Nous fournissons un protocole qui peut généralement être appliqué à certains aptamères qui se lient uniquement aux virus infectieux et non aux virus qui ont été rendus non infectieux par une méthode de désinfection ou à tout autre virus similaire. Cela ouvre la possibilité de déterminer le statut d’infectiosité dans les tests portables et rapides.
Les infections virales ont un impact majeur sur la société; La plupart des méthodes de détection ont des difficultés à déterminer si un virus détecté est infectieux, ce qui entraîne des retards dans le traitement et une propagation ultérieure du virus. Le développement de nouveaux capteurs capables d’informer sur l’infectabilité d’échantillons cliniques ou environnementaux permettra de relever ce défi non relevé. Cependant, très peu de méthodes peuvent obtenir des molécules de détection capables de reconnaître un virus infectieux intact et de le différencier du même virus qui a été rendu non infectieux par les méthodes de désinfection. Ici, nous décrivons un protocole pour sélectionner des aptamères capables de distinguer les virus infectieux des virus non infectieux en utilisant l’évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX). Nous profitons de deux fonctionnalités de SELEX. Tout d’abord, SELEX peut être conçu sur mesure pour éliminer les cibles concurrentes, telles que les virus non infectieux ou d’autres virus similaires, en utilisant la contre-sélection. De plus, le virus entier peut être utilisé comme cible pour SELEX, au lieu d’une protéine de surface virale, par exemple. Le virus entier SELEX permet de sélectionner des aptamères qui se lient spécifiquement à l’état natif du virus, sans avoir besoin de perturber le virus. Cette méthode permet ainsi d’obtenir des agents de reconnaissance en fonction des différences fonctionnelles de surface des agents pathogènes, qui n’ont pas besoin d’être connues à l’avance.
Les infections virales ont d’énormes répercussions économiques et sociétales dans le monde entier, comme l’a montré de plus en plus la récente pandémie de COVID-19. Un diagnostic rapide et précis est primordial dans le traitement des infections virales tout en prévenant la propagation des virus aux personnes en bonne santé. Bien que de nombreuses méthodes de détection de virus aient été développées, telles que les tests PCR1,2 et les tests inmunoassays3, la plupart des méthodes actuellement utilisées ne sont pas en mesure de déterminer si le virus détecté est réellement infectieux ou non. En effet, la présence de composants du virus seuls, tels que l’acide nucléique viral ou les protéines, n’indique pas que le virus infectieux intact est présent, et les niveaux de ces biomarqueurs ont montré une faible corrélation avec l’infectiosité 4,5,6. Par exemple, l’ARN viral, couramment utilisé pour les tests actuels de dépistage de la COVID-19 basés sur la PCR, présente des niveaux très faibles dans les premiers stades de l’infection lorsque le patient est contagieux, tandis que le taux d’ARN est souvent encore très élevé lorsque les patients se sont rétablis de l’infection et ne sont plus contagieux 7,8. Les biomarqueurs de protéines virales ou d’antigènes suivent une tendance similaire, mais apparaissent généralement encore plus tard que l’ARN viral et sont donc encore moins prédictifs de l’infectabilité 6,9. Pour remédier à cette limitation, certaines méthodes permettant d’informer sur l’état d’infectiosité du virus ont été développées, mais sont basées sur des techniques de microbiologie de culture cellulaire qui nécessitent beaucoup de temps (jours ou semaines) pour obtenir des résultats 4,10. Ainsi, le développement de nouveaux capteurs capables d’informer sur l’infectabilité des échantillons cliniques ou environnementaux peut éviter les retards dans le traitement et la propagation du virus. Cependant, très peu de méthodes peuvent obtenir des molécules de détection capables de reconnaître un virion infectieux intact et de le différencier du même virus qui a été rendu non infectieux.
Dans ce contexte, les aptamères sont particulièrement bien adaptés en tant qu’outil biomoléculaire unique11,12,13,14. Les aptamères sont de courtes molécules d’ADN ou d’ARN simple brin avec une séquence nucléotidique spécifique qui leur permet de former une conformation 3D spécifique pour reconnaître une cible à haute affinité et sélectivité15,16. Ils sont obtenus par un processus de sélection combinatoire appelé évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX), également connu sous le nom de sélection in vitro, qui est réalisé dans des tubes à essai avec une grande bibliothèque aléatoire d’échantillonnage d’ADN de 10 14-10 15 séquences17,18,19. À chaque cycle de ce processus itératif, le pool d’ADN est d’abord soumis à une pression de sélection par incubation avec la cible dans les conditions souhaitées. Toutes les séquences qui ne sont pas liées à la cible sont ensuite supprimées, ne laissant derrière elles que les quelques séquences capables de se lier dans les conditions données. Enfin, les séquences qui ont été sélectionnées à l’étape précédente sont amplifiées par PCR, enrichissant la population du pool avec les séquences fonctionnelles souhaitées pour le prochain tour de sélection, et le processus est répété. Lorsque l’activité du pool de sélection atteint un plateau (généralement après 8-15 tours), la bibliothèque est analysée par séquençage de l’ADN pour identifier les séquences gagnantes présentant la plus grande affinité.
SELEX présente des avantages uniques qui peuvent être exploités pour obtenir une sélectivité accrue par rapport à d’autres cibles similaires20,21, telles que l’état d’infectiosité du virus 22. Tout d’abord, une grande variété de différents types de cibles peuvent être utilisées pour la sélection, des petites molécules et protéines aux agents pathogènes entiers et aux cellules16. Ainsi, pour obtenir un aptamère qui se lie à un virus infectieux, un virus intact peut être utilisé comme cible, au lieu d’une protéine de surface virale19. Le virus entier SELEX permet de sélectionner des aptamères qui se lient spécifiquement à l’état natif du virus, sans qu’il soit nécessaire de perturber le virus. Deuxièmement, SELEX peut être conçu sur mesure pour éliminer les cibles concurrentes 21,23, telles que d’autres virus similaires ou des virus inactivés non infectieux, en utilisant des étapes de contre-sélection à chaque tour de sélection22. Au cours des étapes de contre-sélection, le pool d’ADN est exposé à des cibles pour lesquelles la liaison n’est pas souhaitée, et toutes les séquences qui se lient sont rejetées.
Dans ce travail, nous fournissons un protocole qui peut généralement être appliqué pour sélectionner des aptamères qui se lient à un virus infectieux, mais pas au même virus qui a été rendu non infectieux par une méthode de désinfection particulière ou à un autre virus apparenté. Cette méthode permet d’obtenir des agents de reconnaissance en fonction des différences fonctionnelles de la surface du virus, qui n’ont pas besoin d’être connues à l’avance, et offre ainsi un avantage supplémentaire pour la détection d’agents pathogènes nouvellement apparus ou de maladies peu étudiées.
SELEX permet non seulement l’identification d’aptamères à haute affinité, dans la gamme pM-nM 22,43,44,45, mais aussi avec une sélectivité élevée et accordable. En tirant parti de la contre-sélection, il est possible d’obtenir des aptamères présentant une sélectivité difficile. Par exemple, le groupe Li a démontré sa capacité à obtenir des séquences capables de différen…
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Mme Laura M. Cooper et le Dr Lijun Rong de l’Université de l’Illinois à Chicago pour avoir fourni les échantillons de pseudovirus utilisés dans ce protocole (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), ainsi que le Dr Alvaro Hernandez et le Dr Chris Wright du Centre de biotechnologie Roy J. Carver de l’Université de l’Illinois à Urbana-Champaign pour leur aide au séquençage à haut débit, et de nombreux membres du groupe Lu qui nous ont aidés avec des techniques de sélection in vitro et de caractérisation des aptamères. Ce travail a été soutenu par une subvention RAPID de la National Science Foundation (CBET 20-29215) et une subvention de démarrage de l’Institute for Sustainability, Energy, and Environment de l’Université de l’Illinois à Urbana-Champaign et de l’Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. remercie le PEW Latin American Fellowship pour son soutien financier. Nous remercions également la Fondation Robert A. Welch (subvention F-0020) pour son soutien au programme de recherche du groupe Lu à l’Université du Texas à Austin.
10% Ammonium persulfate (APS) | BioRad | 1610700 | |
100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
1x PBS without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CM | |
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution | BioRad | 1610146 | |
Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA clean-up beads – Section 7.2.2 |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merck | UFC501024 | cut-off 10 kDa |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merck | UFC510024 | cut-off 100 kDa |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | 100165 | |
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module | BioRad | 1851148 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Scientific | 88870001 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Thermo Fisher | 65001 | streptavidin-modified magnetic beads – Section 4.9 |
EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | 324503 | |
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | 1.5 mL |
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit | Takara Bio USA, Inc. | 632200 | Lentivirus quantification kit – Section 3.3.2.1 |
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube | Thermo Scientific | MR02 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | non-UV absorbing |
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels | BioRad | 1658004EDU | |
Mini-PROTEAN Short Plates | BioRad | 1653308 | |
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers | BioRad | 1653310 | |
Molecular Biology Grade Water | Lonza | 51200 | |
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear | BioRad | MLP9611 | |
Nanodrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
OneTaq DNA Polymerase | New England BioLab | M0480S | |
Ovation Ultralow v2 + UDI | Tecan | 0344NB-A01 | High-troughput sequencing library preparation kit – Section 7.2. |
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) | Gilson | F144059M, F144058M, F144056M, F144054M | |
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 4261 | |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | fluorescence-based dsDNA quantification kit – Section 7.2.3 |
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) | Thomas Scientific | 1158U43, 1159M44, 1158U40 | |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002440 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 1725201 | qPCR mastermix – Section 6.2. |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 | USA scientific | AB1183 | PCR tubes |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 |