生理学的条件下でのα-シヌクレイン構造ダイナミクスの研究のためのミリ秒水素/重水素交換質量分析
Summary
単量体α-シヌクレインの構造アンサンブルは、その生理学的機能および物理化学的特性に影響を及ぼす。本プロトコルは、ミリ秒の水素/重水素交換質量分析およびその後のデータ分析を実行して、生理学的条件下でこの本質的に無秩序なタンパク質のモノマー上の立体構造情報を決定する方法を記載する。
Abstract
α-シヌクレイン(aSyn)は、パーキンソン病の特徴であるレビー小体および神経突起に線維凝集体が豊富に存在する本質的に障害のあるタンパク質である。しかし、その生物学的活性の多くは、その凝集と同様に、タンパク質の可溶性モノマー形態を中心的に含む。aSyn生物学や病態生理学の分子機構の解明には、構造的に高度に解像された方法が必要であり、生物学的条件に敏感である。そのネイティブに展開された準安定構造は、単量体aSynを多くの構造生物学技術にとって扱いにくくする。ここでは、そのようなアプローチの1つの適用が説明されています:aSynのような低い熱力学的安定性と弱い保護因子を有するタンパク質の研究のためのミリ秒時間スケールでの水素/重水素交換質量分析(HDX-MS)。ミリ秒の時間スケールでは、HDX-MSデータにはaSynの溶媒アクセス性と水素結合構造に関する情報が含まれており、これらはより長い標識時間で失われ、最終的にアミノ酸レベルまでの構造分解能が得られます。したがって、HDX-MSは、立体構造ダイナミクスと熱力学、分子内および分子間相互作用、および環境条件に対する突然変異または変化の構造的影響に関する情報を高い構造的および時間的分解能で提供することができます。広く適用可能ですが、単量体aSynでミリ秒のHDX-MS測定値を取得、分析、および解釈する方法が示されています。
Introduction
パーキンソン病(PD)は、世界中の何百万人もの人々が罹患している神経変性疾患です1。これは、脳の黒質パースコンパクタ領域におけるレビー小体およびレビー神経突起として知られている細胞質封入物の形成によって特徴付けられる。これらの細胞質封入体は、本質的に障害のあるタンパク質aSyn2の凝集体を含有することが見出されている。PDおよび他のシヌクレイノパシーにおいて、aSynは可溶性障害状態から不溶性で高度に構造化された罹患状態に変化する。その天然形態において、単量体aSynは、そのN末端およびC末端間の長距離静電相互作用およびそのC末端および非アミロイドベータ成分(NAC)領域との間の疎水性相互作用によって安定化される広範囲の立体構造を採用する3,4,5,6。突然変異、翻訳後修飾、および局所環境の変化など、それらの安定化相互作用の中断は、モノマーのミスフォールディングにつながり、したがって凝集のプロセスを引き起こす可能性がある7。
aSyn 8,9,10,11のオリゴマー型およびフィブリル型に関する膨大な量の研究が存在するが、タンパク質のモノマー型を研究し、どのコンフォーマーが機能的であり(そしてどのように)、どのコンフォーマーが凝集しやすいかをよりよく理解することが極めて重要である8,9,10,11.本質的に無秩序であり、サイズがわずか14kDaであり、結晶化が困難なaSynモノマーは、ほとんどの構造生物学的技術に順応性がない。しかし、単量体aSynの立体構造ダイナミクスを測定できる技術の1つはミリ秒HDX-MSであり、これは最近、そうでなければ得ることが困難または不可能であろう重要な構造観察を生成している12,13,14。ミリ秒のHDX-MSは、アミド水素での同位体交換を監視することによってタンパク質立体構造アンサンブルの平均を敏感に測定し、ミリ秒の時間スケールでの特定のタンパク質領域の溶媒アクセス性と水素結合ネットワークの関与を示します。HDX-MSのミリ秒の側面を強調する必要があるのは、そのネイティブに展開された準安定な性質のために、aSynは従来のHDX-MSシステムの下限をはるかに下回る非常に高速な水素交換動力学を示すためです。例えば、aSyn分子の大部分は、細胞内条件下で1秒未満で水素を重水素と完全に交換した。現在、いくつかの研究所が高速混合計装を構築しています。この場合、デッドタイム50ms、時間分解能1msのHDX-MSを実行できる高速混合クエンチフロー装置のプロトタイプを使用します15。ミリ秒のHDX-MSは最近、aSynの研究において非常に重要になっていますが、本質的に障害のあるタンパク質/領域をより広く研究し、ループ/領域が弱くしか安定していない多数のタンパク質を研究する上で価値があります。例えば、ペプチド薬(例えば、インスリン;GLP-1/グルカゴン;チルゼパチド)およびペプチド融合タンパク質(例えば、HIV阻害剤FN3-L35-T1144)は、溶液相の構造および安定性情報が医薬品開発の決定に重要な入力となり得る主要な薬物フォーマットであり、それでも、ペプチド部分は、しばしば、HDX-MSによって秒単位のタイムスケール16、17、18、19、20で弱く安定で難治性である。.秒/分ドメインに標識を有する創発的なHDX-MS法は、DNA G-四重鎖の構造情報を導出することが示されているが、ミリ秒のHDX-MS21の適用によって、これをより多様なオリゴヌクレオチド構造に拡張することが可能であるはずである。
HDX-MS実験は、(1)ボトムアップ(標識タンパク質がタンパク質分解的に消化される)、(2)ミドルダウン(標識タンパク質がタンパク質分解的に消化され、得られたペプチドがソフトフラグメンテーション技術によってさらにフラグメント化される)、および(3)トップダウン(ソフトフラグメンテーション技術によって標識タンパク質を直接フラグメント化する)の3つの異なるレベルで行うことができる22。.したがって、サブ分子HDX-MSデータにより、タンパク質の特定の領域に交換挙動を局在化することができ、そのような実験に適切な配列カバレッジを持つことが不可欠です。HDX-MS実験の構造分解能は、消化時またはソフトフラグメンテーション時にタンパク質に由来するタンパク質分解ペプチドまたはフラグメントの数にそれぞれ依存します。上記で概説した3つの実験タイプのそれぞれにおいて、各ペプチド/断片におけるアミド交換の変化は、タンパク質の一次構造にマッピングされ、タンパク質の局在領域の挙動を示す。最高の構造分解能はソフトフラグメンテーションによって達成されますが、これらの実験の説明は、aSynモノマー立体配座の測定に焦点を当てた現在の研究の範囲外です。ここで説明する一般的に適用される「ボトムアップ」ワークフローを使用すると、優れた結果を得ることができます。
ここでは、(1)aSynサンプルおよびHDX-MSバッファーを調製および処理する方法、(2)ボトムアップHDX-MS実験のためのペプチドマッピングを実行する方法、(3)生理学的条件下で、具体的にはミリ秒の時間領域で単量体aSynに関するHDX-MSデータを取得する方法(カスタムビルドの機器を使用して;ミリ秒標識のための代替機器も記載されている)、 (4)HDX-MSデータの処理方法と分析方法ここでは、2つの溶液条件下で生理学的pH(7.40)で単量体aSynを使用する方法が例示される。aSynの研究において極めて有用であるが、これらの手順は、任意のタンパク質に適用することができ、本質的に障害のあるタンパク質に限定されない。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、(1)単量体aSynのペプチドマッピング実験を実行して最高の配列カバレッジを得ること、(2)生理学的条件下で単量体aSynに関するミリ秒間のHDX-MSデータを取得すること、および(3)得られたHDX-MSデータのデータ分析および解釈を実行する手順について説明します。提供される手順は一般的に実行が簡単で、各ラベリング実験は通常、3回の反復と8つのタイムポイントに対して約8時間しか?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NSは、大学評議会ダイヤモンドジュビリー奨学金によって資金提供されています。JJPはUKRIフューチャー・リーダーズ・フェローシップ[助成金番号:MR/T02223X/1]の支援を受けています。
Materials
| 1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column | Waters Corporation | 186002346 | Analytical column |
| Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | For LC mobile phases |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Salt for HDX buffers |
| Chronos | Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) | 667006090 | Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell |
| Deuterium chloride | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | For HDX labelling buffers |
| Deuterium oxide (99.9% D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | Deuterated water |
| DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation |
| Enzymate BEH Pepsin Column | Waters Corporation | 186007233 | Pepsin digestion column |
| Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade | Fisher Scientific | 10596814 | For LC mobile phases |
| Guanidinium hydrochloride | Sigma Aldrich | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturant |
| HDfleX | University of Exeter | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | Salt for HDX buffers |
| LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot | Waters Corporation | 725000637 | Autosampler robot |
| Leucine enkephalin | Waters Corporation | 186006013 | For mass spectrometry lockspray calibration. |
| MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | Software controlling inlet methods and mass spectrometer |
| Maximum recovery vials | Waters Corporation | 600000670CV | 100 pack including caps – used for quench tray in LEAP HDX-2 |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Salt for HDX buffers |
| Millipore 0.22 µm syringe filters | Millipore | N9CA7069B | Syringe filters |
| ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | Salt for HDX buffers |
| Peltier temperature controller | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot. |
| ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors. |
| Reagent pot caps | Waters Corporation | 186004632 | 100 pack |
| Reagent pots for LEAP HDX-2 | Waters Corporation | 186001420 | 100 pack excluding caps – used for buffers in LEAP HDX-2 |
| Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | For HDX labelling buffers |
| Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments. |
| Synapt G2-Si mass spectrometer | Waters Corporation | 176850035 | Mass spectrometer |
| Total recovery vials | Waters Corporation | 600000671CV | 100 pack including caps – used for labelling tray in LEAP HDX-2 |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | Buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | Buffer |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Denaturant |
| VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column | Waters Corporation | 186004623 | Trap desalting column |
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