Sélection in vitro d’aptamères pour différencier les virus infectieux des virus non infectieux

Summary

Nous fournissons un protocole qui peut généralement être appliqué à certains aptamères qui se lient uniquement aux virus infectieux et non aux virus qui ont été rendus non infectieux par une méthode de désinfection ou à tout autre virus similaire. Cela ouvre la possibilité de déterminer le statut d’infectiosité dans les tests portables et rapides.

Abstract

Les infections virales ont un impact majeur sur la société; La plupart des méthodes de détection ont des difficultés à déterminer si un virus détecté est infectieux, ce qui entraîne des retards dans le traitement et une propagation ultérieure du virus. Le développement de nouveaux capteurs capables d’informer sur l’infectabilité d’échantillons cliniques ou environnementaux permettra de relever ce défi non relevé. Cependant, très peu de méthodes peuvent obtenir des molécules de détection capables de reconnaître un virus infectieux intact et de le différencier du même virus qui a été rendu non infectieux par les méthodes de désinfection. Ici, nous décrivons un protocole pour sélectionner des aptamères capables de distinguer les virus infectieux des virus non infectieux en utilisant l’évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX). Nous profitons de deux fonctionnalités de SELEX. Tout d’abord, SELEX peut être conçu sur mesure pour éliminer les cibles concurrentes, telles que les virus non infectieux ou d’autres virus similaires, en utilisant la contre-sélection. De plus, le virus entier peut être utilisé comme cible pour SELEX, au lieu d’une protéine de surface virale, par exemple. Le virus entier SELEX permet de sélectionner des aptamères qui se lient spécifiquement à l’état natif du virus, sans avoir besoin de perturber le virus. Cette méthode permet ainsi d’obtenir des agents de reconnaissance en fonction des différences fonctionnelles de surface des agents pathogènes, qui n’ont pas besoin d’être connues à l’avance.

Introduction

Les infections virales ont d’énormes répercussions économiques et sociétales dans le monde entier, comme l’a montré de plus en plus la récente pandémie de COVID-19. Un diagnostic rapide et précis est primordial dans le traitement des infections virales tout en prévenant la propagation des virus aux personnes en bonne santé. Bien que de nombreuses méthodes de détection de virus aient été développées, telles que les tests PCR^1,2 et les tests inmunoassays^3, la plupart des méthodes actuellement utilisées ne sont pas en mesure de déterminer si le virus détecté est réellement infectieux ou non. En effet, la présence de composants du virus seuls, tels que l’acide nucléique viral ou les protéines, n’indique pas que le virus infectieux intact est présent, et les niveaux de ces biomarqueurs ont montré une faible corrélation avec l’infectiosité ^4,5,6. Par exemple, l’ARN viral, couramment utilisé pour les tests actuels de dépistage de la COVID-19 basés sur la PCR, présente des niveaux très faibles dans les premiers stades de l’infection lorsque le patient est contagieux, tandis que le taux d’ARN est souvent encore très élevé lorsque les patients se sont rétablis de l’infection et ne sont plus contagieux ^7,8. Les biomarqueurs de protéines virales ou d’antigènes suivent une tendance similaire, mais apparaissent généralement encore plus tard que l’ARN viral et sont donc encore moins prédictifs de l’infectabilité ^6,9. Pour remédier à cette limitation, certaines méthodes permettant d’informer sur l’état d’infectiosité du virus ont été développées, mais sont basées sur des techniques de microbiologie de culture cellulaire qui nécessitent beaucoup de temps (jours ou semaines) pour obtenir des résultats ^4,10. Ainsi, le développement de nouveaux capteurs capables d’informer sur l’infectabilité des échantillons cliniques ou environnementaux peut éviter les retards dans le traitement et la propagation du virus. Cependant, très peu de méthodes peuvent obtenir des molécules de détection capables de reconnaître un virion infectieux intact et de le différencier du même virus qui a été rendu non infectieux.

Dans ce contexte, les aptamères sont particulièrement bien adaptés en tant qu’outil biomoléculaire unique^11,12,13,14. Les aptamères sont de courtes molécules d’ADN ou d’ARN simple brin avec une séquence nucléotidique spécifique qui leur permet de former une conformation 3D spécifique pour reconnaître une cible à haute affinité et sélectivité^15,16. Ils sont obtenus par un processus de sélection combinatoire appelé évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX), également connu sous le nom de sélection in vitro, qui est réalisé dans des tubes à essai avec une grande bibliothèque aléatoire d’échantillonnage d’ADN de 10 14-10 15 séquences^17,18,19. À chaque cycle de ce processus itératif, le pool d’ADN est d’abord soumis à une pression de sélection par incubation avec la cible dans les conditions souhaitées. Toutes les séquences qui ne sont pas liées à la cible sont ensuite supprimées, ne laissant derrière elles que les quelques séquences capables de se lier dans les conditions données. Enfin, les séquences qui ont été sélectionnées à l’étape précédente sont amplifiées par PCR, enrichissant la population du pool avec les séquences fonctionnelles souhaitées pour le prochain tour de sélection, et le processus est répété. Lorsque l’activité du pool de sélection atteint un plateau (généralement après 8-15 tours), la bibliothèque est analysée par séquençage de l’ADN pour identifier les séquences gagnantes présentant la plus grande affinité.

SELEX présente des avantages uniques qui peuvent être exploités pour obtenir une sélectivité accrue par rapport à d’autres cibles similaires^20,21, telles que l’état d’infectiosité du virus ²². Tout d’abord, une grande variété de différents types de cibles peuvent être utilisées pour la sélection, des petites molécules et protéines aux agents pathogènes entiers et aux cellules¹⁶. Ainsi, pour obtenir un aptamère qui se lie à un virus infectieux, un virus intact peut être utilisé comme cible, au lieu d’une protéine de surface virale¹⁹. Le virus entier SELEX permet de sélectionner des aptamères qui se lient spécifiquement à l’état natif du virus, sans qu’il soit nécessaire de perturber le virus. Deuxièmement, SELEX peut être conçu sur mesure pour éliminer les cibles concurrentes 21,23, telles que d’autres virus similaires ou des virus inactivés non infectieux^, en utilisant des étapes de contre-sélection à chaque tour de sélection²². Au cours des étapes de contre-sélection, le pool d’ADN est exposé à des cibles pour lesquelles la liaison n’est pas souhaitée, et toutes les séquences qui se lient sont rejetées.

Dans ce travail, nous fournissons un protocole qui peut généralement être appliqué pour sélectionner des aptamères qui se lient à un virus infectieux, mais pas au même virus qui a été rendu non infectieux par une méthode de désinfection particulière ou à un autre virus apparenté. Cette méthode permet d’obtenir des agents de reconnaissance en fonction des différences fonctionnelles de la surface du virus, qui n’ont pas besoin d’être connues à l’avance, et offre ainsi un avantage supplémentaire pour la détection d’agents pathogènes nouvellement apparus ou de maladies peu étudiées.

Protocol

1. Préparation des réactifs et des tampons Préparer 10x Tris-borate EDTA (10x TBE) en ajoutant 0,9 M Tris-base, 0,9 M d’acide borique, 20 mM EDTA (sel disodique) et eau désionisée jusqu’à un volume final de 1 L. Mélanger jusqu’à ce que tous les composants soient dissous. Préparer une solution mère de polyacrylamide dénaturant à 10% comme suit. Dans une bouteille en verre de 250 mL, ajouter 120 g d’urée (8 M), 25 mL de 10x TBE, 62,5 mL de solution d’acrylamide/bi…

Representative Results

Étant donné que les aptamères d’ADN peuvent être obtenus à l’aide de SELEX dans un tube à essai15, cette stratégie SELEX a été soigneusement conçue pour inclure à la fois des étapes de sélection positive vers le virus infectieux intact et entier (c.-à-d. conserver les molécules d’ADN qui se lient au virus infectieux), ainsi que des étapes de contre-sélection pour le même virus qui a été rendu non infectieux par une méthode de désinfection particulière. en particulier …

Discussion

SELEX permet non seulement l’identification d’aptamères à haute affinité, dans la gamme pM-nM 22,43,44,45^, mais aussi avec une sélectivité élevée et accordable. En tirant parti de la contre-sélection, il est possible d’obtenir des aptamères présentant une sélectivité difficile. Par exemple, le groupe Li a démontré sa capacité à obtenir des séquences capables de différen…

Materials

10% Ammonium persulfate (APS)	BioRad	1610700
100% Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
1x PBS without calcium & magnesium	Corning	21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution	BioRad	1610146
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	DNA clean-up beads – Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merck	UFC501024	cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merck	UFC510024	cut-off 100 kDa
Boric Acid	Sigma-Aldrich	100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module	BioRad	1851148
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters	Thermo Scientific	88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Thermo Fisher	65001	streptavidin-modified magnetic beads – Section 4.9
EDTA disodium salt	Sigma-Aldrich	324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	T9661	1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit	Takara Bio USA, Inc.	632200	Lentivirus quantification kit – Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube	Thermo Scientific	MR02
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	BioRad	MSB1001	non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels	BioRad	1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates	BioRad	1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers	BioRad	1653310
Molecular Biology Grade Water	Lonza	51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear	BioRad	MLP9611
Nanodrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase	New England BioLab	M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI	Tecan	0344NB-A01	High-troughput sequencing library preparation kit – Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL)	Gilson	F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets	Labconco	4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen	Q32850	fluorescence-based  dsDNA quantification  kit – Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)	Thomas Scientific	1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002440
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	1725201	qPCR mastermix – Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8	USA scientific	AB1183	PCR tubes
Urea	Sigma-Aldrich	U5128