Summary
Protokollen giver en detaljeret metode til neuronal billeddannelse i hjerneskive ved hjælp af en vævsrensningsmetode, ScaleSF. Protokollen omfatter hjernevævsforberedelse, vævsafklaring, håndtering af ryddede skiver og konfokal laserscanning mikroskopi billeddannelse af neuronale strukturer fra mesoskopiske til mikroskopiske niveauer.
Abstract
En detaljeret protokol er tilvejebragt her for at visualisere neuronale strukturer fra mesoskopiske til mikroskopiske niveauer i hjernevæv. Neuronale strukturer, der spænder fra neurale kredsløb til subcellulære neuronale strukturer, visualiseres i musehjerneskiver optisk ryddet med ScaleSF. Denne clearingmetode er en modificeret version af ScaleS og er en hydrofil vævsrensningsmetode til vævsskiver, der opnår potent rydningsevne samt et højt niveau af bevarelse af fluorescenssignaler og strukturel integritet. Et tilpasseligt tredimensionelt (3D) -printet billedbehandlingskammer er designet til pålidelig montering af ryddet hjernevæv. Musehjerner injiceret med en adeno-associeret virusvektor, der bærer forbedret grønt fluorescerende proteingen, blev fikseret med 4% paraformaldehyd og skåret i skiver med 1 mm tykkelse med en vibrerende vævsskiver. Hjerneskiverne blev ryddet ved at følge clearingprotokollen, som inkluderer sekventielle inkubationer i tre opløsninger, nemlig ScaleS0-opløsning, phosphatbuffer saltvand (–) og ScaleS4-opløsning i alt 10,5-14,5 timer. De rensede hjerneskiver blev monteret på billeddannelseskammeret og indlejret i 1,5% agarosegel opløst i ScaleS4D25(0)-opløsning. 3D-billedoptagelsen af skiverne blev udført ved hjælp af et konfokalt laserscanningsmikroskop udstyret med en multi-immersion objektiv linse med lang arbejdsafstand. Begyndende med mesoskopisk neuronal billeddannelse lykkedes det os at visualisere fine subcellulære neuronale strukturer, såsom dendritiske rygsøjler og axonale boutoner, i de optisk ryddede hjerneskiver. Denne protokol ville lette forståelsen af neuronale strukturer fra kredsløb til subcellulære komponentskalaer.
Introduction
Vævsrydningsmetoder har forbedret dybdeuafhængig billeddannelse af biologiske og kliniske prøver med lysmikroskopi, hvilket giver mulighed for ekstraktion af strukturelle oplysninger om intakt væv 1,2. Optiske clearingteknikker kan også potentielt fremskynde og reducere omkostningerne til histologisk analyse. I øjeblikket er der tre store clearingmetoder til rådighed: hydrofile, hydrofobe og hydrogelbaserede metoder 1,2. Hydrofile tilgange overgår i at bevare fluorescenssignaler og vævsintegritet og er mindre giftige sammenlignet med de to andre tilgange 3,4.
En hydrofil clearingmetode, ScaleS, har en karakteristisk position med sin bevarelse af strukturel og molekylær integritet samt potent clearingkapacitet (clearing-preservation spectrum)5. I en tidligere undersøgelse udviklede vi en hurtig og isometrisk clearingprotokol, ScaleSF, for vævsskiver (~ 1 mm tykkelse) ved at ændre clearingproceduren for ScaleS6. Denne clearingprotokol kræver sekventielle inkubationer af hjerneskiver i tre opløsninger i 10,5-14,5 timer. Metoden er udstyret med et højt clearingbevarende spektrum, som er kompatibelt selv med elektronmikroskopi (EM) analyse (supplerende figur 1), hvilket giver mulighed for multi-skala høj opløsning tredimensionel (3D) billeddannelse med nøjagtig signalrekonstruktion6. Således bør ScaleSF være effektiv især i hjernen, hvor neuronale celler udarbejder sprudlende processer af enorm længde og arrangerer specialiserede fine subcellulære strukturer til transmission og modtagelse af information. Ekstraktion af strukturel information med skalaer fra kredsløb til subcellulære niveauer på neuronale celler er ret nyttig til bedre forståelse af hjernefunktioner.
Her giver vi en detaljeret protokol til at visualisere neuronale strukturer med skalaer fra det meskopiske / kredsløb til mikroskopisk / subcellulært niveau ved hjælp af ScaleSF. Protokollen omfatter vævsforberedelse, vævsafklaring, håndtering af ryddet væv og konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) billeddannelse af ryddet væv. Vores protokol fokuserer på at forhøre neuronale strukturer fra kredsløb til subcellulære komponentskalaer. For en detaljeret procedure til fremstilling af opløsninger og stereotaxisk injektion af adeno-associerede virus (AAV) vektorer i musehjerner henvises til henholdsvis Miyawaki et al. 20167 og Okamoto et al. 20218.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgene blev godkendt af de institutionelle dyrepleje- og brugsudvalg ved Juntendo University (godkendelse nr. 2021245, 2021246) og udført i overensstemmelse med grundlæggende retningslinjer for korrekt udførelse af dyreforsøg af Japans videnskabsråd (2006). Her blev mandlige C57BL /6J-mus injiceret med AAV-vektor, der bærer forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) gen og parvalbumin (PV) / myristoylation-EGFP-lipoproteinreceptor med lav densitet C-terminal bakterielt kunstigt kromosom (BAC) transgene mus (PV-FGL mus)9 . PV-FGL-mus blev opretholdt i C57BL/6J-baggrund. Der blev ikke fundet kønsbaserede forskelle med hensyn til denne undersøgelse.
1. Forberedelse af væv
- Perfusion fiksering
BEMÆRK: Udfør trin 1.1.1 til 1.1.3 i en røghætte for at begrænse eksponeringen for paraformaldehyd (PFA).- Bedøve voksne hanmus (8-16 uger gamle) ved en intraperitoneal injektion af overdosering af natriumpentobarbital (200 mg/kg). Bekræft tilstrækkeligheden af anæstesi ved fravær af tå-knivspids tilbagetrækning og øjenblinkreflekser.
- Åbn brysthulen og skær det højre atriale vedhæng med kirurgisk saks. Gennemfør musene med 20 ml iskold fosfatbuffersalin (PBS) ved hjælp af en 23 G nål fastgjort til en 20 ml sprøjte efterfulgt af perfusion af 20 ml iskold 4% PFA i 0,1 M fosfatbuffer (PB) ved hjælp af en anden 20 ml sprøjte.
FORSIGTIG: PFA er giftigt og teratogent. Undgå indånding eller kontakt med hud, øjne og slimhinde. - Fjern hjernevæv fra kraniet med pincet. Overfør hjernevævet til et 15 ml rør indeholdende 4% PFA i 0,1 M PB, beskyt prøverne mod lys og vip forsigtigt natten over ved 4 ° C på en ryster ved 50-100 o / min.
- BEMÆRK: Det høstede hjernevæv kan opbevares i flere uger i 0,02% natriumazid (NaN3) i PBS ved 4 °C.
FORSIGTIG: NaN3 er giftig. Undgå indånding eller kontakt med hud, øjne og slimhinde. Håndter det inde i en røghætte.
- Forberedelse af hjerneskive
- 4% agar i PBS fremstilles ved tilsætning af 2 g agar til 50 ml PBS. Mikrobølge blandingen, indtil agaren er helt opløst. Opløsningen afkøles til 40-45 °C.
BEMÆRK: Den viskøse egenskab, der leveres af agaropectin, en vigtig bestanddel af agar, forbedrer let skæring af vævsskiver. - Tilsæt 10 ml agaropløsning til en 6-brønds kulturplade. Nedsænk hjernevævet i agaropløsningen ved hjælp af pincet. Lad agaren størkne på is.
- Fjern det indlejrede hjernevæv fra brønden og trim agaren med et barberblad. Agarblokken fastgøres på bunden af vibratombadet med superlim, og der hældes 0,1 M PB i bufferbakken.
- Rengør et andet barberblad med et fnugfrit silkepapir gennemblødt i ethanol, og fastgør bladet til bladholderen på den vibrerende vævsskiver.
- Sektionshastigheden indstilles til 0,14 mm/s med 1,4 mm amplitude og frekvensen til 75-77 Hz. Skær hjernevævet i 1 mm tykke skiver, og saml skiverne i en 6-brønds cellekulturplade indeholdende PBS.
BEMÆRK: Hjerneskiverne kan opbevares i flere uger i 0,02% NaN3 i PBS ved 4 °C.
- 4% agar i PBS fremstilles ved tilsætning af 2 g agar til 50 ml PBS. Mikrobølge blandingen, indtil agaren er helt opløst. Opløsningen afkøles til 40-45 °C.
2. Afklaring af væv
BEMÆRK: Sammensætningerne af de anvendte ScaleS-opløsninger er anført i tabel 1. Prøver skal beskyttes mod lys ved at dække med en folie. Clearingtrinnene er vist i figur 1A.
- Der tilsættes 8 ml ScaleS0-opløsning til en brønd i en 6-brønds cellekulturplade, og der tilsættes 8 ml ScaleS4-opløsning til en anden brønd på pladen og forvarm til 37 °C i en inkubator.
- Hjerneskiverne overføres til den forvarmede ScaleS0-opløsning med en spatel, og der inkuberes i 2 timer ved 37 °C i en rysteinkubator ved 90 o/min.
- Overfør de permeabiliserede hjerneskiver i 8 ml PBS (–) i en 6-brønds cellekulturplade med en spatel og vask i 15 minutter ved at holde i en orbitalryster ved 40-60 o / min. Gentag dette to gange.
- Overfør hjerneskiverne i den forvarmede 8 ml ScaleS4-opløsning med en spatel og ryd dem ved at inkubere i en rysteinkubator ved 90 o / min i 8-12 timer ved 37 ° C. En ryddet hjerneskive ses i figur 1.
3. Montering af hjerneskiver
BEMÆRK: Et billedbehandlingskammer, der kan tilpasses, bruges til pålidelig montering af ryddede hjerneskiver (figur 2)6. Kammeret består af kammerrammen og bunddæksler. Mikroskoptrinadapterne er også designet til at montere billedkammeret direkte på mikroskopstadier (figur 2A, B). Kammerrammen og mikroskopstadieadapterne kan 3D-printes ved hjælp af interne eller outsourcede 3D-printtjenester. 3D computerstøttet design (CAD) data fra billedkammeret er tilvejebragt i Furuta et al. 20226.
- Til kammerforberedelse skal du fastgøre kammerrammen til en dækslip ved hjælp af et trykfølsomt klæbemiddel.
- Der fremstilles 1,5% agarose i ScaleS4D25(0)-opløsning (ScaleS4 gel) ved at tilsætte 1,5 g agarose til 100 ml af opløsningen i en flaske. Bland opløsningen godt ved omrøring og mikrobølge opløsningen, indtil agarosen er helt opløst. Når det er gjort, skal opløsningen afkøles til 37 °C.
- Monter den ryddede hjerneskive på billedkammerets bunddæksler med en spatel. Tør overskydende opløsning væk fra den ryddede skive med et rent fnugfrit silkepapir.
- Tilsæt ScaleS4 gel på hjerneskiven ved hjælp af en mikropipette til at fylde billedkammeret. Læg en anden dækslip ovenpå med tang og læg et stykke fnugfrit silkepapir og et glasglas på dækslippen i denne rækkefølge.
- Billedkammeret overføres til et køleskab ved 4 °C. Placer metalvægte på glasglasset og lad dem stå i 30 min.
- Fjern metalvægte, glasglas, fnugfrit silkepapir og dækslip fra billedkammeret, og tør overskydende gel væk (figur 2A, B).
- Anbring billedkammeret i en 60 mm glass petriskål, og fastgør kanten af billedkammeret til fadet med et spartellignende trykfølsomt klæbemiddel. Fastgør kammeret flere steder til petriskålen.
- Hæld ScaleS4-opløsning i fadet og ryst forsigtigt i 1 time ved 20-25 °C på en orbitalryster ved 40-60 o / min. Udskift med frisk opløsning, og fjern luftbobler på geloverfladen ved forsigtigt at skrabe overfladen med en 200 μL pipettespids. Monter det nedsænkede billeddannelseskammer på et mikroskoptrin (figur 2C).
4. CLSM-billedbehandling
- Indhent billeder ved hjælp af en CLSM udstyret med et multi-immersion objektivobjektiv på en lang arbejdsafstand (WD) (16x/0,60 numerisk blænde [NA], WD = 2,5 mm).
BEMÆRK: Objektiver med høj NA kan give en høj diffraktionsbegrænset opløsning. - Tænd for alt relevant billedbehandlingsudstyr (arbejdsstation, mikroskop, scanner, lasere og kviksølvlampe), og start en CLSM-billedbehandlingssoftware.
- Indstil korrektionskraven på objektivlinsen med multi-nedsænkning til 1,47. ScaleS4-opløsning har et brydningsindeks (RI) på ca. 1,47 5,7. RI-mismatch-inducerede afvigelser kan forstyrre billeddannelsen (figur 3).
- Nedsænk objektivlinsen i opløsningen, og lad den nærme sig skiven langsomt. Fjern eventuelle luftbobler, der er fanget på spidsen af objektivlinsen. Find regioner af interesse (RIE'er) i det ryddede væv ved hjælp af epifluorescens.
- Indstil parametre for billedoptagelse ved at teste passende indstillinger.
- Bestem bitdybden for billedoptagelse. Billedets datastørrelse øges med bitdybden.
- Indstil detektionsbølgelængden. Juster den passende port til detektoren i henhold til emissionsspektret. Sørg for, at detektionsbølgelængden ikke dækker nogen laserlinjer.
- Indstil xy-opløsningen . Større formater giver bedre xy-opløsninger , men det tager længere tid at indsamle billederne.
- Indstil scanningshastigheden. En langsommere scanningshastighed giver et højt signal/støj-forhold. Det øger dog også pixelens opholdstid og risikoen for fotobleaching. Vælg i overensstemmelse hermed.
- Juster pinhole-størrelsen. Pinhole-størrelsen styrer optisk sektionstykkelse. En mindre pinhole størrelse skaber en tyndere optisk sektion, og dermed bedre z opløsning, men reducerer fluorescens signal. At gøre pinhole-størrelsen større giver en tykkere optisk sektion med stærkere fluorescenssignal.
- Indstil lasereffekten, detektoren / forstærkerforstærkningen og forskydningen. Øg gradvist lasereffekten og detektor/forstærkerforstærkningen, indtil der opnås et passende billede. En høj lasereffekt medfører risiko for fotobleaching. Forskydningen (kontrasten) justeres korrekt for at opnå et højt signal/støj-forhold.
- Bestem det nødvendige fliseareal baseret på størrelsen af ROI. Sørg for, at hele længden og bredden af ROI er fanget.
- Naviger i de ryddede væv i alle planer, og indstil start- og slutpunkterne for stakken. Indstil z-trinstørrelsen i henhold til den ønskede z-opløsning.
- Indsaml billeder, når du er tilfreds med indstillingerne for billedoptagelse, og optag optagne billeder. Behandl billederne ved hjælp af en billedanalysesoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optisk rydning af en musehjerneskive med en tykkelse på 1 mm blev opnået ved hjælp af denne protokol. Figur 1B viser transmissionsbilleder af en musehjerneskive før og efter rydningsbehandlingen. Vævsrensningsmetoden gjorde en 1 mm tyk musehjerneskive gennemsigtig. En lille udvidelse i endelige størrelser af hjerneskiver blev fundet efter inkubationen i clearingopløsningen i 12 timer (lineær ekspansion: 102,5% ± 1,3%). Bevarelsen af fluorescens og vævets strukturelle integritet blev vurderet med målrettet EGFP-ekspression i plasmamembranen i PV-FGL-mus (figur 1C). I disse mus udtrykkes somatodendritisk membranmålrettet EGFP i PV-positive neuroner9. EGFP-ekspression rettet mod plasmamembranen i det somatodendritiske område blev opretholdt efter behandlingen (figur 1C). Derudover viser den tidligere EM-undersøgelse velbevaret strukturel integritet i hjernevæv ryddet med ScaleSF (supplerende figur 1)6.
RI-mismatch-inducerede afvigelser forårsagede et mærkbart tab af billedets lysstyrke og opløsning (figur 3). En 1 mm tyk hjerneskive pv-FGL-mus blev ryddet og afbildet under en CLSM udstyret med en multi-immersion objektiv linse af en lang WD. Justering af korrektionskraven på objektivlinsen til vandpositionen (RI 1.33) hæmmede klar visualisering af EGFP-positive neuroner placeret i dybden af 400 μm og 800 μm på grund af lav lysstyrke og lav kontrast. (Figur 3a,C). Disse neuroner blev tydeligt visualiseret med den samme CLSM, da korrektionskraven blev justeret til at matche ScaleS4-opløsningen (RI 1.47; Figur 3B,D). RI-matchning mellem en nedsænkningsvæske og objektiv linse er afgørende for nøjagtig 3D-billeddannelse i optisk ryddet væv.
Endelig blev musens neokortikale neuroner brugt til at demonstrere protokollens gennemførlighed. En musehjerne injiceret med AAV2/1-SynTetOff-EGFP vektor10 i den primære somatosensoriske cortex (S1) blev fikseret med 4% PFA i 0,1 M PB. Koronale skiver med 1 mm tykkelse blev fremstillet fra hjernen med en vibrerende vævsskiver. Efter rydning og montering på billeddannelseskammeret blev neuronal billeddannelse målrettet mod neokortiske neuroner udført (figur 4). En 3D-rekonstruktion af EGFP-mærkede neuroner i den 1 mm tykke hjerneskive er repræsenteret i figur 4A. Et billede med højere forstørrelse viser individuelle dendritiske arbors dekoreret med dendritiske rygsøjler (figur 4B). Vi viste yderligere axonterminale arboriseringer og aksonale boutoner i den kontralaterale cortex (figur 4C).
Figur 1: Optisk rydning af musehjerneskiver med en tykkelse på 1 mm. (A) Tidsplanen for ScaleSF-vævsrydning. (B) Transmissionsbilleder af en 1 mm tyk hjerneskive før (venstre) og efter (højre) behandling. (C) En 3D-volumengengivelse af hjernebarken hos en PV-FGL-mus ryddet ved hjælp af vævsrensningsmetoden. (D,E) xy-billeder i (C) i dybderne 250 μm (D) og 750 μm (E). (F,G) Udvidet billede af rektanglerne i (D) og (E). Billeder, der vises i (C-G), dekonvolitueres før gengivelsesprocessen. Forkortelser: pia = pia mater, WM = hvidt stof. Skalabjælke: 2 mm i (B), 500 μm i (C), 200 μm i (D, E) og 40 μm i (F, G). Dette tal er ændret fra Furata et al. 20226. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Et tilpasseligt 3D-printet billedbehandlingskammer til vævsskivevisualisering. (A,B) En skemategning (A) og billede (B) af et tilpasseligt 3D-printet billedbehandlingskammer. Billedkammeret består af en kammerramme, en bunddæksler og mikroskoptrinadaptere. Rensede vævsskiver anbringes på bunddækslen og indlejres i ScaleS4 gel. Kammerrammen, bunddæksler og mikroskoptrinadaptere kan tilpasses i henhold til størrelsen og tykkelsen af vævsskiver. (C) En billeddannelsesopsætning med billedkammeret. Billedkammeret nedsænkes i ScaleS4-opløsning i en petriskål og monteres på et trin i en opretstående CLSM. Dette tal er ændret fra Furata et al. 20226. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kompromitteret dyb billeddannelse forårsaget af en RI-mismatch mellem en objektiv linse og ScaleS4-opløsning. (A-D) xy billeder af hjernebarken hos en PV-FGL-mus i dybder på 400 μm (A, B) og 800 μm (C, D). Korrektionen af kraven på en objektiv linse med multi-nedsænkning justeres til 1,33 in (A,C) og 1,47 in (B,D). Billeder erhverves med de samme parametre undtagen RI'er for objektivlinsen. Skalalinje: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Neuronal billeddannelse i en 1 mm tyk musehjerneskive ryddet med ScaleSF. (A) Gengivelse af 3D-volumen af EGFP-mærkede museneurornatikale neuroner i S1. Neokortiske neuroner er mærket med AAV2/1 SynTetOff-EGFP vektoren. (B) Dendritiske arbors af EGFP-mærkede neokortikale neuroner. Et billede af maksimal intensitetsprojektion (MIP) fra en dybde på 39 μm til 48 μm er repræsenteret. Pilespidser angiver dendritiske rygsøjler. (C) EGFP-mærkede axonterminaler i den kontralaterale cortex. Et MIP-billede fra en dybde på 481,5 μm til 513 μm er repræsenteret. Pilespidser angiver aksonale boutoner. Billeder, der vises i (B) og (C), er dekondviklede. Skalastænger: 300 μm i (A) og 10 μm i (C). Bjælken i (C) gælder også for (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Ultrastruktur i hjerneskiver ryddet med ScaleSF, CUBIC og PACT. (A-C) Transmission EM-billeder af musens hjernebark ryddet med ScaleSF (A), CUBIC (B) og PACT (C). Musehjerner er fikseret med 4% PFA indeholdende 1% glutaraldehyd. Ultratynde sektioner fremstilles af ryddede hjerneskiver. Membranstrukturer er alvorligt beskadiget i hjerneskiver ryddet med CUBIC (B) og PACT (C). Pilespidser angiver postsynaptiske membraner. Vægtstang: 500 nm. Dette tal er ændret fra Furata et al. 20226. Klik her for at downloade denne fil.
| Opskrifter til ScaleS-løsninger | |
| ScaleS0-opløsning | |
| Reagens | Endelig fusion |
| D-sorbitol | 20% (w/v) |
| Glycerol | 5% (w/v) |
| Methyl-β-cyclodextrin | 1 mM |
| γ-cyclodextrin | 1 mM |
| Dimethylsulfoxid | 3% (v/v) |
| 10x PBS(–) | 1x |
| ScaleS4 opløsning | |
| Reagens | Endelig fusion |
| Urinstof | 4 mio. kr. |
| D-sorbitol | 40% (w/v) |
| Glycerol | 10% (w/v) |
| Triton X-100 | 0,2% (w/v) |
| Dimethylsulfoxid | 25% (v/v) |
| ScaleS4D25(0) opløsning | |
| Reagens | Endelig fusion |
| Urinstof | 4 mio. kr. |
| D-sorbitol | 40% (w/v) |
| Glycerol | 10% (w/v) |
| Dimethylsulfoxid | 25% (v/v) |
Tabel 1: Sammensætning af de tre ScaleS-opløsninger. Sammensætningerne af ScaleS0,ScaleS4 og ScaleS4D25(0) opløsninger er anført. For en detaljeret procedure for fremstilling af disse løsninger henvises til Miyawaki et al. 20167.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen
Der er et par kritiske trin i protokollen, der skal udføres med største forsigtighed for at opnå meningsfulde resultater. Ensartet fiksering af prøver er afgørende for 3D-billeddannelse i store væv. Objektivlinsen, prøven og nedsænkningsvæsken skal have matchende RI. RI-mismatch blandt dem vil føre til stærkt forstyrret billeddannelse af EGFP-ekspressive celler i de ryddede hjerneskiver (figur 3). Justeringen af objektivlinsen til nedsænkningsvæsken minimerer dybdeinducerede sfæriske afvigelser for at maksimere signalet, kontrasten og den rumlige opløsning i 3D-billeddannelse. RI'erne for de fremstillede opløsninger kan måles ved hjælp af et refraktometer.
Fejlfinding af teknikken
Længere opbevaring af løsningerne kan påvirke rydningsevnen og dens kapacitet til bevarelse af fluorescenssignaler og strukturel integritet. Frisklavede opløsninger skal anvendes. Disse opløsninger kan opbevares op til 1 måned ved 4 °C. Isometricity er afgørende for effektiv og effektiv neuronal billeddannelse med nøjagtig signalrekonstruktion. Selvom der blev observeret en lille udvidelse i prøvestørrelser efter inkubation i 12 timer (figur 1B), kan ekspansionen kontrolleres ved at reducere inkubationsperioden mellem 8-12 timer. For mere nøjagtig 3D-dybdebilleddannelse skal korrektionskraven muligvis justeres på et givet plan på grund af dybdeinduceret sfærisk afvigelse.
Ændringer af teknikken
I denne undersøgelse brugte vi musehjernevæv til at demonstrere protokollens gennemførlighed. Men den protokol, der er beskrevet her, kan også bruges til storhjernede dyr, såsom primater. Faktisk er denne protokol blevet brugt i almindelige marmoset (Callithrix jacchus) hjernevæv og lykkedes samtidig visualisering af neurale kredsløb og subcellulære strukturer af dets kortikostriale kredsløb6. Mikroskoptrinadapterne er designet til at montere billedkammeret på mikroskopstadier direkte6 (figur 2A, B). Ryddede vævsskiver kan observeres ved hjælp af et omvendt mikroskop gennem billedkammerets bunddæksler. Efter gendannelse af renset hjernevæv med PBS(-) (deScaling)5,11 kan vi forberede vævssektioner på 20-μm til 50-μm tykkelse fra hjernevæv, der blev ryddet med ScaleSF (re-sektionering)6. Subcellulære strukturer fanget i ryddet væv kan afbildes igen på re-sektioner med en høj NA-objektiv linse af en kort WD. Rydning af hjerneskiver perfunderet med fiksativer indeholdende glutaraldehyd er opnået ved hjælp af denne protokol, hvilket giver overlegen ultrastrukturbevarelse6. ScaleSF opnår et højt niveau af ultrastrukturbevarelse, der muliggør EM-analyse i optisk ryddet væv6 (supplerende figur 1). EM-kompatibiliteten af denne metode er især nyttig til billeddannelsesstrukturer med skalaerne fra makroskopisk til nanoskopisk niveau.
Begrænsninger af teknikken
Protokollen beskrevet her giver os mulighed for at visualisere neuronale strukturer fra kredsløb til subcellulære skalaer i hjerneskiver med 1 mm tykkelse. Der er dog stadig tre begrænsninger i protokollen. Den første er clearingprotokollens clearingkapacitet. ScaleSF er en clearingprotokol for hjerneskiver, ikke for hele hjernen. Selvom hjerneskiver med en tykkelse på 1 mm kan give god viden om dendritiske og lokale axonale arbors12, er information om axonale projektioner, der spænder over hele hjernen, fragmentarisk og ufuldstændig i skiverne 13,14,15,16. Den anden er billedopløsningen. Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her, lykkedes det os at visualisere subcellulære neuronale strukturer, såsom dendritiske rygsøjler og axonale boutoner, i en optisk ryddet hjerneskive (figur 4). Imidlertid er opløsningen af den objektive linse, der anvendes i denne undersøgelse, xy-opløsning på 400-750 nm, ikke tilstrækkelig til at løse mere fine strukturer af neuronale celler. Da objektiver med høj NA typisk er designet til oliesænkning (RI 1.52), kan RI-mismatch med løsningerne (RI 1.47) forhindre billeddannelse i høj opløsning med disse objektive linser. Den tredje er fluorescerende proteinmærkning af neuronale celler. Mærkningsmetoden begrænser brede anvendelser af vores billeddannelsesteknik. Histokemiske og / eller immunohistokemiske teknikker, der mærker væv i stor skala, samtidig med at vævsintegriteten opretholdes, ville betydeligt fremme protokollen her.
Betydning i forhold til eksisterende metoder og fremtidige anvendelser af teknikken
I denne undersøgelse beskriver vi en detaljeprotokol for neuronal billeddannelse fra mesoskopiske til mikroskopiske strukturer ved hjælp af ScaleSF vævsrensning. Protokollen beskrevet her gør det muligt at visualisere neuronale strukturer fra kredsløb til subcellulære niveauer i en rimelig tid uden specialudstyr, hvilket letter forståelsen af neuronale strukturer fra kredsløb til komponentskalaer. Neuroner uddyber sprudlende processer af enorm længde og arrangerer specialiserede fine strukturer til transmission og modtagelse af information. Neuronal billeddannelse kræver således en vævsrensningsmetode, der udøver potent clearingkapacitet samt et højt niveau af vævsbevarelse til samtidig visualisering af både store og små strukturer. Vævsrydningsmetoder med høje clearingfunktioner fjerner imidlertid aggressivt lipider og pigmenter til omfattende vævsafklaring 3,4, hvilket kompromitterer vævsintegriteten 5,6,17 (supplerende figur 1). Dette står i skarp kontrast til den clearingprotokol, der anvendes her, og som opnår et højt niveau af strukturbevaring6 (supplerende figur 1). Derfor giver ScaleSF-vævsclearing mulighed for effektiv og effektiv neuronal billeddannelse, der kræver multi-skala højopløsnings 3D-billeddannelse med nøjagtig signalrekonstruktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Yoko Ishida (Juntendo University) for AAV vektorproduktion og Kisara Hoshino (Juntendo University) for teknisk bistand. Denne undersøgelse blev støttet af JSPS KAKENHI (JP20K07231 til K.Y.; JP21H03529 til T.F.; JP20K07743 til M.K.; JP21H02592 til H.H.) og videnskabelig forskning om innovativt område "Resonans Bio" (JP18H04743 til H.H.). Denne undersøgelse blev også støttet af Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21dm0207112 til T.F. og H.H.), Moonshot R&D fra Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 til H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) fra JST (JPMJFR204D til H.H.), Grants-in-Aid fra Research Institute for Diseases of Old Age ved Juntendo University School of Medicine (X2016 til K.Y.; X2001 til H.H.) og Privatskolens brandingprojekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601 (2022).
- Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
- Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).
- Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
- Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
- Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), New York, N.Y. 2065-2077 (2009).
- Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
- Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331 (2016).
