Trasplante cardíaco cervical heterotópico de ratón utilizando manguitos vasculares
Summary
Los modelos de trasplante cardíaco de ratón representan valiosas herramientas de investigación para estudiar la inmunología del trasplante. El presente protocolo detalla el trasplante cardíaco cervical heterotópico de ratón que implica la colocación de manguitos en la arteria carótida común del receptor y el tronco de la arteria pulmonar del donante para permitir el flujo sanguíneo laminar.
Abstract
Los modelos murinos de trasplante cardíaco se utilizan con frecuencia para estudiar la lesión por isquemia-reperfusión, las respuestas inmunes innatas y adaptativas después del trasplante y el impacto de las terapias inmunomoduladoras en el rechazo del injerto. El trasplante cardíaco cervical heterotópico en ratones se describió por primera vez en 1991 utilizando anastomosis suturadas y posteriormente se modificó para incluir técnicas de manguito. Esta modificación permitió mejorar las tasas de éxito, y desde entonces, ha habido múltiples informes que han propuesto nuevas mejoras técnicas. Sin embargo, la traducción a una utilización más generalizada sigue siendo limitada debido a la dificultad técnica asociada con las anastomosis del injerto, que requiere precisión para lograr la longitud y el calibre adecuados de los manguitos para evitar la torsión anastomótica vascular o la tensión excesiva, que puede resultar en daño al injerto. El presente protocolo describe una técnica modificada para realizar un trasplante cardíaco cervical heterotópico en ratones que consiste en la colocación del manguito en la arteria carótida común del receptor y la arteria pulmonar del donante en alineación con la dirección del flujo sanguíneo.
Introduction
Abbott et al. publicaron1 la primera descripción del trasplante de corazón abdominal heterotópico en ratas en 1964. Estas técnicas quirúrgicas fueron refinadas y simplificadas por Ono et al. en 19692. Corry et al. describieron por primera vez un método para el trasplante de corazón abdominal heterotópico en ratones en 1973; Similar a los modelos de rata previamente reportados, esto implicó el injerto en el abdomen del huésped con revascularización por anastomosis de extremo a lado de la arteria pulmonar del donante y la aorta ascendente a la vena cava inferior y la aorta abdominal del receptor, respectivamente3. El trasplante cardíaco cervical heterotópico en ratas fue descrito por Heron en 1971 utilizando manguitos de teflón hechos de catéteres intravenosos de 16 G (1,6 mm de diámetro exterior)4. Chen5 y Matsuura et al.6 informaron más tarde de un trasplante cardíaco cervical heterotópico en ratones en 1991, cuyas técnicas diferían principalmente en su método de reanastomosis. El abordaje de Chen implicó anastomosis suturadas de la aorta ascendente del donante a la arteria carótida del receptor y de la arteria pulmonar del donante a la vena yugular externa del receptor5. Debido a la habilidad técnica avanzada requerida para estas anastomosis suturadas microquirúrgicas, se necesitó una cantidad significativa de tiempo y experiencia para lograr una alta tasa de éxito. Matsuura et al. describieron un método que utilizaba una técnica de manguito sin sutura, similar a la utilizada por Heron, que involucraba anastomosis de extremo a extremo utilizando la colocación extraluminal de puños. Fabricó manguitos de teflón a partir de catéteres intravenosos de 22 G (0,8 mm de diámetro exterior) y 24 G (0,67 mm de diámetro exterior) y los colocó sobre la vena yugular externa y la arteria carótida común del receptor, respectivamente6. Estos manguitos se colocaron dentro de la arteria pulmonar y la aorta del donante y se aseguraron atando una ligadura de sutura alrededor de la conexión. Este enfoque se tradujo en una mejor tasa de éxito. Lo más importante es que resultó en un acortamiento del tiempo requerido para completar ambas anastomosis cervicales, reduciendo así el tiempo isquémico caliente del injerto a menos de un tercio del que utiliza el método de sutura abdominal. Además, dado que los puños se colocan alrededor de la superficie externa del vaso, no hay cuerpo extraño expuesto a la luz del vaso, lo que reduce en gran medida la posibilidad de trombosis después de la cirugía7. Mientras tanto, la utilización de la técnica del manguito proporciona soporte alrededor de los vasos en el sitio de la anastomosis sin requerir sutura, lo que reduce el riesgo de sangrado después de la revascularización6.
Se han propuesto numerosas revisiones de esta técnica. Para acomodar la corta longitud de la arteria carótida común del ratón (aproximadamente 5 mm), Tomita et al.8 desarrollaron una modificación de esta técnica con un manguito arterial más pequeño (0,6 mm de diámetro exterior), omitiendo suturas de sutura y tirando de la arteria directamente a través del manguito con fórceps finos. Wang et al. simplificaron aún más este enfoque colocando manguitos de 22 G y 24 G en la arteria pulmonar derecha del donante y en la arteria carótida común derecha del receptor, respectivamente9. Varios relatos han descrito modificaciones a estos enfoques, incluyendo el uso de manguitos especializados, pinzas microquirúrgicas, dilatadores de vasos y cardioplejía10,11,12. En particular, todos estos métodos implican la circulación retrógrada de la sangre a través del corazón, con sangre que fluye desde la arteria carótida común receptora hasta la aorta del donante, las arterias coronarias, el seno coronario, luego se vacía en la aurícula derecha y sale de la arteria pulmonar hacia la vena yugular externa receptora.
En comparación con el injerto en el abdomen, el trasplante cardíaco cervical ofrece múltiples ventajas. Como se mencionó anteriormente, la exposición cervical permite una revascularización más rápida y tiempos isquémicos cálidos máscortos 6. El método cervical también es menos invasivo y se asocia con tiempos de recuperación postoperatoria más cortos, ya que evita una laparotomía6. Es importante destacar que se pueden realizar anastomosis de extremo a extremo con manguitos en lugar de anastomosis de extremo a lado, lo que disminuye el riesgo de complicaciones como el sangrado anastomótico. El abordaje abdominal también plantea un mayor riesgo de desarrollar complicaciones trombóticas en la aorta abdominal o la vena cava inferior, lo que lleva a isquemia de la médula espinal y parálisis de las extremidades posteriores. La ubicación cervical superficial del trasplante permite un fácil acceso a la evaluación de la viabilidad del injerto mediante palpación, electrocardiografía e imágenes invasivas o no invasivas. Aunque los injertos cervicales reanudan la actividad cardíaca espontánea después de la reperfusión, no afectan significativamente los parámetros sistólico y diastólico del receptor. Este modelo proporciona información valiosa para estudiar las respuestas celulares después del trasplante, como la lesión por isquemia-reperfusión y el rechazo del injerto. Además, este modelo ofrece un enfoque ideal para permitir imágenes posteriores al trasplante, como la microscopía intravital de dos fotones o la tomografía por emisión de positrones (PET). Con este fin, nuestro laboratorio ha reportado previamente métodos para obtener imágenes de tejidos y órganos en movimiento en el ratón, incluyendo corazones murinos latiendo e injertos de arco aórtico después del trasplante cervical heterotópico para visualizar el tráfico de leucocitos durante la lesión por isquemia-reperfusión y dentro de las placas ateroscleróticas, respectivamente13,14,15 . Además, debido a su ubicación superficial y facilidad de exposición, este modelo es adecuado para el retrasplante cardíaco16.
Este informe describe una técnica que permite el flujo sanguíneo laminar con la colocación externa de los manguitos vasculares en los vasos de los que se origina el flujo sanguíneo. Esto permite una transición suave del flujo sanguíneo de un vaso a otro, evitando la exposición del borde del vaso distal en la luz vascular. Además, la técnica utiliza un manguito más grande de 20 G, en lugar de los manguitos de 22 G utilizados anteriormente, para la arteria pulmonar del donante para garantizar un amplio retorno del flujo sanguíneo al receptor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizando esta técnica, el trasplante cardíaco cervical heterotópico de ratón puede ser realizado en menos de 40 minutos por un microcirujano experimentado y en aproximadamente 60 minutos por un microcirujano de nivel básico. Mientras que el trasplante de corazón cervical ha sido estudiado en numerosos modelos animales, un modelo de ratón sigue siendo el estándar de oro debido a múltiples cepas genéticas bien definidas, capacidades de alteración genética y la disponibilidad de numerosos reactivos, incluyendo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DK cuenta con el apoyo de las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud 1P01AI116501, R01HL094601, R01HL151078, la subvención de revisión de mérito de la Administración de Veteranos 1I01BX002730 y la Fundación para el Hospital Barnes-Judy.
Materials
| 6-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 7718729 | |
| 0.75% Providone iosine scrub | Priority Care Inc | NDC 57319-327-0 | |
| 10-0 nylon suture | Surgical Specialties Corporation | AK-0106 | |
| 655-nm nontargeted Q-dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc | 111000140 | |
| 8-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 1005597 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools Inc | 91127-12 | |
| BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks) | Jackson Laboratories | ||
| Bipolar coagulator | Valleylab Inc | SurgII-20, E6008/E6008B | |
| Carprofen (Rimadyl) injection | Transpharm | 35844 | |
| Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet | Transpharm | 38995/37919 | |
| Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software | A&B Software | ||
| Dumont no. 5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11251-20 | |
| Fine vannas style spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15000-03 | |
| GraphPad Prism 5.0 | Sun Microsystems Inc. | ||
| Halsey needle holder | Fine Science Tools Inc | 91201-13 | |
| Halsted-Mosquito clamp curved tip | Fine Science Tools Inc | 91309-12 | |
| Harvard Apparatus mouse ventilator model 687 | Harvard Apparatus | MA1 55-0001 | |
| Heparin solution (100 U/mL) | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine (50 mg/kg) | Wyeth | 206205-01 | |
| Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification | Leica Microsystems | ||
| Moria extra fine spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15396-00 | |
| Ohio isoflurane vaporizer | Parkland Scientific | V3000i | |
| Qdots | ThermoFisher | 1604036 | |
| S&T SuperGrip Forceps angled tip | Fine Science Tools Inc | 00649-11 | |
| S&T SuperGrip Forceps straight tip | Fine Science Tools Inc | 00632-11 | |
| Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride | Hospira Inc | NDC 0409-4888-20 | |
| Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators) | Puritan Medical Company LLC | 823-WC | |
| Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | SR-OX2032CA | |
| Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | R-OX2419CA | |
| ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity) | Thermocare Inc | ||
| VetBond | Santa Cruz Biotechnology SC361931 | NC0846393 | |
| Xylazine (10 mg/kg) | Lloyd Laboratories | 139-236 |
References
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