L’ensemble structurel de l’alpha-synucléine monomérique affecte sa fonction physiologique et ses propriétés physico-chimiques. Le présent protocole décrit comment effectuer une spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium milliseconde et des analyses de données ultérieures pour déterminer des informations conformationnelles sur le monomère de cette protéine intrinsèquement désordonnée dans des conditions physiologiques.
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Article de méthode
Spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium milliseconde pour l’étude de la dynamique structurelle de l’alpha-synucléine dans des conditions physiologiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’alpha-synucléine (aSyn) est une protéine intrinsèquement désordonnée dont les agrégats fibrillaires sont abondants dans les corps de Lewy et les neurites, qui sont les caractéristiques de la maladie de Parkinson. Pourtant, une grande partie de son activité biologique, ainsi que son agrégation, implique de manière centrale la forme monomère soluble de la protéine. L’élucidation des mécanismes moléculaires de la biologie et de la physiopathologie d’aSyn nécessite des méthodes structurellement très résolues et est sensible aux conditions biologiques. Ses structures méta-stables dépliées nativement rendent l’aSyn monomère intraitable à de nombreuses techniques de biologie structurale. Ici, l’application d’une telle approche est décrite: spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium (HDX-MS) sur l’échelle de temps de la milliseconde pour l’étude de protéines à faible stabilité thermodynamique et à faibles facteurs de protection, tels que aSyn. À l’échelle de temps de la milliseconde, les données HDX-MS contiennent des informations sur l’accessibilité des solvants et la structure liée à l’hydrogène d’aSyn, qui sont perdues à des temps d’étiquetage plus longs, ce qui donne finalement une résolution structurelle jusqu’au niveau d’acide aminé. Par conséquent, HDX-MS peut fournir des informations à des résolutions structurelles et temporelles élevées sur la dynamique conformationnelle et la thermodynamique, les interactions intra- et intermoléculaires et l’impact structurel des mutations ou des altérations des conditions environnementales. Bien que largement applicable, il est démontré comment acquérir, analyser et interpréter des mesures HDX-MS millisecondes dans aSyn monomère.
Introduction
La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative qui touche des millions de personnes dans le monde1. Elle se caractérise par la formation d’inclusions cytoplasmiques connues sous le nom de corps de Lewy et de neurites de Lewy dans la région de la substantia nigra pars compacta du cerveau. Ces inclusions cytoplasmiques contiennent des agrégats de la protéine intrinsèquement désordonnée aSyn2. Dans la MP et d’autres synucléinopathies, aSyn se transforme d’un état désordonné soluble en un état malade insoluble et hautement structuré. Dans sa forme native, l’aSyn monomère adopte une large gamme de conformation....
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Protocole
1. Expression des protéines et purification d’aSyn
- Préparez aSyn à la suite d’un rapport9 publié précédemment.
- Dialyze dans un tampon de stockage sûr (par exemple, Tris, pH 7,2 ).
- Au besoin, concentrer l’échantillon (p. ex., tubes de microcentrifugation à filtre rotatif utilisant 3 kDa MWCO, 14 000 x g pendant environ 10 à 30 min, voir tableau des matériaux).
REMARQUE: Il est conseillé de ne pas se concentrer excessivement. L’intégrité de l’ensemble monomère n’a pas été vérifiée au-delà de 25 μM. - Aliquote et conserver à −80 °C
REMARQUE: La protéine monomère....
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Résultats
En raison de sa nature intrinsèquement désordonnée, il est difficile de capturer les changements structurels complexes dans aSyn à pH physiologique. HDX-MS surveille l’échange isotopique au niveau des hydrogènes amides dorsaux, sondant la dynamique et les interactions conformationnelles des protéines. C’est l’une des rares techniques pour acquérir ces informations à des résolutions structurelles et temporelles élevées. Ce protocole est largement applicable à un large éventail de protéines et de conditions tampons, et cel.......
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Discussion
Dans le présent article, les procédures suivantes sont décrites: (1) effectuer des expériences de cartographie peptidique sur aSyn monomère pour obtenir la couverture de séquence la plus élevée, (2) acquérir des données HDX-MS millisecondes sur aSyn monomère dans des conditions physiologiques, et (3) effectuer l’analyse des données et l’interprétation des données HDX-MS résultantes. Les procédures fournies sont généralement simples à exécuter, chaque expérience d’étiquetage ne dure généralement qu’environ 8 h pour trois .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Remerciements
NS est financé par la bourse du jubilé de diamant du Conseil de l’Université. JJP est soutenu par une bourse UKRI Future Leaders [Numéro de subvention : MR/T02223X/1].
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1 × ; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &mu ; m C18 colonne ; | Waters Corporation | 186002346 | Colonne analytique |
| Acétonitrile HPLC grade >99,9 % HiPerSolv | VWR | 20060.420 | Pour phases mobiles LC |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Sel pour tampons HDX |
| Chronos | Axel Semrau (Acheté auprès de Waters Corporation) | 667006090 | Logiciel de planification pour permettre automatiquement plusieurs injections d’échantillons HDX-MS. D’autres logiciels sont disponibles auprès d’autres fournisseurs, par exemple HDXDirector ou LEAP |
| Shell Chlorure de deutérium | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | Pour les tampons de marquage HDX |
| Oxyde de deutérium (99,9 % D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | Eau deutérée |
| DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | Assignation isotopique et calcul de l’incorporation du deutérium |
| Enzymate BEH Pepsin | Column Waters Corporation | 186007233 | Pepsin |
| Digestion Column Acide formique, 99,0 % LC/MS Grade | Fisher Scientific | 10596814 | Pour les phases mobiles LC |
| Chlorhydrate de guanidinium | Sigma Aldrich | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturant |
| HDfleX | Université d’Exeter | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | Sel pour tampons HDX |
| LEAP HDX-2 CTC Robot d’échantillonnage PAL | Waters Corporation | 725000637 | Robot passeur d’échantillons |
| Leucine enkephalin Waters | Corporation | 186006013 | Pour l’étalonnage par spectrométrie de masse. |
| MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | Logiciel contrôlant les méthodes d’entrée et le spectromètre |
| de masse Flacons de récupération maximale | Waters Corporation | 600000670CV | 100 pack avec bouchons - utilisé pour le plateau de trempe dans LEAP HDX-2 |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Sel pour tampons HDX |
| Millipore 0.22 µ ; Filtres pour seringues m | pour | seringues | Millipore |
| ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | Instrument hdx hdx milliseconde à mélange rapide |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | Sel pour tampons HDX |
| Régulateur de température Peltier | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | pour régler avec précision la température des chambres dans le robot LEAP. |
| ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | logiciel d’identification de peptides. D’autres logiciels sont disponibles auprès d’autres fournisseurs. |
| Bouchons de pots de réactifs | Waters Corporation | 186004632 | paquet de 100 |
| Pots de réactifs pour LEAP HDX-2 | Waters Corporation | 186001420 | paquet de 100 sans bouchons - utilisés pour les tampons dans LEAP HDX-2 |
| Deutéroxyde de sodium (99,5 % dans le D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | Pour tampons d’étiquetage HDX |
| Filtres de spin Tubes à microcentrifugeuse (3 kDa MWCO) | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | Micro tubes à centrifuger pour concentrer les protéines. Cela facilite l’échange de tampons et le chargement précis des échantillons pour les expériences HDX-MS. |
| Spectromètre de masse Synapt G2-Si | Waters Corporation | 176850035 | Spectromètre |
| de masse Flacons de récupération totale | Waters Corporation | 600000671CV | 100 pack avec bouchons - utilisé pour l’étiquetage du plateau dans LEAP HDX-2 |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | Tampon |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | |
| Tampon Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Dénaturant |
| VanGuard 2,1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 colonne ; | Waters Corporation | 186004623 | Trap colonne de dessalement |
Références
- Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
- Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N.
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Réimpressions et autorisations
