황색포도상구균 ATCC 29213 균주의 박테리아 현탁액 100μL를 각각의 항생제 함유 R2A 한천, 변형 플레이트에 퍼뜨립니다(접종에 사용된 신선한 배양의 밀도가 600nm에서 OD = 0.5인지 확인).
- 2.1.4단계에 설명된 대로 CFU/mL 측면에서 항생제 내성 박테리아 수를 결정합니다.
- 분리 물의 글리세롤 재고
- 형태학적으로 구별되는 AR 콜로니를 선택합니다.
- 단일 단리된 콜로니를 각각의 항생제를 함유하는 멸균 루리아-베르타니 브로스 2 mL에 현탁시킨다(예를 들어, 콜로니가 세포탁심이 함유된 플레이트로부터 선택된 경우, 단계 2.3.1로부터의 콜로니를 각각의 농도로 세포탁심이 함유된 멸균 루리아-베르타니 브로스에 접종한다).
- 접종된 튜브를OD600 이 0.5에 도달할 때까지 80rpm에서 37°C에서 인큐베이션한다.
- 무균 조건 하에 단계 2.3.3으로부터의 배양 현탁액 750 μL를 멸균된 100% 글리세롤 250 μL에 혼합함으로써 분리물의 글리세롤 스톡을 준비한다.
- 추가 분석이 있을 때까지 글리세롤 스톡을 -80°C에서 보관하십시오.
참고: 글리세롤 스톡에서 배양물을 되살리려면 글리세롤 스톡을 4°C에서 해동합니다. 이 스톡의 루프를 각 항생제가 들어 있는 멸균 Luria-Bertani 브로스 2mL에 접종하고 성장시킵니다.
(1)3. 16S rRNA 유전자 시퀀싱에 의한 배양 가능한 박테리아 확인
- PCR을 위한 분리물로부터 DNA 주형의 제조
참고: 박테리아로부터 조질 DNA를 분리하기 위한 PCR용 DNA 주형의 제조에 대해 설명된 프로토콜은 Carlson et al.10에 의해 제공됩니다.- 멸균 이쑤시개를 사용하여 페트리 플레이트에서 자라는 분리 물의 단일 격리 된 순수한 식민지를 취하십시오. 박테리아 콜로니를 멸균 미세 원심분리 튜브의 멸균 이중 증류수 100μL에 현탁하고 10분 동안 끓입니다.
- 현탁액을 10,000×g에서 2 분 동안 원 심분리하여 파편을 펠릿화하고 상청액을 새로운 멸균 미세원심분리 튜브로 옮겨 원유 DNA 주형으로 사용합니다.
- 16S rRNA 유전자의 V3 영역의 표적 PCR 증폭 및 염기서열분석
- 표 1에 언급된 바와 같이 PCR 증폭을 위해 PCR 튜브에서 40 μL의 반응 혼합물을 준비한다.
알림: DNA 준비는 오염 가능성을 최소화하면서 얼음 블록에서 수행해야합니다 (시약을 취급하는 동안 장갑을 착용하고 70 % 에탄올로 작업 표면을 철저히 청소하십시오). - 튜브를 열 블록에 놓고 PCR 열 순환기에서 적절한 프로그램을 실행합니다. 표준화된 PCR 사이클링 조건 및 16S rRNA 유전자의 V3 영역의 증폭을 위한 프라이머 정보는 표 2 를 참조한다.
- 앰플리콘을 분해하고 시각화하기 위해, 아가로스 겔 전기영동(AGE)을 수행한다. 증폭된 PCR 산물 10μL와 6x 겔 로딩 완충액 2μL(표 3)를 혼합하고, 이 혼합물을 1.5% 아가로스 겔(100mL의 1x TAE 완충액[표 3]에 1.5g의 아가로스 분말 100mL에 용해)의 웰에 로드하고(100mL의 10mg/mL 에티듐 브로마이드(EtBr) 5μL를 함유하는 아가로스 겔 100mL에 0.5μg/mL EtBr의 최종 농도가 되도록 합니다.
주의 : EtBr은 강력한 발암 물질입니다. EtBr 및 EtBr이 포함된 젤을 취급하는 동안 항상 장갑을 착용해야 합니다. - 앰플리콘의 크기를 추정하기 위해 DNA 사다리를 추가합니다.
- TAE 탱크 버퍼에서 80-100 V에서 겔의 전기 영동을 수행하십시오.
- 추적 염료가 겔의 3/4을 실행하면 전기 영동을 중지하고 UV 투과 조명기 아래에서 앰플리콘 밴드를 시각화합니다.
- 분리물을 확인하기 위해 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 위한 PCR 산물(앰플리콘)을 사용합니다.
- 앰플리콘을 식 (2)를 사용하여 분광 광도계 분석을함으로써 정량화한다.
(2) - DNA의 순도를 확인하려면 A260/A280의 비율을 계산하십시오.
참고: 이상적으로 이 숫자는 1.5 이상이어야 하며 가급적이면 1.8에서 2.0 사이여야 합니다. - 분리를 식별하려면 적절한 정렬 검색 도구를 사용하여 얻은 서열을 서열 데이터베이스와 비교하십시오.
- 표 1에 언급된 바와 같이 PCR 증폭을 위해 PCR 튜브에서 40 μL의 반응 혼합물을 준비한다.
(2)4. 항생제 감수성 검사를 이용한 분리균주의 항생제 내성 검출
알림: 이 프로토콜은 디스크 확산에 의한 항생제 감수성 검사(AST) 방법을 설명합니다. 다음 항생제 디스크가 사용되었다 : 세포 탁심 (5 μg), 암피실린 (10 μg), 레보플록 사신 (5 μg), 클로람페니콜 (30 μg), 티게 사이클린 (15 μg), 세프 트리 악손 (30 μg), 이미 페넴 (10 μg), 겐타 마이신 (10 μg), 네오 마이신 (10 μg), 트리 메토 프림 (5 μg) 및 시프로플록사신 (5 μg).
- AST 접종 물의 준비
- Luria-Bertani 액체(항생제 없이)와 같은 멸균 비선택적 배지 2mL에 멸균 루프를 사용하여 단일, 단일, 단균, 단독, 단균 접종, 80rpm으로 37°C에서 밤새 배양합니다.
- 신선한 비선택적 Luria-Bertani 브로스 배지 2mL에 100-150μL의 하룻밤 재배 배양물(약 OD 600 = 1.8-2.0)을 취하여 재현탁하고 2-4시간 동안 배양합니다(OD 600이 0.4-0.5에 도달할 때까지).
- 배양 밀도가 대략 1-2 × 108 cells/mL에 해당하는 0.5 McFarland 표준(대략 OD600 = 0.1)과 같도록 멸균된 0.85% 식염수를 사용하여 이 새로 성장한 배양 현탁액을 희석합니다.
- 균등한 세포 분포를 위해 박테리아 현탁액을 부드럽게 혼합합니다.
- 희석 후 15분 이내에 위의 현탁액을 사용하십시오.
- 한천 플레이트의 접종
- 1,000mL의 이중 증류수에 38g의 MHA를 혼합하여 AST를 수행하기 위한 Mueller-Hinton Agar(MHA) 플레이트를 제조하고 혼합물을 가열하여 용해시킵니다. 용해된 혼합물을 121°C, 15psi에서 15분 동안 오토클레이브한다.
- 플레이트의 MHA 깊이가 4mm(플레이트당 배지 25mL)인지 확인합니다.
- 동시에 냉동실에서 항생제 디스크를 꺼내 실온으로 따뜻하게하십시오.
알림: 항생제 디스크는 처음에 디스크를 4°C에서 해동하고 나중에 실온에서 해동하여 디스크에 응결될 수 있는 잠재적 위험을 줄여 점차적으로 해동해야 하며, 이는 이후에 억제 영역(ZOI)에 영향을 미칠 수 있습니다. - 무균 조건에서 멸균 면봉을 4.1단계에서 준비한 접종물에 담그고 플레이트의 과다 접종을 피하기 위해 과도한 현탁액을 제거합니다.
- MHA 플레이트의 상단에서 시작하여 가장자리에서 가장자리로 앞뒤로 플레이트에 균등하게 배양액을 펼칩니다. 면봉으로 접시를 60° 회전합니다.
- 항생제 디스크의 적용
- 화염 멸균 된 집게의 도움으로 항생제 디스크를 접종 된 MHA 플레이트에 무균 적으로 옮기고 디스크를 부드럽게 눌러 한천과 완전히 수평으로 접촉하도록합니다.
알림: 이 절차는 플레이트에 배양액을 접종한 후 15분 이내에 완료해야 합니다. - 억제 영역이 겹치지 않도록 유기체, 사용 된 항생제 및 플레이트의 크기를 고려하여 한천 플레이트에 적절한 수의 항생제 디스크를 놓습니다.
참고: 90mm 원형 플레이트에 4-5개의 디스크를 수용할 수 있습니다.
- 화염 멸균 된 집게의 도움으로 항생제 디스크를 접종 된 MHA 플레이트에 무균 적으로 옮기고 디스크를 부드럽게 눌러 한천과 완전히 수평으로 접촉하도록합니다.
- 플레이트의 부화
- 항생제 디스크를 적용한 후 15분 이내에 플레이트를 뒤집고 37°C에서 밤새 배양합니다.
- 결과의 해석
- 밀리미터(mm) 단위의 ZOI 직경을 측정하고 EUCAST11에서 제공한 중단점 값에 따라 해석합니다. 아래에 제공된 두 가지 예를 참조하십시오.
- 엔테로박테랄레스에 대한 시프로플록사신 항생제 디스크(5μg)의 영역 직경 중단점(mm)은 S ≥ 25 및 R < 22이며, 이는 ZOI가 25mm인 경우 민감한(S) 것으로 간주되는 반면 ZOI가 22mm≥< 경우 내성(R)인 것으로 간주됩니다. ZOI 직경이 22와 25 사이에 있으면 분리물은 중간(I)으로 간주됩니다.
- 포도상 구균 종에 대한 클로람페니콜 항생제 디스크 (30 μg)의 영역 직경 중단 점 (mm)은 S ≥ 18 및 R < 18이며, 이는 ZOI가 18mm ≥이면 민감한 것으로 간주되고 ZO
- 분리물이 노출된 총 항생제 수에 대한 분리물이 내성인 항생제 수의 비율을 찾아 다중 항생제 내성(MAR) 지수를 결정합니다.
참고: 품질 관리를 위해 대장균 ATCC 25922 및 S. 포도상구균 ATCC 29213은 단계 4에서와 같이 프로토콜을 따르는 기준 균주로서 사용된다.
- 밀리미터(mm) 단위의 ZOI 직경을 측정하고 EUCAST11에서 제공한 중단점 값에 따라 해석합니다. 아래에 제공된 두 가지 예를 참조하십시오.
5. 분리주에서 항생제 내성 유전자의 PCR 기반 검출
- 분리기에서 ARG를 식별하기 위해 표준 PCR 프로토콜을 사용합니다. 단계 3.1에 제공된 프로토콜을 사용하여 DNA 주형을 준비합니다.
참고: 본 연구에 사용된 PCR 사이클링 조건은 94°C에서 10분, 이어서 94°C에서 35사이클, 적절한 온도에서 30초 동안 어닐링(각 프라이머 세트에 대해 표준화된 대로), 72°C에서 40초 동안 연장, 및 72°C에서 5분 동안 최종 연장이었다. 반응 혼합물은 표 4에 기재되어 있다. ARG, 프라이머 및 어닐링 온도의 목록은 표 5에 나와 있습니다. - 앰플리콘의 순도를 해결, 시각화 및 확인하려면 3.2.3-3.2.10단계를 따르십시오.
6. 전체 박테리아 다양성의 확인 및 메타게놈의 ARG 검출을 위한 전체 메타게놈 DNA 분석
- 물 샘플에서 총 DNA(메타게놈) 추출
- 여과된 물 샘플에서 메타게놈 DNA를 추출합니다.
참고: 현재 연구에서 메타게놈 DNA(총 DNA)는 제조업체의 프로토콜에 따라 참조된 DNA 분리 키트를 사용하여 여과된 물 샘플에서 추출되었습니다( 재료 표 참조). - 추출된 메타게놈 DNA 3μL를 0.8% 아가로스 겔에 로딩하여 DNA의 품질을 확인하고, 80-110V에서 약 30분 동안 겔을 실행한다.
- 손상되지 않은 단일 밴드가 있는지 확인하십시오.
- 형광계를 사용하여 DNA 농도를 확인하십시오.
- 여과된 물 샘플에서 메타게놈 DNA를 추출합니다.
- 전체 메타게놈 DNA 시퀀싱을 사용한 박테리아 다양성 측정 및 ARG 검출
- 라이브러리 준비 및 PCR 증폭:
- 참조된 DNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 쌍단 시퀀싱 라이브러리를 준비합니다( 재료 표 참조).
- 200ng의 DNA를 취하여 기계적으로 더 작은 조각으로 전단하여 어댑터 결찰을 위해 DNA를 준비한 다음 3' 끝에 "A"를 추가하는 연속 최종 수리 단계를 수행합니다.
- 시퀀싱에 사용되는 플랫폼에 따라 DNA 단편의 양쪽 끝에 특정 어댑터를 결찰합니다.
참고: 이중 바코드 라이브러리를 시퀀싱을 위해 플로우 셀에 바인딩하는 데 중요한 시퀀스가 이러한 어댑터에 있습니다. 이는 어댑터-라이게이션된 단편의 PCR 증폭 및 표준 시퀀싱 프라이머 결합을 허용한다. - 품질과 양을 확인하려면 제조업체의 지침에 따라 고감도 DNA 칩을 사용하여 증폭된 라이브러리를 분석합니다.
- 클러스터 생성 및 시퀀싱:
- 증폭된 라이브러리를 클러스터 생성 및 후속 시퀀싱을 위해 적절한 시퀀싱 플랫폼에 로드합니다.
참고: 라이브러리 분자는 쌍단 유동 셀의 상보적인 어댑터 올리고에 결합합니다. 시퀀싱 동안, 정방향 가닥은 역 가닥의 재합성 후에 선택적으로 절단된다. 이 복사 된 역 가닥은 조각의 반대쪽 끝에서 시퀀싱됩니다.
- 증폭된 라이브러리를 클러스터 생성 및 후속 시퀀싱을 위해 적절한 시퀀싱 플랫폼에 로드합니다.
- 생물 정보학 분석 :
- 적절한 플랫폼을 사용하여 고품질 데이터에서 스캐폴드를 생성합니다.
- ARG의 분류 학적 분류 및 식별을위한 생물 정보학 분석에 이러한 스캐 폴드를 적용합니다.
참고 : 전체 박테리아 다양성을 식별하고 메타 게놈에서 ARG를 검출하기위한 전체 메타 게놈 DNA 분석을위한 워크 플로는 그림 1에 나와 있습니다. 원고에 설명 된 전체 방법론의 흐름표는 그림 2에 나와 있습니다.
- 라이브러리 준비 및 PCR 증폭:
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Representative Results
총 박테리아 부하 및 항생제 내성(AR) 박테리아 수
총 박테리아 부하의 열거는 R2A Agar, Modified 배지에 물 샘플의 10-4 내지 10-6 배 희석액을 확산시킴으로써 수행되었다. AR 박테리아 수의 열거를 위해 항생제가 들어있는 배지 플레이트에 10-3-10-6 배 희석액을 뿌렸습니다 (그림 3). 총 및 AR 박테리아 수는 CFU/mL로 계산되었으며 모든 도금 실험은 중복으로 수행되었습니다. 위의 프로토콜에 따라 본 연구에서는 총 박테리아 수가 3.0 × 109 CFU/mL임을 보여주었습니다. AR 박테리아 부하는 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU/mL 범위에서 높은 것으로 나타났습니다(표 6).
16S rRNA 유전자 시퀀싱에 의한 배양 가능한 박테리아 식별
각각의 분리물로부터의 조 DNA를 주형으로 사용하여 16S rRNA 유전자 특이적 PCR을 수행하였다. 시퀀싱된 총 15개의 AR 분리주 중 10개는 장내세균과에 속하며 대부분은 대장균과 클렙시엘라 폐렴입니다. Comamonas spp.와 같은 희귀 기회 박테리아는 Comamonadaceae 계통에 속하며, Micrococcus spp. 및 Arthrobacter spp. Micrococcaceae 계통에 속하고, Aeromonas spp. Aeromonadaceae 계통에 속하는 것도 물 샘플로부터 확인되었다 (표 7).
항생제 감수성 검사를 사용한 배양 가능한 박테리아의 항생제 내성 검출
상기 확인된 분리주의 항생제 내성 프로파일은 디스크 확산 방법을 사용하여 AST를 수행하여 생성되었습니다(그림 4). 테스트된 15개의 분리주 중 8개는 MAR 지수가 ≥0.2로 높은 수준의 저항을 나타냅니다. 또한, 많은 분리 물은 공동 내성 프로파일 (동일한 항생제 세트에 대한 내성)을 보였다. 그러나, 코마모나스 종 및 아르트로박터 종과 같은 분리물은 시험된 항생제 중 어느 것에도 내성을 나타내지 않았다(표 8).
배양 가능한 박테리아에서 항생제 내성 유전자의 검출 및 확인
총 10개의 AR 분리물을 PCR을 사용하여 ARG의 존재에 대해 스크리닝하였다. 배양 가능한 분리물에서 가장 널리 퍼진 ARG는 β-락타마제에 대한 blaTEM 암호화였고, 아미노글리코사이드 내성 유전자 aadA가 그 뒤를 이었습니다. 다른 증폭된 ARG는 각각 β-락탐, 트리메토프림 및 아미노글리코사이드에 내성을 부여하는 blaCTX-M, dfr1 및 aac(6')-Ib 였습니다. ARGs의 증폭에 대한 대표적인 결과는 도 5에 나타내었다. 확인된 대부분의 분리주에 대해, 표현형 내성(AST)은 PCR 기반 유전형 AR 프로파일링 을 통해 분자 수준에서 확인되었습니다.
메타게놈 DNA의 전체 박테리아 다양성 확인
가능한 모든 박테리아 (배양 가능 및 비 배양 가능)의 존재를 확인하고 상대적 풍부도를 확인하기 위해 총 박테리아 다양성에 대한 메타 게놈 DNA 분석이 수행되었습니다. 고처리량 차세대 염기서열분석(HT-NGS) 접근 방식을 사용하여 총 서열 판독의 ~96.94%를 얻어 높은 커버리지를 얻었습니다. 분류 학적 주석은 판독 값을 문에서 속 수준까지 다른 분류 학적 그룹으로 분류하기 위해 수행되었습니다 (그림 6 및 그림 7). 메타게놈에서 총 50개의 문이 확인될 수 있으며, 이는 물 샘플에서 높은 박테리아 다양성을 나타냅니다. 프로테오박테리아는 알파프로테오박테리아, 베타프로테오박테리아 및 감마프로테오박테리아 클래스로 구성된 가장 지배적인 문이었습니다. 주문 수준에서 Burkholderiales는 베타 프로 테오 박테리아 클래스에 속하는 가장 널리 퍼진 주문이었습니다. 슈도모나스, 아 시네토박터, 페도박터, 프로스테코박터, 림노아비탄, 플라보박테리움 및 코마모나스 는 물 샘플에서 발견되는 풍부한 속 중 일부였습니다.
메타게놈 DNA에서 ARG 검출
물 샘플의 메타게놈에서 ARG의 총 풀을 이해하기 위해 전체 메타게놈 시퀀싱을 수행한 후 적절한 생물정보학 도구를 사용하여 ARG를 식별했습니다. 메타게놈 접근법은 샘플에서 배양 가능한 미생물과 배양 불가능한 미생물 모두에 존재하는 ARG가 검출되도록 합니다. β-락탐에 내성을 부여하는 다양한 유전자 (SMB-1, ampC1, VIM-20, ccrA, nmcR, ARL-1, blaZ); 아미노 길 코 사이드 (AAC (6 ') -34); 퀴놀론 (qnrS6, qnrVC5); 항생제 유출 펌프-내성-결절-세포 분열 (RND) (evgA, mtrA, mdtA, acrD), ATP- 결합 카세트 (ABC) (oleC, macB, patA, bcrA) 및 주요 촉진제 수퍼 패밀리 (MFS) (abaQ); 트리 메토 프림 내성 디 하이드로 폴 레이트 환원 효소 (dfrD, dfrA20); 리팜핀 포스 포 트랜스퍼 라제 (rphB); 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)(catB10)가 메타게놈에서 검출되었다. 배양 가능한 분리물(blaTEM, blaCTX-M, aadA, aac(6')-Ib, dfr1)에서 PCR을 통해 검출된 ARG도 전체 메타게놈 시퀀싱에 의해 검출되어 물 샘플에서 이들의 존재를 확인했습니다. 전체 메타게놈 DNA 분석을 이용한 메타게놈에서 동정된 ARGs의 대표적인 결과는 표 9와 같다.
그림 1: 전체 메타게놈 DNA 분석을 위한 워크플로우. 전체 박테리아 다양성의 식별 및 메타게놈으로부터의 ARG의 검출을 위한 단계적 워크플로우가 제시된다. 전체 단계에는 메타게놈 DNA 준비, 증폭 및 식별이 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 전체 방법론의 흐름도. 본 연구에서 사용 된 방법론의 단계적 워크 플로우. 배양 기반 및 비 배양 기반 기술의 조합은 물 샘플에 존재하는 ARG의 박테리아 다양성 및 정체성에 대한 완전한 정보를 얻는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 항생제 함유 R2A 한천, 변형된 플레이트에서 분리된 콜로니의 대표 이미지. 세포탁심(3μg/mL) 함유 R2A 한천, 변형판에 도말된 물 샘플. 샘플을 연속 희석하고 중복 A1, A2 : 10-4로 도금 하였다. B1, B2 : 10-5; C1, C2 : 10-6. 적절한 배양 기간 후, 단리된 콜로니는 B1, B2, C1 및 C2 플레이트에서 볼 수 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 디스크 확산법에 의한 항생제 감수성 테스트. 분리 대장균에 대한 디스크 확산 방법에 의한 AST의 대표 이미지. AST는 중복-A1, A2: CTX, IPM, C, CIP; B1, B2: 르, TGC, 앰프, 젠; C1, C2: TR, N, K, CTR ZOI의 직경은 밀리미터(mm) 단위로 측정하였다. 분리물이 사용된 항생제에 내성이 있거나 감수성이 있는지 해석하기 위해 ZOI를 최신 EUCAST 표와 비교했습니다. 약어 : AST = 항생제 감수성 검사; CTX = 세포탁심; IPM = 이미 페넴; C = 클로람페니콜; CIP = 시프로플록사신; LE = 레보플록사신; TGC = 티게사이클린; AMP = 암피실린; 겐 = 겐타마이신; TR = 트리메토프림; N = 네오마이신; K = 카나마이신; CTR = 세프트리악손; ZOI = 억제 영역; EUCAST = 항생제 감수성 검사에 관한 유럽위원회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 배양 가능한 박테리아에서 항생제 내성 유전자의 PCR 증폭. 아가로스 겔 전기영동 후 PCR을 수행하여 분리물에서 ARGs의 존재를 확인하기 위해 증폭된 밴드의 시각화를 수행하였다. PCR 앰플리콘의 분리 된 밴드는 젤에서 볼 수 있습니다. 개별 PCR 앰플리콘의 크기를 적절한 DNA 마커와 비교한다. 레인 L1: 100 bp DNA 사다리; 레인 1-5 : 1 : dfr1 (425 bp); 레인 2: 블라템 (310bp); 레인 3: 블라CTX-M (500 bp); 레인 4 : aac (6 ') -Ib ( 395 bp); 레인 5: aadA (624 bp). 약어 : ARGs = 항생제 내성 유전자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 문 및 클래스 수준에 대한 분류학적 분류. (A) 물 샘플에서 박테리아 메타게놈의 문 수준 분류학적 풍부도 분포를 보여주는 막대 차트. 총 50 개의 박테리아 문이 메타 게놈 분석에 의해 확인되었습니다. 박테리아의 처음 12 개의 지배적 인 문이 표시됩니다. (B) 물 샘플에서 박테리아 메타게놈의 클래스 수준 분류학적 풍부도 분포를 보여주는 막대 차트. 총 50개의 박테리아 클래스가 메타게놈 분석에 의해 확인되었습니다. 처음 15 개의 지배적 인 종류의 박테리아가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 순서 및 속 수준에 대한 분류학적 분류. (A) 물 샘플에서 박테리아 메타게놈의 차수 수준 분류학적 풍부도 분포를 보여주는 막대 차트. 총 50개의 박테리아 주문이 메타게놈 분석에 의해 확인되었습니다. 박테리아의 처음 14 개의 지배적 인 순서가 그림에 나와 있습니다. (B) 물 샘플에서 박테리아 메타게놈의 속 수준 분류학적 풍부도 분포를 보여주는 막대 차트. 총 50 개의 박테리아 속이 메타 게놈 분석에 의해 확인되었습니다. 처음 15 개의 우성 박테리아 속이 그림에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| PCR 시약 | 부피 (μL) |
| 2x Taq 마스터 믹스 | 20 |
| 정방향 프라이머(10피코몰) | 1.5 |
| 리버스 프라이머 (10 피코 몰) | 1.5 |
| 조잡한 DNA 템플릿 | 1.5 |
| 멸균 분자 생물학 용수 | 15.5 |
| 총 볼륨 | 40 |
표 1: PCR 마스터믹스 성분. 다양한 PCR 시약의 반응 혼합물 조성물.
| 방향 | 프라이머 시퀀스 5' – 3' | PCR 조건 | 아니요. 사이클 수 |
| 전달 | GGAGGCAGCAGTAAGGAAT | 94 °C 동안 10 분 | 1 |
| 94°C에서 30초 동안 변성 | 35 | ||
| 50°C에서 30초 동안 어닐링 | |||
| 72°C에서 40초 동안 연장 | |||
| 후진 | CTACCGGGGGTTAATCC | 72°C에서 5분 동안 최종 연장 | 1 |
표 2: 16S rRNA 유전자의 증폭을 위한 PCR 주기 조건. 16S rRNA 유전자 증폭에 필요한 PCR 주기 조건을 나타내었다. 단계에는 초기 변성 단계, 35 사이클의 변성, 어닐링 및 확장, 최종 확장 단계가 포함됩니다.
| 6x 로딩 젤 | |
| 목차 | 양 |
| 브로모페놀 블루 | 25 밀리그램 |
| 85% 글리세롤 | 7.06 밀리리터 |
| 밀리-Q 물 | 2.94 밀리리터 |
| 총 볼륨 | 10 밀리리터 |
| 50x 트리스-아세테이트-EDTA(TAE) 스톡 버퍼 조성 | |
| 목차 | 양 |
| 트리스 베이스 | 이중 증류수 700mL에 242g |
| 빙초산 (GAA) | 57.1 밀리리터 |
| 0.5 M (EDTA) pH 8.0 | 100 밀리리터 |
| pH를 8.5로 조정하고 이중 증류수로 부피를 1000mL로 구성합니다. | |
| 1x TAE의 경우: 50x TAE 버퍼 20mL + 이중 증류수 980mL | |
표 3: 6x 겔 로딩 완충액 및 50x 트리스아세테이트-EDTA 스톡 완충액의 조성. 6x 겔 로딩 완충액은 아가로스 겔 전기영동 상에서 실행될 샘플과 혼합된다. 추적 염료로 브로 모 페놀 블루가 포함되어 있습니다. 글리세롤은 웰에 적절하게 로딩하기 위해 로딩되는 샘플의 밀도를 증가시킵니다. 50xTAE 스톡 완충액의 제조에 필요한 다양한 시약의 조성이 또한 도시되어 있다. TAE 완충액은 AGE에 사용되는 가장 일반적인 완충액 중 하나이며 pH를 8.5로 유지하고 AGE 동안 증폭된 DNA의 이동을 가능하게 합니다. 약어: TAE = 트리스-아세테이트-EDTA; AGE = 아가로스 겔 전기영동.
| PCR 시약 | 부피 (μL) |
| 2x Taq 마스터 믹스 | 5 |
| 정방향 프라이머(10피코몰) | 0.5 |
| 리버스 프라이머 (10 피코 몰) | 0.5 |
| 조잡한 DNA 템플릿 | 1.5 |
| 멸균 분자생물학 등급 물 | 2.5 |
| 총 볼륨 | 10 |
표 4: ARG의 동정을 위한 PCR 마스터믹스 조성물. 반응 혼합물 조성은 PCR 실험을 수행하기 위해 필요한 다양한 PCR 시약이다.
| 아니 시니어 | 표적 유전자 | 에 대한 내성 | 입문서 | 프라이머 서열 (5'-3') | 앰플리콘 크기 (bp) | 어닐링 온도 (°C) | 참조 | ||||
| 1 | 증권 시세 표시기 A | 트리 메소 프림 | 전달 | TGGTAGCTATATC GAAGAATGGAGT |
425 | 59 | 라세비츠 외, 19 | ||||
| 후진 | TATGTTAGAGGCG AAGTCTTGGGTA |
||||||||||
| 2 | 블라템 | β - 락탐 | 전달 | GCACGAGTGGG 타캇가 |
310 | 60 | 게브레예스, 타쿠르20 | ||||
| 후진 | GGTCCTCCGAT CGTTGTCAG |
||||||||||
| 3 | blaCTX-M | β - 락탐 | 전달 | CGATGGGACG 증권 시세 표시기 |
500 | 52 | 리 외 21 | ||||
| 후진 | ᄏᄏ�� 증권 시세 표시기 |
||||||||||
| 4 | aac(6')-Ib | 아미노글리코사이드 | 전달 | TATGAGTGGC 타아트가트 |
395 | 50 | Akers et al. 22 | ||||
| 후진 | 증권 시세 표시기 CGTAGCA |
||||||||||
| 5 | 증권 시세 표시기 A | 아미노글리코사이드 | 전달 | ACCGTAAGGC TTGATGAAACA |
624 | 58 | 치에시엘추크 23 | ||||
| 후진 | GCCGACTACC TTGGTGATCTC |
||||||||||
표 5: 배양가능한 박테리아에서 ARG의 PCR을 위한 프라이머. 각각의 프라이머 서열과 함께 본 연구에서 사용된 상이한 ARG가 도시된다. 앰플리콘의 예상 크기는 염기쌍으로 제공됩니다. 각 프라이머 세트의 어닐링 온도도 언급됩니다.
| 항생제 | 항생제 농도 (μg / mL) | CFU/mL |
| - | - | 3.0×109 |
| 증권 시세 표시기 | 3 | 4.5×107 |
| 증권 시세 표시기 | 0.5 | 3.2 엑스 108 |
| K | 15 | 9.6 엑스 105 |
| E | 20 | 1.6 엑스 108 |
| 버지니아 | 3 | 1.2 엑스 109 |
표 6: 총 및 항생제 내성 박테리아 수. 물 샘플로부터 항생제 내성 박테리아의 초기 분리를 위해 5 개의 항생제가 사용되었습니다. 총 박테리아 수(항생제 제외)와 AR 박테리아 수는 밀리리터당 집락 형성 단위(CFU/mL)로 표시됩니다. 약어 : AR = 항생제 내성; CFU = 집락 형성 단위; CTX = 세포탁심; CIP = 시프로플록사신; K = 카나마이신; E = 에리스로마이신; VA = 반코마이신.
| 코드 격리 | 미생물 | 가족 |
| 1 | 대장균 | 장내 세균과 |
| 2 | 대장균 | 장내 세균과 |
| 3 | 대장균 | 장내 세균과 |
| 4 | 대장균 | 장내 세균과 |
| 5 | 대장균 | 장내 세균과 |
| 6 | 대장균 | 장내 세균과 |
| 7 | 클렙시 엘라 뉴모니 아 | 장내 세균과 |
| 8 | 클렙시 엘라 뉴모니 아 | 장내 세균과 |
| 9 | 클렙시 엘라 뉴모니 아 | 장내 세균과 |
| 10 | 클렙시 엘라 뉴모니 아 | 장내 세균과 |
| 11 | 코마모나스 종 | 코마모나다과 |
| 12 | 코마모나스 종 | 코마모나다과 |
| 13 | 마이크로 코커스 종 | 마이크로 코카과 |
| 14 | 아르트로박터 종 | 마이크로 코카과 |
| 15 | 에어로모나스 종 | 에어로모나다과 |
표 7: 16S rRNA 유전자 시퀀싱에 의한 항생제 내성 분리주의 확인. 콜로니 PCR은 16S rRNA 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 각 분리물에 대해 수행하였다. 그런 다음 얻은 앰플리콘을 시퀀싱하고 적절한 생물 정보학 도구를 사용하여 식별했습니다.
| 격리 번호 | 격리 | 증권 시세 표시기 | 앰프 | 르 | C | 증권 시세 표시기 | 클릭률 | 증권 시세 표시기 | 겐 | N | 증권 시세 표시기 | 증권 시세 표시기 | 3월 | 3월 인덱스 | ||
| 1 | 대장균 | 13R | 0R | 0R | 28초 | 23초 | 11R | 39초 | 20대 | 18초 | 0R | 0R | 6 | 0.5 | ||
| 2 | 대장균 | 31초 | 0R | 12R | 29초 | 23초 | 32초 | 37초 | 19초 | 16초 | 0R | 14R | 4 | 0.4 | ||
| 3 | 대장균 | 14R | 0R | 14R | 14R | 21초 | 10R | 34초 | 17초 | 11R | 24초 | 16R | 7 | 0.6 | ||
| 4 | 대장균 | 28초 | 13R | 18R | 26초 | 21초 | 28초 | 32초 | 16R | 11R | 24초 | 19R | 5 | 0.4 | ||
| 5 | 대장균 | 11R | 0R | 12R | 26초 | 21초 | 10R | 31초 | 17초 | 16초 | 22초 | 11R | 5 | 0.4 | ||
| 6 | 대장균 | 27초 | 0R | 12R | 12R | 22초 | 30대 | 32초 | 19초 | 11R | 0R | 14R | 6 | 0.5 | ||
| 7 | 클렙시 엘라 뉴모니 아 | 28초 | 0R | 17R | 27초 | 22초 | 30대 | 32초 | 18초 | 22초 | 0R | 16R | 4 | 0.4 | ||
| 8 | 클렙시 엘라 뉴모니 아 | 29초 | 11R | 26초 | 24초 | 22초 | 30대 | 28초 | 17초 | 16초 | 24초 | 23초 | 1 | 0.1 | ||
| 9 | 클렙시 엘라 뉴모니 아 | 29초 | 13R | 25초 | 24초 | 22초 | 28초 | 29초 | 18초 | 17초 | 24초 | 25초 | 1 | 0.1 | ||
| 10 | 클렙시 엘라 뉴모니 아 | 33초 | 14초 | 26초 | 28초 | 22초 | 31초 | 32초 | 19초 | 20대 | 24초 | 29초 | 0 | 0 | ||
| 11 | 코마모나스 종 | - | - | - | 23초 | - | - | 37초 | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 12 | 코마모나스 종 | - | - | - | 27초 | - | - | 42초 | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 13 | 마이크로 코커스 종 | 25초 | 17R | 24초 | 32초 | 22초 | 34초 | 28초 | 20대 | - | 21초 | 26초 | 1 | 0.1 | ||
| 14 | 아르트로박터 종 | 45초 | 57초 | 28초 | 26초 | 34초 | 27초 | 39초 | 26초 | - | 28초 | 28초 | 0 | 0 | ||
| 15 | 에어로모나스 종 | - | - | 20R | - | - | - | - | - | - | - | 20R | 2 | 1 | ||
표 8: AST에 의해 분석된 박테리아 분리주의 항생제 내성 표현형. 분리물에서의 표현형 저항성은 디스크 확산법을 이용하여 분석하였다. 숫자는 밀리미터(mm) 단위의 ZOI를 나타냅니다. MAR 지수의 경우 숫자는 분리 물이 내성을 갖는 항생제의 총 수를 나타냅니다. 약어 : AST = 항생제 감수성 검사; CTX = 세포탁심; AMP = 암피실린; LE = 레보플록사신; C = 클로람페니콜; TGC = 티게사이클린; CTR = 세프트리악손; IPM = 이미 페넴; 겐 = 겐타마이신; N = 네오마이신; TR = 트리메토프림; CIP = 시프로플록사신; R = 내성; S = 민감한; MAR = 다중 항생제 내성; ZOI = 억제 영역.
| AMR 유전자 계열 | 유전자 |
| SMB 베타-락타마제 | 중소기업 - 1 |
| ampC 형 베타 - 락타 마제 | 앰프C1 |
| VIM 베타-락타마제 | 빔-20 |
| CcrA 베타-락타마제 | 증권 시세 표시기 |
| NmcA 베타-락타마제 | nmcR |
| ARL 베타-락타마제 | ARL-1 |
| blaZ 베타-락타마제 | 블레이즈 |
| 블라템 베타-락타마제 | 블라템* |
| blaCTX 베타-락타마제 | ᄏ�� |
| AAC (6 ') | aac(6')-Ib, aac(6')-34 |
| 개미(3'') | aadA |
| 퀴놀론 저항성 단백질 (QNR) | qnrS6, qnrVC5 |
| 저항-결절-세포 분열(RND) 항생제 유출 펌프 | evgA, mtrA, mdtA, acrD |
| ATP 결합 카세트 (ABC) 항생제 유출 펌프 | oleC, macB, patA, bcrA |
| 주요 촉진자 수퍼 패밀리 (MFS) 항생제 유출 펌프 | 아바큐 |
| 트리메토프림 내성 디하이드로폴레이트 환원효소 DFR | dfr1, dfrD, dfrA20 |
| 리팜핀 포스포트랜스퍼라제 | ᄏ�� |
| 운데카프레닐피로포스페이트 관련 단백질 | 증권 시세 표시기 |
| 메티 실린 내성 PBP2 | 증권 시세 표시기 |
| vanJ 막 단백질 | 반제이 |
| 테트라사이클린 내성 리보솜 보호 단백질 | 테트 |
| 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼 라제 (CAT) | 고양이B10 |
| Erm 23S 리보솜 RNA 메틸 트랜스퍼 라제 | 음(37) |
| 글리코펩타이드 저항성 유전자 클러스터 | vanRB, vanRE, vanRD |
| MCR 포스포에탄올아민 트랜스퍼라제 | MCR-9 |
| 설폰아미드 내성 술 | 술3 |
| *밑줄이 그어진 유전자는 배양 가능한 미생물에서도 검출되었습니다. | |
표 9: 전체 메타게놈 DNA 분석을 사용하여 식별된 ARG. 물 샘플의 전체 메타게놈을 전체 메타게놈 시퀀싱에 사용하였고, 수득된 서열은 적절한 ARG 데이터베이스를 사용하여 주석을 달았다. 메타게놈 DNA에서 확인된 중요한 ARG 중 일부의 대표적인 결과가 표시됩니다. 밑줄이 그어진 유전자는 배양 가능한 미생물에서도 검출되었습니다. 약어 : ARG = 항생제 내성 유전자.
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Discussion
샘플 수집 및 처리는 중요한 역할을하며 연구 결과 및 해석에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 샘플의 변동성을 배제하려면 연구중인 담수 체의 여러 위치에서 샘플링을 수행하는 것이 중요합니다. 이러한 샘플을 취급할 때 적절한 무균 환경 조건을 유지하면 오염을 방지할 수 있습니다. 또한, 추출된 핵산의 품질 및 양에 영향을 미칠 수 있는 박테리아 조성의 변화를 방지하기 위해, 통과 조건은 샘플 수집 시점부터 후속 처리까지 최소한의 시간 경과로 4°C로 유지되어야 합니다. 여러 연구에서 샘플 수집과 처리 사이의 중간 기간이 신중하게 수행되지 않으면 분석의 후반 단계에서 다양한 결과를 얻을 수 있다고 강조했습니다12,13.
도금에 다양한 희석액을 사용하면 콜로니가 서로 뭉치지 않고 셀 수 있는 콜로니가 너무 적지 않습니다. 피펫팅/취급 오류로 인해 발생할 수 있는 CFU/mL의 변동을 설명하려면 실험을 중복 수행해야 합니다. 또한 사용 된 항생제가 효과적으로 작동하고 위양성 결과가 제거되도록 모든 실험에 대해 대조군 플레이트가 유지됩니다. 따라서 대조군 플레이트에는 눈에 띄는 식민지 성장이 없어야합니다. 이것은 사용 된 항생제의 효능을 나타냅니다.
AST 동안 접종 배양 밀도와 한천 플레이트의 두께는 ZOI의 직경에 영향을 미칠 수 있으므로 결과의 해석에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 AST 실험을 수행할 때 이 두 요소를 균일하게 유지하도록 주의해야 합니다. 가장 중요한 측면은 접종 물에 존재하는 박테리아 세포의 수입니다. 일반적으로 1 × 10 8-2 × 108 CFU/mL의 세포가 접종물로 사용되며, 이는 0.5 McFarland 표준14와 동일합니다. 이 접종 물의 농도는 결과의 변동을 피하기 위해 일정하게 유지되어야합니다. 필요한 농도보다 높거나 낮은 농도는 멸균 식염수를 사용하여 희석하고 15 분 이내에 즉시 접종에 사용해야합니다. 한천 플레이트에 접종 물을 뿌리는 동안 과도한 양의 접종 물을 피하기 위해주의를 기울여야합니다. 과도한 접종물은 MHA 플레이트에 접종하기 전에 박테리아 현탁 튜브 측면에 있는 면봉을 눌러 제거할 수 있습니다. 표준 AST 절차로부터의 임의의 편차는 그러한 프로토콜(11,15)로부터 얻어진 데이터에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 이전 연구에 따르면 ≥0.2의 MAR 지수 값은 분리 물16에서 높은 저항을 나타냅니다. AST 결과의 해석은 ZOI를 기반으로하기 때문에 배양 물의 접종 부족 또는 과잉 접종을 피해야합니다.
PCR의 경우, 마스터믹스는 성분의 분해 및 효소의 활성 손실 가능성을 최소화하기 위해 얼음 블록 위에서 준비되어야 합니다. 반응을 설정하는 동안 장갑을 착용하면 외부 오염 가능성이 최소화됩니다17. AGE 동안의 전압은 가열 효과와 적재 된 샘플의 성능 저하로 이어질 수 있으므로 너무 높아서는 안됩니다. 최적의 전압에서 AGE를 수행하면 밴드가 잘 분리되고 드래그 또는 스머징 효과 없이 날카로워집니다.
지난 수십 년 동안 수행 된 연구는 다른 미생물의 식별을 위해 16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱의 사용을 입증했습니다. 16S rRNA 유전자 시퀀싱의 경우, 주형 DNA의 추출 방법의 선택은 편향을 유발할 수 있으며, 이는 차례로 다운스트림 분석에 영향을 미칠 수 있습니다. 그람 양성균은 핵산 추출을 어렵게 만들 수 있는 두꺼운 펩티도글리칸 세포벽을 가지고 있습니다. 따라서 추출 방법의 선택은 모든 유형의 미생물 DNA를 효과적으로 포착해야합니다. 조잡한 주형 DNA를 추출하는 전통적인 끓는 방법은 세포의 내용물을 추출하여 결과의 편향을 줄이는 효율적인 방법 중 하나입니다.
수역의 완전한 박테리아 군집을 이해하기 위해 이 연구에서는 고처리량 차세대 염기서열분석(HT-NGS) 기법을 사용했습니다. 전체 메타게놈 DNA 분석을 통해 주어진 샘플의 전체 메타게놈을 연구할 수 있습니다. 배양 기반 기술은 주로 박테리아 부하의 호기성 수를 제공하여 샘플의 미생물 학적 품질을 나타냅니다. 그러나 배양 가능한 미생물은 전체 미생물의 1 %에 불과합니다. 혐기성 균을 포함한 다양한 종으로 구성된 나머지 미생물은 특성이 좋지 않고 종종 무시됩니다. 이러한 미생물은 AR 특성을 가질 수 있습니다. 더욱이, 공생 미생물은 다양한 유전자 교환 사건을 통해 병원체로 전염될 수 있는 AR 유전자의 저장소이다18. 이러한 공생 식물의 대부분은 배양할 수 없으며 HT-NGS와 관련된 메타게놈 접근 방식으로 연구할 수 있으므로 모든 샘플에서 다양한 미생물을 식별할 수 있는 더 넓은 범위를 제공합니다. 메타게놈 분석을 사용하여 박테리아 분류군의 상세한 프로필을 얻어 배양 가능한 데이터를 보완했습니다. 또한 이러한 보완적인 접근 방식은 연구 중인 수역의 전반적인 AR 상태에 대한 아이디어를 제공할 수 있습니다.
본 연구에서는 기존의 배양 기반 및 비 배양 기반 메타게놈 기술의 조합을 사용하여 총 박테리아 다양성, 다양한 항생제 내성 박테리아 및 수성 ARG의 총 풀을 식별할 수 있었습니다. 이 연구에 설명 된 방법론은 연안 수역, 자연수 및 인공 식수와 같은 다른 수원에서 AR 병원균을 식별하기 위해 복제 및 사용자 정의 할 수 있습니다. 또한 수인성 병원 병원체의 전파를 추적하고 싱크대, 화장실, 욕조 및 가습기와 같은 수원을 통해 병원 및 클리닉 환경에서 병원 관련 감염을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 AMR의 감시 및 수성 AMR 핫스팟의 식별에 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개할 상충되는 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 뭄바이 대학의 과학 기술-대학 연구 및 과학 우수성 진흥 (DST-PURSE) 계획의 재정 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. Devika Ghadigaonkar는이 계획에 따라 프로젝트 펠로우로 일했습니다. 과학 기술부-과학 및 공학 연구위원회 (DST-SERB) 프로젝트 번호 : CRG / 2018 / 003624의 선임 연구원 인 Harshali Shinde가 제공 한 기술적 도움을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA - Not Applicable |
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