Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kartläggning av billiga metoder för att mäta livslängd och hälsa i Caenorhabditis elegans

Published: May 18, 2022 doi: 10.3791/64091
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

Caenorhabditis elegans fungerar som ett utmärkt modellsystem med robusta och billiga metoder för att kartlägga hälsa, livslängd och motståndskraft mot stress.

Abstract

Upptäckten och utvecklingen av Caenorhabditis elegans som modellorganism var inflytelserik inom biologin, särskilt inom åldrandet. Många historiska och samtida studier har identifierat tusentals livslängdsförändrande paradigmer, inklusive genetiska mutationer, transgent genuttryck och hormesis, en fördelaktig, låggradig exponering för stress. Med sina många fördelar, inklusive en kort livslängd, enkelt och billigt underhåll och helt sekvenserat genom med homologi till nästan två tredjedelar av alla mänskliga gener, har C. elegans snabbt antagits som en enastående modell för stress- och åldrandebiologi. Här kartläggs flera standardiserade metoder för att mäta livslängd och hälsospann som enkelt kan anpassas till nästan vilken forskningsmiljö som helst, särskilt de med begränsad utrustning och medel. Den otroliga nyttan av C. elegans presenteras, vilket belyser förmågan att utföra kraftfulla genetiska analyser inom åldrandebiologi utan att behöva omfattande infrastruktur. Slutligen diskuteras begränsningarna för varje analys och alternativa tillvägagångssätt för övervägande.

Introduction

Sedan publiceringen av 'The genetics of Caenorhabditis elegans', en av de mest inflytelserika artiklarna av Sydney Brenner 1974, har denna mikroskopiska mask ansetts vara ett enastående modellsystem för att studera biologiska mysterier1. 1977 publicerade Michael R. Klass metoden för att mäta livslängden hos C. elegans och etablerade detta modellsystem för att studera åldrande2. Undersökningen för att förstå sambandet mellan stress och livslängd har börjat med identifieringen av en enda mutation i ålder-1-genen, vilket resulterade i en livslängdsförlängning i C. elegans3. Dessutom har samtida studier identifierat andra livslängdshöjande mutationer, som avslöjade långlivade mutanta maskar som uppvisar ökad motståndskraft mot stress 4,5,6. Med sina många fördelar, inklusive en kort livslängd, enkelt underhåll, helt sekvenserat genom som innehåller homologi till cirka två tredjedelar av alla mänskliga sjukdomsframkallande gener, tillgänglighet och lätthet att använda RNA-interferensbibliotek (RNAi) och fysiologisk likhet med människor 7,8,9, har C. elegans snabbt antagits som en enastående modell för stress- och åldrandebiologi.

De kanske största verktygen för C. elegans är dess extremt låga underhållskostnader, enkla experiment och de olika genetiska verktyg som finns tillgängliga för studier. C. elegans odlas vanligtvis på ett fast agarmedium med en E. coli-matkälla. Två vanliga E. coli-stammar är standard OP50, en B-stam som kanske är den vanligaste10, och HT115, en K-12-stam som främst används för RNAi-experiment11,12. HT115 K-12-stammen bär en deletion i RNAIII RNase, en mutation som är väsentlig för RNAi-metoder, där plasmider som uttrycker dsRNA motsvarande enskilda C. elegans-gener används. DSRNA-matningsvektorerna möjliggör robust knockdown av C. elegans-gener utan behov av komplexa korsningar eller genomredigering, eftersom bakterier som bär dessa plasmider kan matas direkt till nematoder. Tusentals av dessa bakteriella RNAi-vektorer finns i HT115-bakgrunden, inklusive det mest populära Vidal RNAi-biblioteket med >19 000 enskilda RNAi-konstruktioner13 och Ahringer RNAi-biblioteket med 16 757 RNAi-konstruktioner14. Emellertid, OP50 och HT115 bakteriedieter har stora skillnader i metabolisk profil, inklusive skillnader i Vitamin B1215,16. Därför rekommenderas att utföra alla experiment på en enda bakteriekälla, om möjligt, för att undvika gen-dietinteraktioner som kan introducera flera förvirrande faktorer som tidigare beskrivits 17,18,19. På grund av sin lätthet upprätthålls djur på OP50 för alla experimentella förhållanden som beskrivs här, men alla experiment utförs på HT115 som tidigarebeskrivits 20. I korthet bibehålls djuren vid OP50 och överförs till HT115 efter synkronisering (efter blekning) för konsistens mellan RNAi kontra icke-RNAi-experiment. Alternativt kan en RNAi-kompetent OP50-stam som bär en liknande deletion av RNAIII RNas som finns i E. coli K12 HT115-stammen också användas21.

Kanske är en stor begränsning för RNAi-experiment i C. elegans oro för knockdown-effektivitet. Medan knockdown-effektivitet kan valideras via qPCR eller western blotting, kräver dessa dyr utrustning och reagenser och är begränsade till bulkanalys. Detta är ännu mer oroande att titta på specifika celler, såsom neuroner, som är eldfasta (mindre känsliga) för RNAi. Medan RNAi-effektiviteten i specifika celler kan förbättras via överuttryck av SID-1, transmembranproteinet som är viktigt för dsRNA-upptag22, är detta fortfarande begränsat till de celltypspecifika uttrycksmönstren för promotorerna som används för dessa konstruktioner, och därmed är gen knockouts och mutationer det mest idiotsäkra sättet att tömma genfunktioner. Utöver RNAi-medierad knockdown är C. elegans också mycket mottagliga för genomredigering med CRISPR-baserade strategier 23,24,25 och transgen konstruktionsöveruttryck genom mikroinjektioner, med möjlighet att integrera transgena konstruktioner genom bestrålning eller transposonbaserad integration 26,27,28,29 . Dessa metoder kräver dock dyr mikroinjektionsutrustning, och de höga kostnaderna för guide-RNA eller Cas9-enzym kan förbjuda dessa metoder i institutioner med begränsad finansiering. Istället är tusentals transgena linjer och mutanter lätt tillgängliga för några dollar både på Caenorhabditis Genetics Center (CGC) och National Bioresource Project (NBRP). NBRP erbjuder isolerade mutanter för ett stort antal C. elegans-gener, inklusive publicerade och därför verifierade mutantstammar, mutanter härledda från pilotprojekt och mutanter som ännu inte har karakteriserats. Däremot är CGC en förvaringsplats för mestadels publicerade och etablerade C. elegans-linjer från forskarsamhället. Båda skickar stammar över hela världen till mycket rimliga priser och erbjuder ett brett utbud av alternativ för dem med begränsad kapacitet att syntetisera stammar internt.

Här erbjuds en kurerad metodsamling, som sannolikt är de billigaste metoderna för att analysera livslängd och hälsospann i C. elegans. Alla metoder som presenteras här kräver billig utrustning och förnödenheter och använder endast stammar som är lätt tillgängliga från CGC. Kanske mest oöverkomligt för livslängd och överlevnadsanalyser i C. elegans är kostnaden för Nematode Growth Media (NGM) plattor. Eftersom C. elegans är hermafroditer och självbefruktade, kräver standardöverlevnadsanalyser att vuxna djur kontinuerligt flyttas bort från sin avkomma för att undvika kontaminering från avkomman. Denna process är inte bara tidskrävande, den kan bli dyr på grund av behovet av cirka 100 plattor per tillstånd för att köra en enda livslängdsanalys. Här tillhandahålls två alternativ: användning av den temperaturkänsliga bakterielösa mutanten, glp-4 (bn2) eller kemisk sterilisering med 5-fluor-2'-deoxiuridin (FUDR). glp-4 kodar för ett valylaminoacyl-tRNA-syntetas, och det temperaturkänsliga glp-4(bn2) är reproduktivt bristfälligt vid restriktiva temperaturer på grund av minskad proteinöversättning30,31. FUDR är en robust metod för att kemiskt sterilisera C. elegans genom att förhindra DNA-replikation och därmed hämma reproduktion32. Även om FUDR kan vara oöverkomligt dyrt för vissa laboratorier, krävs endast en liten mängd för att kemiskt sterilisera maskar, och dess stabilitet i pulverform kan göra det möjligt för de flesta grupper. Att använda den temperaturkänsliga glp-4 (bn2) mutanten är verkligen det billigaste alternativet, eftersom det enda kravet är en inkubator för att flytta djuren till de restriktiva 25 ° C; Det bör dock noteras att tillväxt vid 25 °C kan orsaka mild värmestress33,34. Oavsett metod kan användning av sterila djur avsevärt minska kostnaderna för förbrukningsvaror som krävs för åldersrelaterade analyser.

För att studera åldrande är standardlivslängdsanalyser konventionella eftersom paradigmer som förändrar livslängden har direkta effekter på åldrandet. Mätningar av healthspan och stresstolerans ger dock ytterligare information om organismens hälsa. Här erbjuds flera metoder för att mäta healthspan: 1) fecundity som ett mått på reproduktiv hälsa; 2) yngelstorlek som ett mått på utvecklingshälsa och livskraft hos lagda avkommor; och 3) lokomotoriskt beteende som ett mått på muskelfunktion och rörlighet, som båda är direkt korrelerade med åldrande. Dessutom erbjuds analyser av stresstolerans: överlevnad till ER-stress, mitokondriell / oxidativ stress och termisk stressöverlevnad. Faktum är att djur med ökad motståndskraft mot ER-stress35,36, mitokondriell stress37 och termisk stress38 uppvisar ökad livslängd. ER-stress appliceras genom att utsätta C. elegans för mantelmycin, vilket blockerar N-länkad glykosylering och orsakar ackumulering av felveckade proteiner39. Mitokondriell/oxidativ stress induceras genom exponering för parakvat, vilket inducerar superoxidbildning specifikt i mitokondrierna40. Värmespänning appliceras genom inkubation av djur vid 34–37 °C33,41. Alla analyser som beskrivs här kan utföras med minimal utrustning och medel och erbjuder en mängd olika verktyg för att studera åldrande i olika grupper.

Protocol

1. Tillväxt och underhåll av C. elegans

  1. Hällande Nematodtillväxtmedia (NGM) plattor
    1. Odla C. elegans på standard 2% agarplattor med Nematodtillväxtmedia (NGM) bestående av 1 mM CaCl2, 5 μg / ml kolesterol, 25 mM KPO4 (pH 6,0), 1 mM MgSO4, 0,25% w / v Peptone och 51,3 mM NaCl.
    2. För 1 liter NGM-agarplattor mäter du upp 2,5 g pepton, 3,0 g NaCl och 20 g agar i en 1 L-kolv med en omrörningsbar.
      OBS: Det rekommenderas att standardisera en specifik agarkälla, eftersom vi har sett variationer i styvhet mellan märken, vilket kan påverka reproducerbarheten. Här används Bacto-Agar strikt. Dessutom rekommenderas att tillsätta agar direkt i kolven som autoklaveras, eftersom agar inte löser sig helt utan uppvärmning, och överföring av lösning innehållande agar kommer att resultera i förlust av agar och koncentrationsfel.
    3. Tillsätt dH2O upp till 970 ml.
      OBS: 30 ml flytande tillsatser efter sterilisering kommer att ge den slutliga volymen till 1 liter. I våra händer krävs ~ 951 ml dH2O för att nå 970 ml av den slutliga volymen.
    4. Sterilisera NGM-agarlösning med hjälp av en standard autoklav eller mediasterilisator för effektiv sterilisering.
      OBS: Vid denna tidpunkt kan steril NGM-agar förvaras i flera månader vid rumstemperatur. Om den förvaras kan NGM-agar omväckas i en mikrovågsugn med 15-45 s pulser för att förhindra att lösningen kokar över, eller i ett uppvärmt vattenbad.
    5. Låt lösningen röra om tills den har svalnat till 60–75 °C. Omrörning under kylning är viktigt för att förhindra ojämn kylning, vilket kan få viss agar att stelna.
    6. Medan lösningen svalnar, värm ett vattenbad eller pärlbad till 65-70 °C.
    7. När lösningen har svalnat till 60–75 °C, tillsätt flytande tillsatser: 2,0 ml 0,5 M CaCl2, 1 ml 5 mg/ml kolesterol, 25 ml 1 M KPO4 (pH 6,0) och 0,5 M MgSO4 (se tabell 1 för recept för alla reagenser) och låt lösningen blandas i ~5 min för att säkerställa fullständig blandning.
      OBS: Läkemedel kan också inkluderas i plattor här (t.ex. tillsätt 1 ml 100 mg / ml karbenicillin och 1 ml 1 M IPTG; tillsätt 10 ml 2,5 mg / ml mantelmycin; tillsätt 10 ml 400 mM parakvat).
    8. Nedsänkkolv som innehåller NGM-agar i ett vattenbad på 65–70 °C för att förhindra att NGM-agar stelnar under hällning i plattor.
    9. Pipettera 9-11 ml lösning i varje 60 mm platta, eller 20-30 ml lösning i varje 100 mm platta.
      OBS: Det rekommenderas att använda den minsta tillgängliga pipettvolymen för att undvika NGM-läckor orsakade av luft som expanderar i pipetten. Pipettering upp 1-2 ml mer media än vad som kommer att läggas till varje platta för att undvika att pipetten töms helt hjälper till att förhindra bubbelbildning. Alternativt kan plattor hällas för hand direkt från flaskan till en tallrik, men pipettering rekommenderas starkt för att säkerställa plattor med samma volym. Plattor med lika volym är viktiga för att säkerställa liknande koncentrationer av lösningar vid användning av metoder där lösningar appliceras direkt ovanpå en platta (se steg 1.1.17). Lika stora volymer möjliggör också enkel mikroskopi för att upprätthålla ett liknande fokalplan över plattorna.
    10. Placera pipetten tillbaka i den uppvärmda lösningen för att bibehålla temperaturen och förhindra att NGM-agar stelnar.
    11. Upprepa ovanstående två steg för alla plattor.
    12. Låt NGM-agarplattor stelna över natten.
    13. Efter att plattorna har stelnat förvaras plattorna i upp till 3 månader vid 4 °C eller gå vidare till steg 1.1.14 för såddplattor med bakterier. Förvara plattorna i förseglade behållare för att behålla fukten för att bibehålla plåtkvaliteten.
    14. Odla en odling av OP50 i lysogenibuljong (LB) eller motsvarande valfria medier i 24-48 timmar vid omgivningstemperatur (~22-25 °C) eller odla en odling av HT115 i LB + antibiotika (ampicillin/kolhydrat + tetracyklin rekommenderas för HT115) med skakning vid 37 °C i 12-16 timmar.
      OBS: Det rekommenderas att odla OP50 vid rumstemperatur eftersom en mer aggressiv tillväxt av OP50 har hittats vid 37 °C, vilket påverkar C. elegans livslängd. Däremot har HT115 en långsammare tillväxttakt och gör mindre täta kulturer; Därför rekommenderas att HT115 odlas vid 37 °C med skakning.
    15. Frö en volym på 100-200 μL av en mättad OP50 / HT115-kultur på en 60 mm platta eller 1 ml för en 100 mm platta.
    16. Låt tallrikarna torka över natten på en bänkskiva och låt ytterligare en dag torka om plattorna fortfarande är våta. Förvara plattorna i förseglade behållare vid 4 °C i ~2 månader.
    17. Valfritt: Tillsätt läkemedel direkt på seedade NGM-agarplattor (t.ex. 100 μL 10 mg/ml FUDR-lösning) för att kemiskt sterilisera maskar.
  2. Underhålla C. elegans lager
    1. Märk botten på en sådd NGM-agarplatta ordentligt. Märk kanterna på botten av plattan för att förhindra att ljuset passerar på vanliga dissektionsmikroskop.
    2. Använd ett vanligt dissektionsmikroskop och skopa valfria bakterier på C. elegans pick.
      OBS: I detta protokoll användes en plockning bestående av en 90% / 10% platina / iridiumtråd fäst vid änden av en Pasteur-pipett i glas.
    3. Använd bakterierna, samla 10-20 ägg, L1, L2 eller L3 djur, och överför dem till en ny märkt seedad NGM-agar platta.
      OBS: Det är bäst att samla yngre djur; Enligt författarnas erfarenhet, för vanliga vilda djur, kommer förflyttning av 10-20 ägg / unga djur att göra det möjligt för plattan att växa vid 15 ° C utan svält. För transgena eller mutanta djur med minskad fecunditet bör fler djur flyttas in i plattan.
    4. För djur med vildfecunditet och som odlas vid 15 ° C, upprepa steg 1.2.1-1.2.3 var 7: e dag för att upprätthålla en veckovis lager. För djur som odlas vid 20 °C, upprepa steg 1.2.1–1.2.3 var 4–5:e dag för att förhindra svält.
  3. Synkronisera maskar via Blekning
    ANMÄRKNING: En hel 60 mm NGM-agarplatta (t.ex. 1 vecka gamla lagerplattor odlade vid 15 °C) kommer att ge ett tillräckligt antal djur för de flesta standardanalyser som beskrivs. I allmänhet kommer en gravid vuxen (vuxen full av ägg) att ge 10-15 ägg42, och en hel, 60 mm NGM-agarplatta har allt från 100-200 gravida vuxna, vilket ger ~ 1000-2000 ägg.
    1. För storskaliga experiment som kräver fler djur, skär en hel 60 mm NGM-agar i fyra till sex lika stora bitar och dela dem på sådda 100 mm plattor för expansion.
      OBS: Här avser chunking att skära en bit av NGM-agarplattan som innehåller maskar och flytta hela biten av agar + maskar till en ny platta, masksidan nedåt så att maskarna kan krypa på den nya plattan. Som referensram kommer djur med vild typ av fecunditet att producera en full 100 mm platta om de odlas vid 20 ° C i 2-3 dagar efter segmentering.
    2. För att börja samla nematoderna, häll en liten mängd M9-lösning (tabell 1) på plattor som innehåller maskar, var försiktig så att du inte överfyller petriskålen. Snurra M9-lösningen försiktigt för att lossa maskar från bakteriegräsmattor.
    3. Samla gravida vuxna maskar med en serologisk pipett, var försiktig så att du inte genomborrar agar med pipettspetsen.
      OBS: Serologiska pipetter av glas rekommenderas, eftersom C. elegans tenderar att hålla fast vid plast. Om glaspipetter inte är tillgängliga rekommenderas det att börja med ett större antal djur än vad som behövs, eftersom vissa kommer att gå vilse på grund av att de håller fast vid plastpipetter.
    4. Pelletera djuren genom centrifugering i 30 s vid 1 100 x g. Aspirera supernatanten.
      OBS: C. elegans-pelleten är väldigt lös, så var försiktig så att du inte skakar eller stör pelleten medan du aspirerar supernatanten.
    5. Medan djuren centrifugerar, bered 5 ml blekningslösning per stam (se tabell 1 för receptdetaljer). för 5 ml lösning, blanda 1,5 ml 6% natriumhypoklorit (blekmedel), 0,75 ml 5 M NaOH eller KOH och 2,75 mldH2O.
      VARNING: Natriumhypoklorit och hydroxidlösningar med hög koncentration är frätande, och därför rekommenderas att du bär handskar och en labbrock vid hantering.
    6. Tillsätt 5 ml blekningslösning till maskpellets/M9-blandningen.
    7. Kontrollera maskarna under ett dissekerande mikroskop med några minuters mellanrum tills alla vuxna maskkroppar har lösts upp och endast ägg finns kvar i blandningen. Skaka mask/ blekmedelsblandningen kraftigt för att påskynda blekningsprocessen.
      OBS: Att lämna ägg i en blekmedelsblandning under längre perioder kommer att leda till att äggen skadas och kommer att påverka djurens livskraft. För vilda djur tar blekning vanligtvis 4-6 minuter med skakning. Således rekommenderas att kontrollera djuren under ett mikroskop med 30 s intervaller från och med 4 min-märket.
    8. Pelletera äggen genom att spinna ner ägg/blekmedelsblandningen i 30 s vid 1 100 x g.
      OBS: Cirka 15 ml koniska rör har lutningslinjer på insidan av röret. För dessa rör rekommenderas att ägg snurras med högre hastighet (t.ex. 30 s vid 2 000 x g) för att säkerställa att ägg pelleterar till botten av röret och inte förblir på gradientlinjer.
    9. Aspirera ut blekningslösningen.
      OBS: En äggpellets är styvare än en maskpellets, men kan fortfarande störas lätt. Så var försiktig så att du inte skakar röret efter centrifugering.
    10. Tvätta äggen genom att tillsätta M9-lösning upp till 15 ml och invertera röret fyra eller fem gånger för att säkerställa att äggen är helt dispergerade i M9-lösningen.
    11. Pelletlägg genom centrifugering i 30 s vid 1 100 x g och aspirera ut M9-lösning.
    12. Upprepa ovanstående två steg för totalt fyra tvättar för att eliminera blekmedel från äggblandningen.
    13. Resuspendera äggen i 100 μL till 2 ml M9-lösning (dvs. beroende på det totala antalet maskar som blekts) efter den slutliga tvätten. Skaka ägg noggrant för att bryta upp klumpar och se till att pelleten är helt återsuspenderad.
    14. Alternativt kan djur L1 arresteras för en tätare tidssynkronisering; för L1-gripande, tillsätt M9-lösning till äggpelleten till ~ 10 ml i ett 15 ml koniskt rör. Låt maskarna snurra i en rotator i upp till 24 timmar vid 20 °C eller omgivningstemperatur. L1-djur tar i allmänhet en halv dag mindre för att nå vuxen ålder jämfört med tidpunkten för ägg som beskrivs i steg 1.3.16.
    15. Approximera äggkoncentrationen (eller L1-koncentrationen; se steg 1.3.14) genom att pipettera 4 μL ägg/M9-blandning på en NGM-platta som är fröad med bakterier. Räkna och beräkna hur många ägg som finns per pläterad μl. Upprepa räkningen tre eller fyra gånger för att förbättra approximationen.
      OBS: Att approximera äggkoncentrationen kommer att säkerställa att tillräckligt många djur pläteras för lämplig provstorlek för experiment utan överplätering, vilket kommer att orsaka svält.
    16. Baserat på approximationen, platta lämpligt antal ägg på NGM-agarplattor sådda med valfria bakterier. För OP50-plattor, platta högst 200 djur på en 60 mm platta och 1 000 djur på en 100 mm platta. För HT115-plattor, platta högst 150 djur på en 60 mm platta och 600 djur på en 100 mm platta.
      OBS: Dessa är ungefärliga siffror baserat på våra laboratorieförhållanden, och siffrorna kan ändras baserat på tjockleken på bakteriegräsmattan. Ägg som odlas vid 15 ° C tar ~ 5 dagar att nå dag 1 vuxen ålder (~ 140 h för att nå äggläggning maximal, gravid vuxenstadium). Ägg som odlas vid 20 ° C tar ~ 4 dagar att nå dag 1 vuxen ålder (~ 96 h för att nå äggläggning maximal, gravid vuxenstadium). Ägg som odlas vid 25 ° C tar ~ 3,5 dagar att nå dag 1 vuxen ålder (~ 62 h för att nå äggläggning maximal, gravid vuxenstadium).
  4. Äggläggning som en alternativ metod för att synkronisera C. elegans-populationer
    1. Om blekningsprotokoll inte är genomförbara (t.ex. ingen centrifug tillgänglig), som en alternativ metod för att synkronisera populationer av C. elegans, utför en äggläggningsprocedur. Tänk på att detta protokoll är mer arbetsintensivt och kommer att resultera i mindre utbyten av djur.
    2. För äggläggning, placera 8-12 gravida vuxna på en vanlig NGM-agarplatta sådd med valfria bakterier och dokumentera det exakta antalet djur som placeras på en tallrik.
      OBS: Äggläggningsprocedurer bör utföras vid den temperatur som kommer att användas för experiment.
    3. Låt djur lägga ägg i 4-8 h.
      OBS: Varaktigheten djur lämnas på tallriken kan justeras vid behov. Till exempel kan ett större antal djur läggas på en tallrik under en kortare äggläggningstid när mindre tid är tillgänglig. C. elegans lägger i allmänhet ägg i skurar, vilket kan uppskattas till en hastighet av cirka fem ägg/h för djur med vild typ fecundity43. Följ rekommendationerna i steg 1.3.16 för att undvika att överplätera djur.
    4. Ta bort alla vuxna djur från plattan.
      OBS: Alla vuxna djur som finns kvar på tallriken fortsätter att lägga ägg, vilket resulterar i en osynkroniserad population.
    5. Placera ägg vid 15 °C i ~5 dagar eller 20 °C i ~4 dagar för att nå dag 1 vuxen ålder.

2. Mätning av livslängd i C. elegans

  1. Standard livslängd
    1. Förbered NGM-agarplattor genom att så plattor med 100 μL bakterier som valts. För konsistens, se till att samma bakterier används i alla replikat. Eftersom maskar flyttas varje dag under äggläggningsstadierna av vuxen ålder, frö fem till sju uppsättningar NGM-agarplattor under livslängden och två till fyra plattor per stam för att odla djur till vuxen ålder (dvs. om man använder åtta plattor med 15 djur för livslängder måste man fröa 40-56 plattor per tillstånd).
    2. Låt plattorna torka över natten före förvaring.
      OBS: Det rekommenderas att plattorna förvaras vid 4 °C och att det erforderliga antalet plattor tas bort från kylförvaring dagligen för att förhindra att bakterier gör tjocka gräsmattor som kan göra det svårt att flytta / räkna livslängden. Se till att plattorna värms upp före plätering av maskar.
    3. Samla in en synkroniserad population av C. elegans med hjälp av en standardblekningsanalys enligt beskrivningen i steg 1.3 och 1.4.
    4. Flytta 10-15 dag 1 vuxna djur på 8-12 tallrikar vardera. För en standardlivslängd, börja med ~ 120 djur för att säkerställa att provstorleken inte sjunker för långt under 100 efter censurhändelser (t.ex. åtta plattor med 15 djur = 120 djur; 12 plattor med 10 djur = 120 djur).
      OBS: I det aktuella fallet är 10-15 djur ett hanterbart antal för de flesta utredare, även om sex plattor med 20 djur också är genomförbart för att minska kostnaden för förbrukningsvaror.
    5. Under de första 7-8 dagarna eller tills avkomman inte längre är synlig, flytta vuxna djur bort från deras avkomma var 1-2: e dag.
      OBS: Djur kan flyttas varannan dag för att spara material, men man måste se till att ägg/ larvdjur inte överförs med den vuxna för att förhindra kontaminering av vuxna populationer med avkomma. I denna studie är den enklaste metoden att flytta djur varje dag från dag 1-3 när äggläggningen är som maximal och sedan byta till att flytta djur varannan dag i dag 5-8 när äggläggningen är minimal. Med denna metod är det inte absolut nödvändigt att förhindra överföring av ägg / larvdjur under dag 1-3 eftersom de vuxna kommer att flyttas varje dag och ägg / larver inte kan utvecklas till vuxen ålder på 1 dag.
    6. Efter att djur har slutat producera avkomma, gör livslängden varannan dag tills alla djur har bedömts som döda eller censurerade. Ta bort alla döda eller censurerade djur från plattan för att undvika förvirring och berätta om samma djur.
      NOTERA: Döden räknas som djur som inte uppvisar någon rörelse när de försiktigt berörs med en plockning. Censur poängsätts som djur som är påsade, uppvisar vulval/tarmutsprång eller kryper upp till sidorna av plattan där de torkar ut.
  2. Livslängder med kemisk sterilisering med FUDR
    1. Förbered NGM-agarplattor genom att så plattor med 100 μL bakterier som valts. För konsistens, se till att samma bakterier används i alla replikat. Frö 8-12 plattor per stam för livslängdsförsök och två till fyra plattor per stam för att odla djur till vuxen ålder. Låt tallrikarna torka över natten.
    2. Tillsätt 100 μL 10 mg/ml FUDR på mitten av bakteriegräsmattan för de 8-12 plattor som kommer att användas för livslängdsanalys. Kom ihåg att lämna två till fyra tallrikar utan FUDR som startplattor så att djuren kan växa till vuxen ålder. Låt tallrikarna torka över natten.
      VARNING: FUDR blockerar DNA-syntesen, och därför rekommenderas att du bär handskar vid hantering.
    3. Samla in en synkroniserad population av C. elegans med hjälp av en standardblekningsanalys enligt beskrivningen i steg 1.3 och 1.4.
      OBS: Dessa djur måste odlas på tallrikar utan FUDR, eftersom FUDR kommer att få djur att arrestera / dö.
    4. Flytta 10-15 dag 1 vuxna djur på 8-12 plattor vardera, innehållande FUDR. För en standardlivslängd, börja med ~ 120 djur för att säkerställa att provstorleken inte sjunker för långt under 100 efter censurhändelser (t.ex. åtta plattor med 15 djur = 120 djur; 12 plattor med 10 djur = 120 djur).
      OBS: Djur kan också flyttas till FUDR på L4-stadiet om det är absolut nödvändigt att avkommabildning helt undviks, men djur får inte flyttas för tidigt eftersom detta kommer att leda till att djur löper högre risk för vulval / tarmutsprång och kommer att öka censuren.
    5. Poänglivslängder varannan dag tills alla djur har bedömts som döda eller censurerade. Ta bort alla döda eller censurerade djur från plattan för att undvika förvirring och berätta om samma djur.
      OBS: För FUDR-livslängder kan alla avkommor ignoreras eftersom de kommer att arresteras i L1-stadiet och så småningom dö.
  3. Livslängder med temperaturkänsliga sterila mutanter
    1. Förbered NGM-agarplattor genom att så plattor med 100 μL bakterier som valts. För konsistens, se till att samma bakterier används i alla replikat. Frö 8-12 plattor per stam för livslängdsförsök och 2-4 plattor per stam för att odla djur till vuxen ålder. Låt tallrikarna torka över natten.
    2. Samla in en synkroniserad population av C. elegans med hjälp av en standardblekningsanalys enligt beskrivningen i steg 1.3 och 1.4. Kom ihåg att odla djur vid den restriktiva temperaturen på 25 °C för att säkerställa att djuren är sterila.
    3. Flytta 10-15 dag 1 vuxna djur på 8-12 tallrikar vardera. För en standardlivslängd, börja med ~ 120 djur för att säkerställa att provstorleken inte sjunker för långt under 100 efter censurhändelser (t.ex. åtta plattor med 15 djur = 120 djur; 12 plattor med 10 djur = 120 djur).
    4. Poänglivslängder varannan dag tills alla djur har bedömts som döda eller censurerade. Ta bort alla döda eller censurerade djur från plattan för att undvika förvirring och berätta om samma djur.
      OBS: När man hanterar kortlivade stammar rekommenderas det att göra livslängder varje dag eftersom livslängden vid 25 ° C är mycket kortare och därmed är det dynamiska området begränsat. Enligt författarnas erfarenhet kan djur flyttas tillbaka till 20 °C efter dag 2, och djur kommer att förbli sterila om det är att föredra att uppnå en livslängd på 20 °C.

3. Mätning av healthspan i C. elegans

  1. Mätningar av rörelsebeteende via thrashing
    1. Samla in en synkroniserad population av C. elegans med hjälp av en standardblekningsanalys enligt beskrivningen i steg 1.3 och 1.4.
    2. Flytta en liten koloni av dag 1 vuxna maskar på en NGM-agarplatta under ett dissekerande kikarsikte på 10-20 μl M9-lösning. 10-15 djur rekommenderas som ett hanterbart antal djur att räkna.
    3. Fokusera på en mask i taget, räkna antalet gånger provet växlar från en konkav till konvex bildning i 15 s. Använd en handräknare och en timer så att fokus kan läggas på masken under hela analysen.
      OBS: En video av plattan kan spelas in för mer grundlig / enklare analys. Till exempel finns vanliga okularfästen i mikroskop tillgängliga för de flesta smartphones och digitalkameror ($ 15- $ 30), och dessa är ett utmärkt alternativ för att videotrashing till en låg kostnad.
    4. Upprepa steg 3.1.3 för de andra maskarna i vätskan, i genomsnitt en total rörlighetshastighet för 10-15 maskar. För högre provstorlek, upprepa steg 3.1.2-3.1.4.
    5. Åk ut maskar till önskad ålder. Liknande metoder för livslängdsanalyser som beskrivs i steg 2.1-2.3 kan användas för att åldras maskar. Upprepa steg 3.1.2-3.1.4 för att analysera thrashing vid önskade åldrar.
      OBS: En alternativ metod för steg 3.1.2 är att tillsätta ~ 30 μL eller mer av M9-lösningen på en grupp maskar på en tallrik. Detta sparar tid från att behöva överföra maskar manuellt, men på grund av slumpmässig chans att maskarna finns på en enda platta finns det ingen garanti för att en grupp maskar kommer att förbli vid en enda punkt på plattan.
  2. Mätningar av fecunditet (äggantal) i C. elegans
    1. Samla in en synkroniserad population av C. elegans med hjälp av en standardblekningsanalys enligt beskrivningen i steg 1.3 och 1.4. Analyser för äggräkning börjar vid L4-stadiet, vilket är ~ 1 dag före dag 1 vuxen ålder (~ 3 dagar vid 15 ° C eller ~ 2 dagar vid 20 ° C efter L1-arrestering).
    2. Peka ut L4-maskar på separata NGM-agarplattor sådda med valfria bakterier. Det rekommenderas att ~ 10-15 djur används för en fecundity-analys.
      OBS: Det rekommenderas att späda de valda bakterierna med 50% (dvs. inte en mättad kultur) för att förbättra äggets synlighet i bakteriegräsmattan.
    3. Låt djuren växa över natten vid 20 °C. Se till att en nysådd sats tallrikar är redo för nästa dag.
    4. På dag 1 i vuxen ålder, överför vuxna maskar till färska NGM-agarplattor sådda med de utspädda bakterierna som valts.
      OBS: Det rekommenderas att använda nysådda plattor eller att förvara plattor vid 4 °C tills de används för att förhindra tjocka bakteriegräsmattor.
    5. Räkna det totala antalet ägg som läggs på varje NGM-agarplatta.
      OBS: För att underlätta skanningen av plattan kan ett rutnät dras på locket på en tallrik och placeras under plattan som poängsätts för ägg. Plattan kan sedan skannas längs rutnätslinjerna för att bibehålla orienteringen när plattan flyttas och förhindra omräkning av eventuella ägg.
    6. Upprepa steg 3.2.4-3.2.5 i 7–8 dagar eller tills äggen inte längre syns på tallriken.
      OBS: För dag 1-3 när äggläggningshastigheterna är höga rekommenderas att flytta djur minst var 12: e timme och analysägg räknas två gånger om dagen. Detta ökar dock mängden arbete och kostnader för förbrukningsvaror, och därmed kan rörliga djur och mätningar begränsas till en gång per dag, men man måste se till att alla ägg och kläckta djur räknas ordentligt. Alla kläckta djur räknas som ägg vid denna analys.
  3. Mätning av yngelstorlek (utveckling) av C. elegans avkomma
    1. Samla in en synkroniserad population av C. elegans med hjälp av en standardblekningsanalys enligt beskrivningen i steg 1.3 och 1.4. Analyser för yngelstorlek börjar vid L4-stadiet, vilket är ~ 1 dag före dag 1 vuxen ålder (~ 3 dagar vid 15 ° C eller ~ 2 dagar vid 20 ° C efter L1 gripande).
    2. Peka ut L4-maskar på separata NGM-agarplattor sådda med valfria bakterier. Det rekommenderas att ~ 10-15 djur används för en fecundity-analys.
    3. Låt djuren växa över natten vid 20 °C. Se till att en nysådd sats tallrikar är redo för nästa dag.
    4. På dag 1 i vuxen ålder, överför vuxna maskar till färska NGM-agarplattor sådda med bakterier av val.
    5. Varje 12-24 h (2x om dagen eller 1x om dagen), överför vuxna maskar till färska NGM-agarplattor sådda med bakterier av val i 7-8 dagar eller tills avkomman inte längre är synlig. Förvara alla tallrikar som innehåller ägg vid 20 °C.
    6. Upprepa steg 3.3.5 i 7-8 dagar eller tills avkomman inte längre är synlig. Förvara alla tallrikar som innehåller ägg vid 20 °C.
      OBS: Avkommaplattor kan också förvaras vid 15 °C för att förlänga tiden innan de behöver poängsättas.
    7. Två dagar efter överföring av maskar, räkna den utvecklade avkomman på plattorna. Räkna utvecklande maskar i L4-stadiet (dvs. 2 dagar efter kläckning vid 20 ° C) eller tidigare för att säkerställa att F2-generationen (dvs. avkomma av avkomma) inte förvirrar resultaten. Räkna alla maskar som lever.
      1. Ta bort alla maskar från plattan när de räknas. Underhåll plattorna i ytterligare 1-2 dagar innan du poängsätter dem igen för att säkerställa att eventuella djur med försenad kläckning/utveckling inte missas.
    8. Upprepa steg 3.3.7 för varje uppsamlad äggläggningsplatta.
      OBS: Analyserna av yngelstorlek kan utföras i samband med äggräkningsanalys (steg 3.2) för att minimera arbetskraft och kostnader för förbrukningsvaror genom att samla in två uppsättningar data från ett experiment. Detta möjliggör också direkt jämförelse av yngelstorlek och äggantal inom samma djur.

4. Mätning av stresstålighet i C. elegans

  1. Mätningar av ER-stresskänslighet med hjälp av tunicamycin
    1. Förbered NGM-agarplattor genom såddplattor som innehåller mantelmycin (se steg 1.1.7, OBS) med 100 μl valfria bakterier.
      VARNING: Handskar bör bäras vid hantering av manteldjursmycin.
    2. För konsistens, se till att samma bakterier används i alla replikat. Frö 8-12 tunicamycinplattor per stam för överlevnadsanalyser och två till fyra plattor utan mantelmycin per stam för att odla djur till vuxen ålder. Låt tallrikarna torka över natten.
    3. Samla in en synkroniserad population av C. elegans med hjälp av en standardblekningsanalys enligt beskrivningen i steg 1.3 och 1.4.
      OBS: Djur måste odlas på tallrikar utan mantelmycin fram till dag 1 i vuxen ålder, eftersom djur kommer att arrestera / dö på mantelmycin.
    4. Flytta 10-15 dag 1 vuxna djur på 8-12 tallrikar vardera. För en standardöverlevnadsanalys, börja med ~ 120 djur för att säkerställa att provstorleken inte sjunker för långt under 100 efter censurhändelser (t.ex. åtta plattor med 15 djur = 120 djur; 12 plattor med 10 djur = 120 djur).
      OBS: I likhet med FUDR-analyser kan överlevnadsanalyser av mantelmycin utföras utan att flytta djur, eftersom mantelmycin orsakar död /arrestering av L1-djur. Men när man utför en DMSO-kontroll kommer avkomma att utvecklas på DMSO-plattor, så djur måste flyttas dagligen eller en steriliseringsteknik kommer att krävas (identiska metoder som används i avsnitt 2 för livslängder kan användas för överlevnadsanalyser).
    5. Överlevnadsanalyser görs på samma sätt som livslängder. Ta bort alla döda eller censurerade djur från plattan för att undvika förvirring och berätta om samma djur.
      OBS: Även om det är möjligt att göra mål på djur varannan dag, eftersom döden inträffar snabbt på mantelmycin, rekommenderas det att göra överlevnadsanalyser dagligen.
  2. Mätningar av mitokondriell/oxidativ stresskänslighet med parakvat
    1. Förbered NGM-agarplattor genom såddplattor som innehåller parakvat (se steg 1.1.7; OBS) med 100 μl valfria bakterier.
      VARNING: Handskar bör bäras vid hantering av parakvat eftersom det är en miljöfara. Kontrollera institutionens miljöhälsa och säkerhet för krav på kassering, eftersom många forskningsinstitutioner kommer att kräva specifika kasserande instruktioner för miljöfaror.
    2. För konsistens, se till att samma bakterier används i alla replikat. Frö 8-12 plattor per stam för överlevnadsanalyser och två till fyra plattor utan parakvat per stam för att odla djur till vuxen ålder. Låt tallrikarna torka över natten.
    3. Samla in en synkroniserad population av C. elegans med hjälp av en standardblekningsanalys enligt beskrivningen i steg 1.3 och 1.4.
      NOTERA: Kom ihåg att odla djur på tallrikar utan parakvat fram till dag 1 i vuxen ålder; Det är dock nödvändigt att utföra en steriliseringsteknik eller flytta vuxna bort från avkomma, eftersom vissa djur kan utvecklas till vuxen ålder på parakvatplattor (se steg 2.2-2.3).
    4. Flytta 10-15 dag 1 vuxna djur på 8-12 tallrikar vardera. För en standardöverlevnadsanalys, börja med ~ 120 djur för att säkerställa att provstorleken inte sjunker för långt under 100 efter censurhändelser (t.ex. åtta plattor med 15 djur = 120 djur; 12 plattor med 10 djur = 120 djur).
    5. Överlevnadsanalyser görs på samma sätt som livslängder. Ta bort alla döda eller censurerade djur från plattan för att undvika förvirring och berätta om samma djur.
      OBS: Även om det är möjligt att göra mål på djur varannan dag, eftersom döden inträffar snabbt på parakvat, rekommenderas det att göra överlevnadsanalyser dagligen. Detta gäller särskilt när man använder glp-4(bn2)- djur som vuxit vid 25 °C eftersom döden kommer att inträffa mycket snabbt.
  3. Mätningar av värmespänningskänslighet (termotolerans) med förhöjda temperaturer
    1. Samla in en synkroniserad population av C. elegans med hjälp av en standardblekningsanalys enligt beskrivningen i steg 1.3 och 1.4.
    2. Förvärm NGM-agarplattor till 37 °C innan djuren flyttas på tallrikar genom att plattorna placeras i en 37 °C kuvös i minst 1 timme.
    3. Flytta 10-15 dag 1 vuxna djur på fyra till sex förvärmda tallrikar vardera. För en standard termotolerans, börja med ~ 60 djur (t.ex. fyra plattor med 15 djur = 60 djur; sex plattor med 10 djur = 60 djur)
    4. Placera djuren i en 37 °C kuvös och gör dödspoäng var 2:e timme. Döden definieras som djur som inte uppvisar någon rörelse när de försiktigt berörs med en plockning. Ta bort alla döda eller censurerade djur från plattan för att undvika förvirring och berätta om samma djur.
    5. Se till att plattorna avlägsnas från inkubatorn vid 37 °C under så kort tid som möjligt, eftersom plattor som lämnas vid omgivningstemperatur under lång tid medan poängsättningen kommer att förändra termotoleransresultaten.
      OBS: Det rekommenderas att bara dra ut en stam i taget för att göra poäng, eftersom temperaturen på agar inte bör förändras dramatiskt under den tid det tar att göra en stam.
    6. Median termotolerans uppnås i allmänhet i 7-9 h; så se till att det görs en ordentlig analys vid 7 h, 9 h och 11 h.
      OBS: Även om 1-5 h kan hoppas över, på grund av inkubatorers variation, plattans tjocklek och andra förvirrande faktorer i varje labb, är det viktigt att tidpunkten titreras noggrant i varje labb om tidpunkter planeras att hoppas över. Se referens 44 för en fullständig vägledning om termotolerans.
    7. Alternativt kan du utföra termotoleransanalysen vid 34 °C i stället för 37 °C.
      OBS: Median termotolerans vid 34 ° C inträffar mycket senare (10-14 timmar i denna studie), vilket gör att termotoleransanalyser kan förberedas sent på kvällen (placeras i en 34 ° C inkubator) och för att poängsättningen ska börja tidigt nästa dag. Detta möjliggör ~ 8 timmars fortsatt poängsättning snarare än den typiska 12-timmarsperioden som krävs för en 37 ° C termotoleransanalys.

Representative Results

C. elegans är en utmärkt modellorganism för åldrande forskning på grund av en stor majoritet av åldrande mekanismer bevaras med människor. Det är viktigt att de har en mycket låg kostnad för underhåll och experiment med minimikrav på utrustning och förbrukningsvaror, vilket gör dem till ett eftertraktat modellsystem för institutioner med begränsade medel. Dessutom gör en uppsjö av enkla analyser med grunda inlärningskurvor dem till ett utmärkt system för även den yngsta utredaren med liten eller ingen erfarenhet. Alla dessa faktorer i kombination med den kraftfulla genetiken hos C. elegans inklusive enkel genomredigering, tusentals tillgängliga mutanter och transgena djur till nominella kostnader och tillgängliga RNAi-bibliotek för genetisk knockdown av praktiskt taget varje gen gör dem till ett idealiskt system för grundutbildningsinstitutioner. Här undersöks några av de billigaste metoderna för att studera åldrande i C. elegans , med fokus främst på analyser med minimal utrustnings- och förbrukningskostnad, samt grunda inlärningskurvor. Faktum är att hela protokollen och datainsamlingen skrevs / utfördes av juniora utredare med <5 månaders forskningserfarenhet, mestadels studenter.

Livslängdsstudier i C. elegans är mycket enkla på grund av djurens korta livslängd, allt från 14-20 dagar. Viktigt är att livslängdsanalyser är mycket standardiserade och endast kräver en inkubator, ett standarddissektionsmikroskop, en standardmaskplockning och förbrukningsmaterial för beredning av NGM-agarplattor. Den kanske mest kostnadsdrivande aspekten av livslängdsmätningar i C. elegans är förbrukningsvaror som krävs. Detta beror på att C. elegans är hermafroditer som självbefruktar; därför måste vuxna som spåras för livslängdsanalyser flyttas bort från avkomma dagligen. Djur kan dock steriliseras genom att utsätta dem för FUDR eller använda mutanter, såsom den temperaturkänsliga glp-4(bn2)-mutanten utan könsceller som odlas vid den oöverkomliga 25 °C för att minska mängden förbrukningsvaror som krävs 30,31,32. Här utfördes livslängdsanalyser med FUDR eller med glp-4 (bn2) bakterielösa mutanter, som visar liknande resultat som standardlivslängder utförda på icke-sterila djur. Även om livslängden av vild typ inte är identisk på grund av effekterna av FUDR45 eller tillväxt vid 25 °C på livslängd2, visar det kortlivade hsf-1 knockdown-djuret på ett tillförlitligt sätt en signifikant minskning av livslängden för alla förhållanden (figur 1). hsf-1 kodar för transkriptionsfaktorn värmechockfaktor-1, som är involverad i regleringen av den termiska spänningsresponsen, och dess knockdown resulterar i en signifikant minskning av livslängden38,46.

Även om livslängd är en viktig faktor att tänka på i åldrande biologi, ofta, livslängd korrelerar inte med ökad hälsa, även i C. elegans47. Således, som ett kompletterande tillvägagångssätt, erbjuder vi flera metoder för att mäta organismens hälsa, inklusive reproduktiv hälsa, lokomotoriskt beteende och stressresiliens. Reproduktiv hälsa kan mätas på ett av två sätt. För det första kommer mätningar av äggantal att ge en direkt mätning av hur många ägg som läggs av en enda självgödslande hermafrodit. Men eftersom djur producerar fler oocyter än spermier läggs också några obefruktade ägg som aldrig skulle producera livskraftig avkomma48. För att få en bättre förståelse för djurets verkliga reproduktionskapacitet ger mätningar av yngelstorleken därför ett mått på hur många livskraftiga avkommor som produceras. Ofta kan ökad stressresiliens faktiskt minska reproduktionsförmågan, potentiellt på grund av den inneboende effekten av upplevd stress på reproduktion49. På samma sätt finns en signifikant minskning av både antalet ägg som läggs och yngelstorleken hos hsf-1-överuttrycksdjur jämfört med vildtypskontroller (figur 2A,B). Faktum är att vissa hsf-1-överuttrycksdjur uppvisar full sterilitet, vilket ger bevis för att reproduktiv hälsa kan vara omvänt korrelerad med livslängd.

Även om reproduktiv hälsa är viktigt för att förstå könshälsa, funktionell meios och reproduktionskapacitet, finns det i allmänhet ingen direkt korrelation mellan livslängd och yngelstorlek50. Således, som ett kompletterande tillvägagångssätt, erbjuds lokomotoriskt beteende som en guldstandardmetod för analys av C. elegans healthspan under åldrande51. Det finns många metoder för att mäta rörelsebeteende, men de flesta metoder kräver sofistikerade kameror, spårningsprogramvara eller dyra kemikalier. Däremot kräver thrashing-analyser praktiskt taget ingen utrustning utöver vad ett standard C. elegans-laboratorium är utrustat med: dissekeringsmikroskop, maskplockning, pipett och förbrukningsmaterial för att tillverka NGM-agarplattor. Thrashing-frekvenser ger en tillförlitlig metod för att mäta healthspan under åldrandet, mätt som en signifikant minskning av thrashing hos gamla djur jämfört med unga djur (Figur 2C).

Slutligen är överlevnad till stressanalyser ett ytterligare fysiologiskt mått på motståndskraft. Förmågan att aktivera stressreaktioner minskar i allmänhet under åldringsprocessen, vilket gör djur mindre motståndskraftiga och mer känsliga för stress. Således kan stressresiliens användas som en pålitlig proxy för organismens hälsa. Här erbjuds metoder för att kartlägga känsligheten för 1) ER-stress som svar på tunicamycinexponering, ett kemiskt medel som blockerar N-länkad glykosylering och resulterar i ackumulering av felveckade proteiner i ER; 2) mitokondriell/oxidativ stress genom exponering för parakvat, ett kemiskt medel som inducerar superoxidbildning i mitokondrier; och 3) termisk stress genom exponering för förhöjda temperaturer. För tunicamycin och parakvatanalyser införlivas läkemedlet i NGM-agarplattan under plattproduktionen. För höga koncentrationer av mantelskap utvecklas avkomma i allmänhet inte, och därmed behöver steriliseringstekniker inte användas. Protokollet som presenteras här rekommenderar 25 ng / μL som en slutlig koncentration av mantelmycin, men för dem med begränsade medel visar 10 ng / μL också en signifikant minskning av överlevnaden (figur 3A). Båda koncentrationerna begränsar avkommans utveckling, och därmed behövs inga steriliseringsmetoder, även om DMSO-kontrollen kommer att kräva en steriliseringsteknik eller förflyttning av djur till nya plattor. Detta beror på att tunicamycintoxicitet förhindrar utveckling av avkomma, men DMSO är praktiskt taget giftfri, vilket gör att avkomman kan utvecklas fullt ut när den odlas på tunicamycin.

För parakvatanalyser krävs antingen en steriliseringsteknik eller förflyttning av djur eftersom parakvatbehandling inte hindrar avkomma från att utvecklas till vuxen ålder. Höga nivåer av parakvat (4 mM) förkortar livslängden avsevärt, medan låga nivåer av parakvat (0,25 mM) ökar livslängden på grund av en hormetisk effekt (figur 3B), i överensstämmelse med tidigare publicerade resultat52. Slutligen kräver termotoleransanalyser endast en inkubator som kan nå 30-37 °C, och inga ytterligare reagenser krävs. Överuttryck av hsf-1 ökar termotoleransen vid 37 °C (figur 3C) som tidigarepublicerats 53. Men som andra har visat tidigare och från nuvarande data är det största problemet med termotoleransanalyser deras variabilitet. Många faktorer kan bidra till variabilitet inom termotoleransanalyser, inklusive skillnader mellan inkubatorer och den tid djur tillbringar utanför inkubatorn medan de gör termotolerans varje timme. För en grundlig riktlinje för termotolerans, se referens 41.

Figure 1
Figur 1: Jämförelse av livslängdsmätningar med och utan sterilisering. Djur flyttades bort från avkomman på dagarna 1, 3, 5 och 7 i vuxen ålder. (B) Livslängd för vilda N2-nematoder som odlas på NGM-agar-FUDR-plattor som är seedade med tomma vektor- (ev) eller hsf-1 RNAi-bakterier vid 20 °C. Djur odlades till vuxen ålder på vanliga ev- eller hsf-1 RNAi-plattor och flyttades sedan till FUDR-plattor på dag 1 i vuxen ålder. C) Livslängden för glp-4(bn2)-muterade djur som odlats på NGM-agarplattor som är seedade med tom vektor (ev) eller hsf-1 RNAi vid 25 °C. För alla förhållanden poängsattes djur för döden var 2: e dag tills alla djur registrerades som döda eller censurerade. Djur med påse, utsprång eller explosion av vulva, eller de som kröp upp på sidorna av plattorna och torkade censurerades. All statistik utfördes med hjälp av Log-Rank Mantel-Cox-testning och finns i tabell 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Äggantal, yngelstorlek och thrashing som mått på healthspan. Thrashing poängsattes hos djur placerade i M9-lösning på en NGM-agarplatta, video inspelad med en vanlig smarttelefonkamera monterad på ett okular med ett standarddissekeringsomfång och thrashing poängsatt i slow motion för noggrannhet. n = 15 djur per tillstånd. (B) Äggantal mättes i vilda N2 (blå) och sur-5p::hsf-1 (röda) djur. Djur odlades vid 20 °C och flyttades på färska tallrikar, och ägg räknades var 12:e timme. Det totala antalet ägg som lades summerades. n = 7 djur för vildtyp och 9 djur för sur-5p::hsf-1. (C) Yngelanalyser mättes på samma djur som (B) där ägg odlades vid 20 °C i 2 dagar för att möjliggöra kläckning, och alla kläckta ägg räknades. = p < 0,001 beräknat med hjälp av icke-parametrisk Mann-Whitney-testning. Varje punkt representerar ett enda djur, och linjer representerar median- och interkvartilområdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Stresstålighet som en proxy för organismens hälsa. Djuren flyttades till plattor som innehöll antingen 1 % DMSO, 10 ng/μL mantelskap (TM) eller 25 ng/μl TM dag 1 i vuxen ålder. B) Överlevnadsanalyser av N2-djur som odlats på den tomma vektorn RNAi-bakterier vid 20 °C. Djur odlades från luckan på plattor som innehöll antingen vatten, 0,25 mM parakvat (PQ) eller 4 mM PQ. För A-B poängsattes djur för döden var 2: e dag tills alla djur registrerades som döda eller censurerade. Djur med påse, utsprång eller explosion av vulva, eller de som kröp upp på sidorna av plattorna och torkade censurerades. All statistik utfördes med hjälp av Log-Rank Mantel-Cox-testning (tabell 2). C) Sammanslagna data för alla 37 °C termotoleranstester för vilda N2-djur jämfört med överuttryck av hsf-1 (sur-5p::hsf-1). Data representeras som procent levande vid tiden = 9 h av en termotoleransanalys, där varje rad representerar ett matchat experiment som utförs samma dag. Djur odlades på den tomma vektorn RNAi-bakterier vid 20 °C och flyttades till 37 °C på dag 1 i vuxen ålder för analys. n = 60 djur per stam och replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Reagens Recept
Blekmedel lösning 1,8 % (v/v) natriumhypoklorit, 0,375 M KOH
Karbenicillin 100 mg/ml stamlösning (1000x) i vatten. Förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader eller -20 °C för långtidsförvaring
FUDR 10 mg/ml lösning i vatten. Förvaras vid -20 °C.
Iptg 1 M lösning i vatten.
Lysogeni buljong (LB) I detta protokoll användes kommersiell LB (se materialtabell), men alla vanliga LB-hemgjorda recept med Bacto-tryptone, jästextrakt och NaCl är tillräckliga.
M9-lösning 22 mM KH2PO4 monobasisk, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematod tillväxtmedia (NGM) 1 mM CaCl2, 5 μg/ml kolesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2 % (w/v) agar, 0,25 % (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl
NGM RNAi-plattor 1 mM CaCl2, 5 μg/ml kolesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml karbenicillin/ampicillin. Förvaras vid 4 ° C i mörker i upp till 3 månader
NGM RNAi DMSO 1 mM CaCl2, 5 μg/ml kolesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml karbenicillin/ampicillin; 1% DMSO
(kontroll för mantelmycin)
NGM RNAi TM 1 mM CaCl2, 5 μg/ml kolesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml karbenicillin/ampicillin; 1% DMSO, 25 ng/μl mantelialmycin
Parakvat 400 mM lösning i vatten – bör beredas färsk
Tetracyklin 10 mg/ml stamlösning (500x) i 100% etanol. Förvaras vid -20 °C
Tunicamycin 2,5 mg/ml stamlösning i 100 % DMSO. Förvaras vid -80 °C för långtidsförvaring. Detta är en 100x lösning (25 ng / μL arbetslösning)

Tabell 1. Recept för reagens och media för protokoll.

Motsvarande bildpanel Stam, behandling Median livslängd # Dödsfall/# Totalt p-värde
(Log-Rank)
1A N2, vektor RNAi, 20 °C 17 74/120 --
N2, hsf-1 RNAi, 20 °C 11 65/120 <0.001
1B N2, vektor RNAi, FUDR, 20 °C 19 120/120 --
N2, hsf-1 RNAi, FUDR, 20 °C 11 116/120 <0.001
1C N2, glp-4(bn2), vektor RNAi, 25 °C 13 115/121 --
N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25 °C 4 120/120 < 0,001
2A N2, vektor RNAi, 20 °C, 1 % DMSO 19 85/120 --
N2, vektor RNAi, 20 °C, 10 ng/μl mantelialmycin 15 109/120 <0.001
N2, vektor RNAi, 20 °C, 25 ng/μl mantelialmycin 12 117/120 <0.001
2B N2, vektor RNAi, 20 °C 19 84/120 --
N2, vektor RNAi, 20 °C, 0,25 mM parakvat 24 91/120 <0.001
N2, vektor RNAi, 20 °C, 4 mM parakvat 6 50/120 <0.001

Tabell 2. Statistik för livslängd och stresstålighet.

Discussion

Livslängd, som enklast definieras som livets varaktighet, är ett tydligt binärt fenomen i de flesta organismer - antingen lever en organism eller inte. Livslängden korrelerar emellertid inte alltid med en organisms hälsa. Till exempel är mitokondriella hormesismodeller där exponering för mitokondriell stress dramatiskt ökar livslängden i allmänhet några av de längsta levande djuren, men uppvisar hämmad tillväxt och minskad metabolisk funktion 37,54. På samma sätt uppvisar djur med hyperaktiva endoplasmatiska retikulumstressreaktioner också vissa beteenden och fenotyper som kan korreleras med minskad hälsa, trots att de dramatiskt har förbättrat proteinhomeostas och livslängd 36,49. Slutligen är många livslängdsparadigmer i modellorganismer inklusive ökad HSF-1-funktion55, ökad XBP-1-funktion56 och förändrad FoxO-signalering57 alla korrelerade med ökad cancerrisk, och det är obestridligt att förlängd livslängd inte är fördelaktigt om en organism är i en ständig kamp med cancer och andra hälsosjukdomar. Därför kan livslängden inte vara ett fristående mått i åldrandebiologin.

Således har begreppet healthspan varit ett växande fält inom åldrandebiologi. Healthspan, löst definierad som den livstid som man är frisk, är svårare att fastställa än livslängd. Men till skillnad från livslängd är begreppet "hälsa" komplicerat, eftersom det finns många olika avläsningar av organismens hälsa: på organismnivå finns det muskelfunktion / styrka, neuronal / kognitiv funktion, reproduktiv hälsa etc.; på cellulär nivå finns proteinhomeostas, lipidhomeostas, glukoshomeostas, metabolism etc. År 2014 har åldrande biologer definitivt karakteriserat biologiska kännetecken för åldrande med den strukturerade definitionen att det måste vara något som naturligt bryts ner under åldrandet och kan experimentellt förändras så att experimentell förvärring bör påskynda åldrandet och experimentell intervention bör sakta ner åldrandet. Dessa nio kännetecken för åldrande inkluderar genomisk instabilitet, telomerförstöring, epigenetiska förändringar, förlust av proteinhomeostas (proteostas), stamcellsutmattning, förändrad intercellulär signalering, mitokondriell dysfunktion, avreglerad näringsavkänning och cellulär åldrande58. Sedan dess hävdar många studier att andra faktorer bör inkluderas, inklusive extracellulära proteiner och systemisk fysiologi som immunitet och inflammation59. I slutändan kräver den komplexa definitionen av healthspan att organismens hälsa mäts med flera olika metoder.

Därför presenteras i detta manuskript flera metoder för att mäta olika aspekter av healthspan med hjälp av nematodmodellen, C. elegans. Vi analyserar lokomotoriskt beteende med hjälp av thrashing-analyser, reproduktiv hälsa med äggantal och yngelstorlek och känslighet för stress. Faktum är att lokomotoriskt beteende är en guldstandardmetod för att mäta healthspan, eftersom organismer uppvisar signifikant förlust av rörlighet och rörelse under åldrande51. Förlust av lokomotoriskt beteende kan tillskrivas flera kännetecken för åldrande, eftersom muskelfunktionen i C. elegans är beroende av korrekt proteostas60, mitokondriell dysfunktion61 och neuronmuskelsignalering62. Medan detta manuskript fokuserar på en mätning av lokomotoriskt beteende, är det viktigt att notera att många andra metoder finns, inklusive rörlighet hos djur på en fast agarplatta, svar på beröring51 och kemotaxianalyser63. Dessa metoder kräver dock i allmänhet mer sofistikerade inspelningsenheter, användning av maskspårningsprogramvara eller användning av dyra, farliga eller flyktiga kemikalier, som alla kan vara oöverkomliga i vissa forskningsinställningar.

Dessutom presenteras analyser för äggantal och yngelstorlek som en metod för att mäta reproduktiv hälsa och som den enklaste metoden för att mäta celldelning hos vuxna maskar, eftersom vuxna maskar är post-mitotiska och endast könsceller och embryon genomgår celldelning inom en vuxen mask64. Som ett mått på celldelning kan reproduktiv hälsa vara relevant för åldrandets kännetecken för cellulär åldrande och stamcellsutmattning. Reproduktiv hälsa kan påverkas av många faktorer, inklusive patogen infektion65 eller exponering för stress49, även om det inte finns något direkt samband mellan reproduktiv hälsa och livslängd. Faktum är att vissa långlivade djur uppvisar en signifikant minskning av yngelstorlek49, och det är till och med möjligt att det finns en omvänd korrelation mellan livslängd och yngelstorlek50. Detta är inte ett fenomen som är specifikt för C. elegans, eftersom skadliga effekter av reproduktion på livslängden länge har observerats hos människor66, följeslagare67 och möss68. Ändå tillhandahåller vi äggantal och yngelstorlek som en pålitlig och billig metod för att mäta reproduktiv hälsa med förbehållet att reproduktiv hälsa kanske inte korrelerar med livslängd eller hälsospann.

Slutligen erbjuds överlevnadsanalyser som ett indirekt mått på organismens hälsa. Viktigt är att cellulära stressreaktioner, inklusive svar på termisk stress69 och ER-stress35, snabbt minskar under åldringsprocessen och har direkt relevans för åldringskännetecknet för proteostas70,71. Däremot kan hyperaktiverande stressreaktioner avsevärt öka livslängden genom att främja motståndskraft mot stress 35,37,38. Medan denna studie fokuserar på de enklaste och billigaste metoderna, finns det ett stort antal alternativa metoder för stressresiliensanalyser för termotolerans41 och oxidativ stress66, var och en kräver en annan uppsättning utrustning och förbrukningsvaror. Utöver enkla exponeringsstudier för stressfaktorer kan andra fysiologiska metoder utföras beroende på tillgång till utrustning. Till exempel kan en extracellulär flödesanalysator övervaka mitokondriell funktion och cellulär andning73; fluorescerande dissektionsmikroskop möjliggör mätningar av transkriptionella reportrar för aktivering av stressrespons20; och högupplösta förenings- eller konfokalmikroskop kan användas för att mäta organellmorfologi med fluorescerande sonder för mitokondrier74, endoplasmatisk retikulum 75,76 och aktincytoskelett77.

Som en sista varningsberättelse för mätningar av livslängd, medan kemiska och genetiska metoder för sterilisering av maskar erbjuds för att avsevärt minska kostnaden, är det viktigt att notera att båda direkt kan påverka livslängden. Till exempel har exponering för FUDR tidigare rapporterats påverka både livslängd och termotolerans45. Och medan glp-4(bn2)-mutanten i sig inte har några direkta effekter på livslängden, är tillväxt vid 25 °C en mild värmestress33,34 och kan därmed påverkalivslängden 2. Det finns andra metoder för sterilisering av C. elegans, inklusive auxinmedierad sterilitet78 eller alternativa temperaturkänsliga spermiebristmutanter79. Alla metoder har dock vissa försiktighetsåtgärder, och man bör vara försiktig med att använda den minst skadliga analysen för varje laboratoriums vetenskapliga behov. En sista begränsning av livslängdsstudier är potentiell variabilitet som kan uppstå på grund av låga urvalsstorlekar eller helt enkelt av ett objektivt fel av utredaren. Detta kan kringgås eftersom ny teknik föds i automatiserad livslängdsteknik80, men återigen är dessa system kostsamma och kräver viss ingenjörs- och beräkningsutrustning och färdigheter. I slutändan är samlingen av metoder som tillhandahålls här en pålitlig uppsättning verktyg som snabbt kan anpassas och läras i nästan vilken institution som helst och ge en solid grund för åldrande biologi.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

G.G. stöds av T32AG052374 och R.H.S. stöds av R00AG065200 från National Institute on Aging. Vi tackar CGC (finansierat av NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) för stammarna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APEX IPTG Genesee 18-242 for RNAi
Bacto Agar VWR 90000-764 for NGM plates
Bacto Peptone VWR 97064-330 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin VWR 76345-522 for RNAi
Cholesterol VWR 80057-932 for NGM plates
DMSO VWR BDH1115-1LP solvent for drugs
LB Broth VWR 95020-778 for LB
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-132 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride VWR 97061-566 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
S7E Dissecting Scope Leica 10450840 Standard dissecting microscope
Sodium Chloride VWR EM-SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium hypochlorite VWR RC7495.7-32 for bleach solution
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tetracycline hydrochloride VWR 97061-638 for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  2. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing and Development. 6 (6), 413-429 (1977).
  3. Friedman, D. B., Johnson, T. E. A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertility. Genetics. 118 (1), 75-86 (1988).
  4. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  5. Lithgow, G. J., White, T. M., Melov, S., Johnson, T. E. Thermotolerance and extended life-span conferred by single-gene mutations and induced by thermal stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7540-7544 (1995).
  6. Epel, E. S., Lithgow, G. J. Stress biology and aging mechanisms: toward understanding the deep connection between adaptation to stress and longevity. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 69, Suppl 1 10-16 (2014).
  7. Luo, Y. Long-lived worms and aging. Redox Report: Communications in Free Radical Research. 9 (2), 65-69 (2004).
  8. Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
  9. Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  12. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  13. Reboul, J., et al. Open-reading-frame sequence tags (OSTs) support the existence of at least 17,300 genes in C. elegans. Nature Genetics. 27 (3), 332-336 (2001).
  14. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nature Genetics. 33 (1), 40-48 (2003).
  15. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
  16. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
  17. Pang, S., Curran, S. P. Adaptive capacity to bacterial diet modulates aging in C. elegans. Cell Metabolism. 19 (2), 221-231 (2014).
  18. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLOS ONE. 4 (10), 7545 (2009).
  19. Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes & Development. 23 (4), 496-511 (2009).
  20. Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61001 (2020).
  21. Xiao, R., et al. RNAi interrogation of dietary modulation of development, metabolism, behavior, and aging in C. elegans. Cell Reports. 11 (7), 1123-1133 (2015).
  22. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  23. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  24. Kim, H. -M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-guided genome engineering in C. elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106 (2019).
  25. Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Genetics. 211 (2), 431-457 (2019).
  26. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19648/ (2006).
  27. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  28. Kaymak, E., et al. Efficient generation of transgenic reporter strains and analysis of expression patterns in Caenorhabditis elegans using Library MosSCI. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 245 (9), 925-936 (2016).
  29. Mariol, M. -C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (82), (2013).
  30. Rastogi, S., et al. Caenorhabditis elegans glp-4 encodes a valyl aminoacyl tRNA synthetase. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2719-2728 (2015).
  31. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), Cambridge, England. 755-766 (1992).
  32. Santi, D. V., McHenry, C. S. 5-Fluoro-2′-Deoxyuridylate: covalent complex with thymidylate synthetase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69 (7), 1855-1857 (1972).
  33. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), 270-276 (1994).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
  35. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
  36. Higuchi-Sanabria, R., et al. Divergent nodes of non-autonomous UPRER signaling through serotonergic and dopaminergic neurons. Cell Reports. 33 (10), 108489 (2020).
  37. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
  38. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  39. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Biochemistry. 18 (11), 2186-2192 (1979).
  40. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
  41. Park, H. -E. H., Jung, Y., Lee, S. -J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  42. Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the effects of bacteria on C. Elegans behavior using an egg retention assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e51203 (2013).
  43. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a neuropeptide gene on behavioral states in Caenorhabditis elegans egg-laying. Genetics. 154 (3), 1181-1192 (2000).
  44. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), San Diego, Calif. 450-457 (2014).
  45. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset). PLOS ONE. 9 (1), 85964 (2014).
  46. Hsu, A. -L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
  47. Bansal, A., Zhu, L. J., Yen, K., Tissenbaum, H. A. Uncoupling lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans longevity mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 277-286 (2015).
  48. Hodgkin, J., Barnes, T. M. More is not better: brood size and population growth in a self-fertilizing nematode. Proceedings. Biological Sciences. 246 (1315), 19-24 (1991).
  49. Ozbey, N. P., et al. Tyramine Acts Downstream of Neuronal XBP-1s to coordinate inter-tissue UPRER activation and behavior in C. elegans. Developmental Cell. 55 (6), 754-770 (2020).
  50. Lee, Y., et al. Inverse correlation between longevity and developmental rate among wild C. elegans strains. Aging. 8 (5), Albany NY. 986-994 (2016).
  51. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  52. Lee, S. -J., Hwang, A. B., Kenyon, C. Inhibition of respiration extends C. elegans life span via reactive oxygen species that increase HIF-1 activity. Current Biology: CB. 20 (23), 2131-2136 (2010).
  53. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science. 346 (6207), 360-363 (2014).
  54. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  55. Carpenter, R. L., Gökmen-Polar, Y. HSF1 as a cancer biomarker and therapeutic target. Current Cancer Drug Targets. 19 (7), 515-524 (2019).
  56. Chen, S., et al. The emerging role of XBP1 in cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 127, 110069 (2020).
  57. Yadav, R. K., Chauhan, A. S., Zhuang, L., Gan, B. FoxO transcription factors in cancer metabolism. Seminars in Cancer Biology. 50, 65-76 (2018).
  58. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  59. Kennedy, B. K., et al. Geroscience: linking aging to chronic disease. Cell. 159 (4), 709-713 (2014).
  60. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  61. Hewitt, J. E., et al. Muscle strength deficiency and mitochondrial dysfunction in a muscular dystrophy model of Caenorhabditis elegans and its functional response to drugs. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
  62. Gao, S., Zhen, M. Action potentials drive body wall muscle contractions in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2557-2562 (2011).
  63. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50069 (2013).
  64. Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
  65. Madhu, B. J., Salazar, A. E., Gumienny, T. L. Caenorhabditis elegans egg-laying and brood-size changes upon exposure to Serratia marcescens and Staphylococcus epidermidis are independent of DBL-1 signaling. microPublication Biology. 2019, (2019).
  66. Westendorp, R. G., Kirkwood, T. B. Human longevity at the cost of reproductive success. Nature. 396 (6713), 743-746 (1998).
  67. Hoffman, J. M., Creevy, K. E., Promislow, D. E. L. Reproductive capability is associated with lifespan and cause of death in companion dogs. PLOS ONE. 8 (4), 61082 (2013).
  68. Garratt, M., Try, H., Smiley, K. O., Grattan, D. R., Brooks, R. C. Mating in the absence of fertilization promotes a growth-reproduction versus lifespan trade-off in female mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15748-15754 (2020).
  69. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the heat shock response is a programmed event at the onset of reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  70. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A futile battle? Protein quality control and the stress of aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
  71. Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Hijacking cellular stress responses to promote lifespan. Frontiers in Aging. 3, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fragi.2022.860404 (2022).
  72. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring oxidative stress in Caenorhabditis elegans: paraquat and juglone sensitivity assays. Bio-protocol. 7 (1), 2086 (2017).
  73. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of oxidative stress: mitochondrial function using the seahorse system. Methods in molecular biology. 1710, Clifton, N.J. 285-293 (2018).
  74. Daniele, J. R., et al. High-throughput characterization of region-specific mitochondrial function and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749 (2017).
  75. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
  76. Daniele, J. R., et al. UPRER promotes lipophagy independent of chaperones to extend life span. Science Advances. 6 (1), 1441 (2020).
  77. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).
  78. Kasimatis, K. R., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Phillips, P. C. Auxin-mediated sterility induction system for longevity and mating studies in Caenorhabditis elegans. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (8), 2655-2662 (2018).
  79. Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (4), 145-156 (1994).
  80. Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).

Tags

Genetik Utgåva 183 C. elegans stress åldrande utfällt proteinsvar endoplasmatisk retikulum mitokondrier värmechockrespons
Kartläggning av billiga metoder för att mäta livslängd och hälsa i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castro Torres, T., Moaddeli, D.,… More

Castro Torres, T., Moaddeli, D., Averbukh, M., Coakley, A. J., Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (183), e64091, doi:10.3791/64091 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter