JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bio-ingénierie

Отбор аптамеров in vitro для дифференциации инфекционных вирусов от неинфекционных

Published: September 07, 2022
doi:
10.3791/64127
, , ,
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry,University of Texas at Austin

Summary

Мы предоставляем протокол, который обычно может применяться к отдельным аптамерам, которые связываются только с инфекционными вирусами, а не с вирусами, которые стали неинфекционными с помощью метода дезинфекции, или с любыми другими подобными вирусами. Это открывает возможность определения инфекционного статуса в портативных и экспресс-тестах.

Abstract

Вирусные инфекции оказывают серьезное влияние на общество; Большинство методов обнаружения испытывают трудности с определением того, является ли обнаруженный вирус заразным, что приводит к задержкам в лечении и дальнейшему распространению вируса. Разработка новых датчиков, которые могут информировать о заразности клинических образцов или образцов окружающей среды, позволит решить эту нерешенную задачу. Однако очень немногие методы могут получить чувствительные молекулы, которые могут распознавать интактный инфекционный вирус и отличать его от того же вируса, который был сделан неинфекционным методами дезинфекции. Здесь мы описываем протокол выбора аптамеров, которые могут различать инфекционные вирусы и неинфекционные вирусы, используя систематическую эволюцию лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX). Мы воспользуемся двумя особенностями SELEX. Во-первых, SELEX может быть адаптирован для удаления конкурирующих целей, таких как неинфекционные вирусы или другие подобные вирусы, с помощью встречного отбора. Кроме того, весь вирус может быть использован в качестве мишени для SELEX вместо, например, вирусного поверхностного белка. Цельный вирус SELEX позволяет подбирать аптамеры, которые связываются конкретно с нативным состоянием вируса, без необходимости разрушения вируса. Таким образом, этот метод позволяет получать агенты распознавания на основе функциональных различий на поверхности патогенов, которые не нужно знать заранее.

Introduction

Вирусные инфекции оказывают огромное влияние на экономику и общество во всем мире, что становится все более очевидным в связи с недавней пандемией COVID-19. Своевременная и точная диагностика имеет первостепенное значение в лечении вирусных инфекций при предотвращении распространения вирусов среди здоровых людей. Несмотря на то, что было разработано множество методов обнаружения вирусов, таких как ПЦР-тесты1,2 и иммуноанализы3, большинство используемых в настоящее время методов не способны определить, действительно ли обнаруженный вирус заразен или нет. Это связано с тем, что наличие компонентов вируса само по себе, таких как вирусная нуклеиновая кислота или белки, не указывает на присутствие интактного инфекционного вируса, и уровни этих биомаркеров показали плохую корреляцию с инфекционностью 4,5,6. Например, вирусная РНК, обычно используемая для текущих тестов на COVID-19 на основе ПЦР, имеет очень низкие уровни на ранних стадиях инфекции, когда пациент заразен, в то время как уровень РНК часто все еще очень высок, когда пациенты выздоровели от инфекции и больше не заразны 7,8. Вирусный белок или антигенные биомаркеры следуют аналогичной тенденции, но обычно появляются даже позже, чем вирусная РНК, и, таким образом, еще менее прогностируют инфекционность 6,9. Чтобы устранить это ограничение, были разработаны некоторые методы, которые могут информировать о статусе инфекционности вируса, но основаны на методах микробиологии клеточных культур, которые требуют длительного времени (дни или недели) для получения результатов 4,10. Таким образом, разработка новых датчиков, которые могут информировать о заразности клинических образцов или образцов окружающей среды, может избежать задержек в лечении и дальнейшего распространения вируса. Тем не менее, очень немногие методы могут получить чувствительные молекулы, которые могут распознавать интактный инфекционный вирион и отличать его от того же вируса, который был признан незаразным.

В этом контексте аптамеры особенно хорошо подходят в качестве уникального биомолекулярного инструмента11,12,13,14. Аптамеры представляют собой короткие одноцепочечные молекулы ДНК или РНК со специфической нуклеотидной последовательностью, которая позволяет им формировать специфическую 3D-конформацию для распознавания мишени с высоким сродством и селективностью15,16. Они получены с помощью комбинаторного процесса отбора, называемого систематической эволюцией лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX), также известного как отбор in vitro, который проводится в пробирках с большой библиотекой случайной выборки ДНК из 10 14-10 15 последовательностей17,18,19. В каждом раунде этого итеративного процесса пул ДНК сначала подвергается давлению отбора путем инкубации с мишенью в желаемых условиях. Любые последовательности, которые не связаны с целью, затем удаляются, оставляя только те немногие последовательности, которые могут связываться при данных условиях. Наконец, последовательности, которые были выбраны на предыдущем шаге, амплифицироваются с помощью ПЦР, обогащая популяцию пула желаемыми функциональными последовательностями для следующего раунда отбора, и процесс повторяется. Когда активность пула отбора достигает плато (обычно после 8-15 раундов), библиотека анализируется с помощью секвенирования ДНК для выявления выигрышных последовательностей, проявляющих наибольшее сродство.

SELEX обладает уникальными преимуществами, которые могут быть использованы для повышения селективности по отношению к другим аналогичным мишеням 20,21, например, по инфекционному статусу вируса22. Во-первых, для селекции можно использовать широкий спектр различных типов мишеней, от малых молекул и белков до целых патогенов и клеток16. Таким образом, для получения аптамера, который связывается с инфекционным вирусом, в качестве мишени может быть использован интактный вирус вместо вирусного поверхностного белка19. Whole virus SELEX позволяет подбирать аптамеры, которые специфически связываются с нативным состоянием вируса, без необходимости разрушения вируса. Во-вторых, SELEX может быть адаптирован для удаления конкурирующих мишеней 21,23, таких как другие аналогичные вирусы или неинфекционные инактивированные вирусы, с использованием этапов встречного отбора в каждом раунде отбора22. Во время этапов отбора счетчиков пул ДНК подвергается воздействию мишеней, для которых связывание нежелательно, и любые последовательности, которые связываются, отбрасываются.

В этой работе мы приводим протокол, который в целом может быть применен для выбора аптамеров, которые связываются с инфекционным вирусом, но не с тем же вирусом, который был сделан неинфекционным с помощью конкретного метода дезинфекции, или с другими родственными вирусами. Этот метод позволяет получать распознавающие агенты на основе функциональных различий поверхности вируса, которые не нужно знать заранее, и, таким образом, дает дополнительное преимущество для обнаружения вновь появившихся патогенов или для недостаточно изученных заболеваний.

Protocol

1. Приготовление реагентов и буферов Приготовьте 10x трис-борат ЭДТА (10x TBE), добавив 0,9 М трис-основания, 0,9 М борной кислоты, 20 мМ ЭДТА (динатриевая соль) и деионизированную воду до конечного объема 1 л. Перемешивайте до тех пор, пока все компоненты не растворятся. Приготов…

Representative Results

Поскольку ДНК-аптамеры могут быть получены с использованием SELEX в пробирке15, эта стратегия SELEX была тщательно разработана, чтобы включить как положительные этапы отбора к интактному, цельному инфекционному вирусу (т.е. сохранить молекулы ДНК, которые связываются с инфекцио…

Discussion

SELEX позволяет не только идентифицировать аптамеры с высоким сродством, в диапазоне pM-nM 22,43,44,45, но и с высокой и перестраиваемой селективностью. Воспользовавшись встречным отбором, можно получить аптамеров со сложной…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить г-жу Лауру М. Купер и д-ра Лицзюнь Ронга из Иллинойского университета в Чикаго за предоставление образцов псевдовируса, используемых в этом протоколе (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), а также д-ра Альваро Эрнандеса и д-ра Криса Райта из Центра ДНК-услуг Биотехнологического центра Роя Дж. и многие члены группы Lu, которые помогли нам с селекцией in vitro и методами характеристики аптамеров. Эта работа была поддержана грантом RAPID от Национального научного фонда (CBET 20-29215) и начальным грантом от Института устойчивого развития, энергетики и окружающей среды Университета Иллинойса в Урбана-Шампейн и Института Иллинойс-JITRI (JITRI 23965). A.S.P. благодарит Латиноамериканское братство PEW за финансовую поддержку. Мы также благодарим Фонд Роберта А. Уэлча (грант F-0020) за поддержку исследовательской программы группы Лу в Техасском университете в Остине.

Materials

10% Ammonium persulfate (APS) BioRad 1610700
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
1x PBS without calcium & magnesium Corning 21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution BioRad 1610146
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA clean-up beads – Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC501024 cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC510024 cut-off 100 kDa
Boric Acid Sigma-Aldrich 100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module BioRad 1851148
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Scientific 88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Thermo Fisher 65001 streptavidin-modified magnetic beads – Section 4.9
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich 324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661 1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit Takara Bio USA, Inc. 632200 Lentivirus quantification kit – Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube Thermo Scientific MR02
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001 non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels BioRad 1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates BioRad 1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers BioRad 1653310
Molecular Biology Grade Water Lonza 51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear BioRad MLP9611
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase New England BioLab M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI Tecan 0344NB-A01 High-troughput sequencing library preparation kit – Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) Gilson F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorescence-based  dsDNA quantification  kit – Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) Thomas Scientific 1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002440
SsoFast EvaGreen Supermix BioRad 1725201 qPCR mastermix – Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 USA scientific AB1183 PCR tubes
Urea Sigma-Aldrich U5128
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
  2. Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020).
  3. Tang, Z., et al. A materials-science perspective on tackling COVID-19. Nature Reviews Materials. 5 (11), 847-860 (2020).
  4. Cook, N., Cliver, D. O. VIRUSES | Detection. Encyclopedia of Food Microbiology. 3, 727-731 (2014).
  5. Weissleder, R., Lee, H., Ko, J., Pittet, M. J. COVID-19 diagnostics in context. Science Translational Medicine. 12 (546), 1-7 (2020).
  6. Joynt, G. M., Wu, W. K. Understanding COVID-19: what does viral RNA load really mean. The Lancet Infectious Diseases. 3099 (20), 19-20 (2020).
  7. Wölfel, R., et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 581 (7809), 465-469 (2020).
  8. Perera, R. A. P. M., et al. SARS-CoV-2 virus culture and subgenomic RNA for respiratory specimens from patients with mild coronavirus disease. Emerging Infectious Diseases. 26 (11), 2701-2704 (2020).
  9. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA – Journal of the American Medical Association. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  10. Basile, K., et al. Cell-based culture informs infectivity and safe de-isolation assessments in patients with coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (9), 2952-2959 (2021).
  11. Xing, H., Hwang, K., Li, J., Torabi, S. -. F., Lu, Y. DNA aptamer technology for personalized medicine. Current Opinion in Chemical Engineering. 4, 79-87 (2014).
  12. Xiong, Y., et al. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society. 142 (1), 207-213 (2020).
  13. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  14. Chakraborty, B., et al. Aptamers for viral detection and inhibition. ACS Infectious Diseases. 8 (4), 667-692 (2022).
  15. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chemical Reviews. 109 (5), 1948-1998 (2009).
  16. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1 (10), 1-16 (2017).
  17. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  18. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  19. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  20. Bruesehoff, P. J., Li, J., Augustine, A. J., Lu, Y. Improving metal ion specificity during in vitro selection of catalytic DNA. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 5 (4), 327-335 (2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angewandte Chemie International Edition. 55 (7), 2431-2434 (2016).
  22. Peinetti, A. S., et al. Direct detection of human adenovirus or SARS-CoV-2 with ability to inform infectivity using DNA aptamer-nanopore sensors. Science Advances. 7 (39), (2021).
  23. Ihms, H. E., Lu, Y. In vitro selection of metal ion-selective DNAzymes. Ribozymes: Methods and Protocols. , 297-316 (2012).
  24. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
  25. Cui, Q., et al. Identification of diaryl-quinoline compounds as entry inhibitors of Ebola virus. Viruses. 10 (12), 678 (2018).
  26. Guo, Y., et al. Identification of a new region of SARS-CoV S protein critical for viral entry. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 600-605 (2009).
  27. Panec, M., Katz, D. S. Plaque assay protocols. Protocols American Society for Microbiology. 7, 1-5 (2011).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), 1-10 (2014).
  29. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., Drebot, M. Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology. 57 (1), 1-15 (2020).
  30. Luo, Z., He, L., Wang, J., Fang, X., Zhang, L. Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. The Analyst. 142 (17), 3136-3139 (2017).
  31. . Babraham bioinformatics – FastQC a quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2022)
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  33. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. P. E. A. R. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30 (5), 614-620 (2014).
  34. Alam, K. K., Chang, J. L., Burke, D. H. FASTAptamer: A bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4 (3), 230 (2015).
  35. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  36. Entzian, C., Schubert, T. Mapping the binding site of an aptamer on ATP using MicroScale Thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55070 (2017).
  37. Romain, M., Thiroux, B., Tardy, M., Quesnel, B., Thuru, X. Measurement of protein-protein interactions through microscale thermophoresis (MST). Bio-Protocol. 10 (7), 1-10 (2020).
  38. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction. Journal of Visualized Experiments. (132), e57334 (2018).
  39. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Analytical Chemistry. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  40. Lou, X., Egli, M., Yang, X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 67 (1), 7-25 (2016).
  41. Cheng, H., et al. Identification of a coumarin-based antihistamine-like small molecule as an anti-filoviral entry inhibitor. Antiviral Research. 145, 24-32 (2017).
  42. Sun, M., et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (18), 10266-10272 (2021).
  43. Li, J., et al. Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library. Nucleic Acids Research. 49 (13), 7267-7279 (2021).
  44. Zhang, L., et al. Discovery of sandwich type COVID-19 nucleocapsid protein DNA aptamers. Chemical Communications. 56 (70), 10235-10238 (2020).
  45. Hamula, C. L. A., et al. An improved SELEX technique for selection of DNA aptamers binding to M-type 11 of Streptococcus pyogenes. Methods. 97, 51-57 (2016).
  46. Liu, J., Lu, Y. Rational design of "turn-on" allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity. Angewandte Chemie International Edition. 46 (40), 7587-7590 (2007).
  47. Liu, J., Mazumdar, D., Lu, Y. A simple and sensitive "dipstick" test in serum based on lateral flow separation of aptamer-linked nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 45 (47), 7955-7959 (2006).
  48. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature Chemistry. 3 (9), 697-703 (2011).
  49. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  50. Li, N., et al. Overcoming the limitations of COVID-19 diagnostics with nanostructures, nucleic acid engineering, and additive manufacturing. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 26, 100966 (2022).
  51. Li, N., et al. Label-free digital detection of intact virions by enhanced scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (4), 1498-1502 (2022).

Tags

Aptamer SelectionIn Vitro SelectionInfectious VirusNon-infectious VirusSELEXAffinity-based SelectionVirus DetectionVirus InfectivityDiagnostic SensingEnvironmental Monitoring

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., Peinetti, A. S. In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses. J. Vis. Exp. (187), e64127, doi:10.3791/64127 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image