Мы предоставляем протокол, который обычно может применяться к отдельным аптамерам, которые связываются только с инфекционными вирусами, а не с вирусами, которые стали неинфекционными с помощью метода дезинфекции, или с любыми другими подобными вирусами. Это открывает возможность определения инфекционного статуса в портативных и экспресс-тестах.
Вирусные инфекции оказывают серьезное влияние на общество; Большинство методов обнаружения испытывают трудности с определением того, является ли обнаруженный вирус заразным, что приводит к задержкам в лечении и дальнейшему распространению вируса. Разработка новых датчиков, которые могут информировать о заразности клинических образцов или образцов окружающей среды, позволит решить эту нерешенную задачу. Однако очень немногие методы могут получить чувствительные молекулы, которые могут распознавать интактный инфекционный вирус и отличать его от того же вируса, который был сделан неинфекционным методами дезинфекции. Здесь мы описываем протокол выбора аптамеров, которые могут различать инфекционные вирусы и неинфекционные вирусы, используя систематическую эволюцию лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX). Мы воспользуемся двумя особенностями SELEX. Во-первых, SELEX может быть адаптирован для удаления конкурирующих целей, таких как неинфекционные вирусы или другие подобные вирусы, с помощью встречного отбора. Кроме того, весь вирус может быть использован в качестве мишени для SELEX вместо, например, вирусного поверхностного белка. Цельный вирус SELEX позволяет подбирать аптамеры, которые связываются конкретно с нативным состоянием вируса, без необходимости разрушения вируса. Таким образом, этот метод позволяет получать агенты распознавания на основе функциональных различий на поверхности патогенов, которые не нужно знать заранее.
Вирусные инфекции оказывают огромное влияние на экономику и общество во всем мире, что становится все более очевидным в связи с недавней пандемией COVID-19. Своевременная и точная диагностика имеет первостепенное значение в лечении вирусных инфекций при предотвращении распространения вирусов среди здоровых людей. Несмотря на то, что было разработано множество методов обнаружения вирусов, таких как ПЦР-тесты1,2 и иммуноанализы3, большинство используемых в настоящее время методов не способны определить, действительно ли обнаруженный вирус заразен или нет. Это связано с тем, что наличие компонентов вируса само по себе, таких как вирусная нуклеиновая кислота или белки, не указывает на присутствие интактного инфекционного вируса, и уровни этих биомаркеров показали плохую корреляцию с инфекционностью 4,5,6. Например, вирусная РНК, обычно используемая для текущих тестов на COVID-19 на основе ПЦР, имеет очень низкие уровни на ранних стадиях инфекции, когда пациент заразен, в то время как уровень РНК часто все еще очень высок, когда пациенты выздоровели от инфекции и больше не заразны 7,8. Вирусный белок или антигенные биомаркеры следуют аналогичной тенденции, но обычно появляются даже позже, чем вирусная РНК, и, таким образом, еще менее прогностируют инфекционность 6,9. Чтобы устранить это ограничение, были разработаны некоторые методы, которые могут информировать о статусе инфекционности вируса, но основаны на методах микробиологии клеточных культур, которые требуют длительного времени (дни или недели) для получения результатов 4,10. Таким образом, разработка новых датчиков, которые могут информировать о заразности клинических образцов или образцов окружающей среды, может избежать задержек в лечении и дальнейшего распространения вируса. Тем не менее, очень немногие методы могут получить чувствительные молекулы, которые могут распознавать интактный инфекционный вирион и отличать его от того же вируса, который был признан незаразным.
В этом контексте аптамеры особенно хорошо подходят в качестве уникального биомолекулярного инструмента11,12,13,14. Аптамеры представляют собой короткие одноцепочечные молекулы ДНК или РНК со специфической нуклеотидной последовательностью, которая позволяет им формировать специфическую 3D-конформацию для распознавания мишени с высоким сродством и селективностью15,16. Они получены с помощью комбинаторного процесса отбора, называемого систематической эволюцией лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX), также известного как отбор in vitro, который проводится в пробирках с большой библиотекой случайной выборки ДНК из 10 14-10 15 последовательностей17,18,19. В каждом раунде этого итеративного процесса пул ДНК сначала подвергается давлению отбора путем инкубации с мишенью в желаемых условиях. Любые последовательности, которые не связаны с целью, затем удаляются, оставляя только те немногие последовательности, которые могут связываться при данных условиях. Наконец, последовательности, которые были выбраны на предыдущем шаге, амплифицироваются с помощью ПЦР, обогащая популяцию пула желаемыми функциональными последовательностями для следующего раунда отбора, и процесс повторяется. Когда активность пула отбора достигает плато (обычно после 8-15 раундов), библиотека анализируется с помощью секвенирования ДНК для выявления выигрышных последовательностей, проявляющих наибольшее сродство.
SELEX обладает уникальными преимуществами, которые могут быть использованы для повышения селективности по отношению к другим аналогичным мишеням 20,21, например, по инфекционному статусу вируса22. Во-первых, для селекции можно использовать широкий спектр различных типов мишеней, от малых молекул и белков до целых патогенов и клеток16. Таким образом, для получения аптамера, который связывается с инфекционным вирусом, в качестве мишени может быть использован интактный вирус вместо вирусного поверхностного белка19. Whole virus SELEX позволяет подбирать аптамеры, которые специфически связываются с нативным состоянием вируса, без необходимости разрушения вируса. Во-вторых, SELEX может быть адаптирован для удаления конкурирующих мишеней 21,23, таких как другие аналогичные вирусы или неинфекционные инактивированные вирусы, с использованием этапов встречного отбора в каждом раунде отбора22. Во время этапов отбора счетчиков пул ДНК подвергается воздействию мишеней, для которых связывание нежелательно, и любые последовательности, которые связываются, отбрасываются.
В этой работе мы приводим протокол, который в целом может быть применен для выбора аптамеров, которые связываются с инфекционным вирусом, но не с тем же вирусом, который был сделан неинфекционным с помощью конкретного метода дезинфекции, или с другими родственными вирусами. Этот метод позволяет получать распознавающие агенты на основе функциональных различий поверхности вируса, которые не нужно знать заранее, и, таким образом, дает дополнительное преимущество для обнаружения вновь появившихся патогенов или для недостаточно изученных заболеваний.
SELEX позволяет не только идентифицировать аптамеры с высоким сродством, в диапазоне pM-nM 22,43,44,45, но и с высокой и перестраиваемой селективностью. Воспользовавшись встречным отбором, можно получить аптамеров со сложной…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить г-жу Лауру М. Купер и д-ра Лицзюнь Ронга из Иллинойского университета в Чикаго за предоставление образцов псевдовируса, используемых в этом протоколе (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), а также д-ра Альваро Эрнандеса и д-ра Криса Райта из Центра ДНК-услуг Биотехнологического центра Роя Дж. и многие члены группы Lu, которые помогли нам с селекцией in vitro и методами характеристики аптамеров. Эта работа была поддержана грантом RAPID от Национального научного фонда (CBET 20-29215) и начальным грантом от Института устойчивого развития, энергетики и окружающей среды Университета Иллинойса в Урбана-Шампейн и Института Иллинойс-JITRI (JITRI 23965). A.S.P. благодарит Латиноамериканское братство PEW за финансовую поддержку. Мы также благодарим Фонд Роберта А. Уэлча (грант F-0020) за поддержку исследовательской программы группы Лу в Техасском университете в Остине.
10% Ammonium persulfate (APS) | BioRad | 1610700 | |
100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
1x PBS without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CM | |
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution | BioRad | 1610146 | |
Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA clean-up beads – Section 7.2.2 |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merck | UFC501024 | cut-off 10 kDa |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merck | UFC510024 | cut-off 100 kDa |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | 100165 | |
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module | BioRad | 1851148 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Scientific | 88870001 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Thermo Fisher | 65001 | streptavidin-modified magnetic beads – Section 4.9 |
EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | 324503 | |
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | 1.5 mL |
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit | Takara Bio USA, Inc. | 632200 | Lentivirus quantification kit – Section 3.3.2.1 |
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube | Thermo Scientific | MR02 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | non-UV absorbing |
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels | BioRad | 1658004EDU | |
Mini-PROTEAN Short Plates | BioRad | 1653308 | |
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers | BioRad | 1653310 | |
Molecular Biology Grade Water | Lonza | 51200 | |
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear | BioRad | MLP9611 | |
Nanodrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
OneTaq DNA Polymerase | New England BioLab | M0480S | |
Ovation Ultralow v2 + UDI | Tecan | 0344NB-A01 | High-troughput sequencing library preparation kit – Section 7.2. |
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) | Gilson | F144059M, F144058M, F144056M, F144054M | |
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 4261 | |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | fluorescence-based dsDNA quantification kit – Section 7.2.3 |
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) | Thomas Scientific | 1158U43, 1159M44, 1158U40 | |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002440 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 1725201 | qPCR mastermix – Section 6.2. |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 | USA scientific | AB1183 | PCR tubes |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 |