Summary
Det nuvarande protokollet beskriver zygotmikroinjektion av CRISPR-Cas9 och donator-DNA för att effektivt producera genkassettknock-in och floxed möss.
Abstract
CRISPR-Cas-tekniken har möjliggjort snabb och enkel generering av genetiskt modifierade möss. Specifikt produceras möss och punktmutanta möss lätt genom elektroporering av CRISPR-faktorer (och enkelsträngade oligo-DNA-donatorer) i zygoten. Däremot genereras genkassett (>1 kb) knock-in och floxade möss huvudsakligen genom mikroinjektion av CRISPR-faktorer och dubbelsträngade DNA-donatorer i zygoter. Genomredigeringsteknik har också ökat flexibiliteten hos genetiskt modifierad mössproduktion. Det är nu möjligt att introducera de avsedda mutationerna i de genomiska målregionerna i ett antal fördelaktiga inavlade musstammar. Vårt team har producerat över 200 genkassetter knock-in muslinjer och över 110 floxed muslinjer genom zygotmikroinjektion av CRISPR-Cas9 efter förfrågningar från flera länder, inklusive Japan. Några av dessa genomredigeringar använde BALB / c, C3H / HeJ och C57BL / 6N inavlade stammar, men de flesta använde C57BL / 6J. Till skillnad från elektroporeringsmetoden är genomredigering genom zygotmikroinjektion i olika inavlade stammar av möss inte så lätt. Genkassettknock-in och floxade möss på enstaka inavlade genetiska bakgrunder är dock lika kritiska som genetiska humaniserade, fluorescerande reporter och villkorliga knockoutmusmodeller. Därför presenterar denna artikel protokollet för zygotmikroinjektion av CRISPR-faktorer och dubbelsträngade DNA-donatorer i C57BL / 6J-möss för att generera genkassettknock-in och floxed möss. Denna artikel fokuserar uteslutande på kärninjektion snarare än cytoplasmatisk injektion. Förutom zygotmikroinjektion beskriver vi tidslinjen för produktionsprocessen och perifera tekniker såsom induktion av superovulation och embryoöverföring.
Introduction
Knock-in-möss, där de avsedda exogena generna introduceras vid målplatsen, används ofta i många in vivo-studier som genhumaniserade möss, fluorescerande reportermöss och Cre-drivmöss 1,2. När knock-in-mutationer induceras genom genomredigering i muszygoter används enkelsträngat DNA (enkelsträngade oligo-DNA-donatorer, ssODN) eller dubbelsträngat DNA (dsDNA) som donator-DNA 2,3. ssODN används främst för att slå in relativt korta genfragment på mindre än 200 bp4. Det är möjligt att knacka in fragment längre än 1 kb DNA med långa ssODN (lsODN)5,6, men deras förberedelse är tidskrävande. När dsDNA-donatorer används kan genkassettmöss (>1 kb) genereras utan mödosam donator-DNA-beredning7.
Den främsta fördelen med att använda ssODN är att elektroporering8 kan generera knock-in möss. DSDNA-donatorer måste dock införas direkt i kärnan genom zygotmikroinjektion. Samtidig knock-in på två platser krävs för att skapa floxed möss, där varje loxP-sekvens slås in uppströms och nedströms målgenen. Det finns två sätt att generera floxade möss genom genomredigering i muszygoter - med hjälp av två oberoende ssODN, var och en med en enda loxP-plats, eller med en enda dsDNA (eller lsDNA) med en floxed sekvens; Den förra är mycket ineffektiv 9,10,11. Genomredigering med dsDNA-donatorer är det enklaste sättet att producera genkassettknock-in och floxade möss om miljön bidrar till zygotmikroinjektion.
Initialt används blandningar av Cas9 mRNA och sgRNA eller DNA-vektorer som kodar för sgRNA och Cas9 för genomredigering i muszygoter12,13. Eftersom högkvalitativa och stabila Cas9-proteiner nu finns tillgängliga till en låg kostnad har införandet av crRNA-tracrRNA-Cas9-ribonukleoprotein (RNP) i muszygoter14 blivit populärt. Nyligen har knock-in-möss genererats med hög effektivitet genom att införa crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP och donator-DNA i båda pronuclei av muszygoter i en cellcykelfas där knock-in sannolikt kommer att inträffa15. Därför beskriver detta protokoll tekniker för att producera olika typer av knock-in-möss med denna metod.
Det finns många användbara inavlade stammar av laboratoriemöss16. Genetisk modifiering inom den inavlade bakgrunden kan bortse från den genetiska bakgrundens påverkan på fenotypen. Denna artikel beskriver en metod för att inducera genkassettknock-in och floxed mutationer i zygoten av den vanligaste inavlade muslinjen, C57BL / 6J17. Vidare diskuteras tidslinjen för generering av genetiskt modifierade möss och de perifera tekniker som används, inklusive induktion av superovulation och embryoöverföring.
Protocol
Alla djurförsök utfördes humant med godkännande från den institutionella djurförsökskommittén vid universitetet i Tsukuba, enligt reglerna för djurförsök vid universitetet i Tsukuba och de grundläggande riktlinjerna för korrekt genomförande av djurförsök och relaterad verksamhet i akademiska forskningsinstitutioner under utbildningsministeriets jurisdiktion, Kultur, sport, vetenskap och teknik i Japan. C57BL/6J-möss av båda könen, 10-25 veckor gamla, användes som zygotdonator. ICR-möss (äldre än 10 veckor) användes som mottagarmöss. Mössen erhölls från kommersiella källor (se Materialförteckning).
1. Bekräftelse av crRNA-klyvningsaktivitet i ett cellfritt system
- Lös 2 nmol crRNA (torrt) och 20 nmol tracrRNA (torrt) i 25 μl respektive 250 μl RNasfritt vatten (se materialtabell).
OBS: CRISPR-målsekvenser som förutspåddes ha hög klyvningsaktivitet och så få off-targets som möjligt väljs med CRISPOR (se materialtabell). Vid genkassettknock-in, rikta sekvensen över insättningsstället. Exon(erna) som skulle floxas valdes med hjälp av KOnezumi (se Materialförteckning). - Förstärk DNA-fragmentet (ca 0,5-1 kb) som innehåller målplatsen med genomisk PCR9. Rena denna PCR-amplikon med det vanliga PCR-produktextraktionssatsen (se materialförteckning).
- Bered 10 μL CRISPR-blandning (100 ng/μL crRNA, 150 ng/μL tracrRNA och 1 ng/μL Cas9 i Cas9-nukleasreaktionsbufferten, se materialtabell). För att konstruera CRISPR-Cas9-komplexet, placera CRISPR-blandningen i ett värmeblock vid 37 ° C i 30 minuter.
- Tillsätt den totala volymen (10 μl) CRISPR-blandning till PCR-produkten (10 μl, 20 ng/μl) som beskrivs i steg 1.2 och inkubera vid 37 °C i 1 timme. Tillsätt 1 μl RNas (500 ng/μl) för att bryta ned crRNA och tracrRNA vid 37 °C i 30 minuter, eftersom RNA måste saknas under elektroforesen. Utför elektrofores av ovanstående prover med användning av laddningsfärgämne innehållande natriumdodecylsulfat (2% vikt/volym).
OBS: I sällsynta fall observeras crRNA utan klyvningsaktivitet. I sådana fall rekommenderas att omforma genomredigeringsdesignen.
2. Beredning av blandningen av crRNA, tracrRNA, Cas9-protein och donator-DNA för zygotmikroinjektion
- Bered CRISPR-lösning (50 ng/μL crRNA, 200 ng/μL tracrRNA och 200 ng/μL Cas9 i RNasfritt vatten). Bered en donator-DNA-lösning (20 ng/μl självkonstruerad plasmid-DNA-vektor).
- Filtrera donatorns DNA-lösning genom ett sterilt sprutfilter med en porstorlek på 0,22 μm. Blanda lika stora volymer CRISPR-lösning och filtrerad donator-DNA-lösning. Se till att den slutliga koncentrationen av var och en är 25 ng / μL crRNA, 100 ng / μL tracrRNA, 100 ng / μL Cas9 och 10 ng / μL donator-DNA. Denna blandning kallas nedan RNPD.
OBS: Vid skärning av två platser, såsom under produktion av floxade möss, måste koncentrationen av varje crRNA vara 25 ng / μL. Donator-DNA är ett cirkulärt plasmid-DNA och kan renas med ett vanligt mini-prep spin column-kit (se materialförteckning). Den beredda lösningen måste placeras på is och användas för mikroinjektion så snart som möjligt.
- Filtrera donatorns DNA-lösning genom ett sterilt sprutfilter med en porstorlek på 0,22 μm. Blanda lika stora volymer CRISPR-lösning och filtrerad donator-DNA-lösning. Se till att den slutliga koncentrationen av var och en är 25 ng / μL crRNA, 100 ng / μL tracrRNA, 100 ng / μL Cas9 och 10 ng / μL donator-DNA. Denna blandning kallas nedan RNPD.
3. Skaffa mösszygoter genom naturlig parning
- Injicera 5 IE dräktigt stos serumgonadotropin (PMSG, se Materialförteckning) subkutant i C57BL/6J honmöss (10-25 veckor gamla) 3 dagar före mikroinjektion. Cirka 46-48 timmar senare, administrera 5 IE humant koriongonadotropin (hCG, se Materialtabell) intraperitonealt. Samhysa de PMSG- och hCG-behandlade honmössen med manliga C57BL / 6J-möss och kontrollera vaginalpluggarna följande morgon.
OBS: Cirka 15-25 zygoter kan erhållas från en kvinnlig C57BL / 6J-mus. Tidslinjen visas i figur 1. - Förbered två 35 mm petriskålar för zygotkultur, som visas i figur 2. Placera dem i inkubatorn (37 °C, 5%CO2) tills de används. Dessa kan lagras över natten.
- Avliva honmössen med bekräftade vaginala pluggar genom cervikal dislokation och, med hjälp av en liten sax, skära genom bukhuden och muskelskiktet från mittlinjen i underlivet till under revbenen.
OBS: Följ lokala djurförsöksetiska kommittéers rekommendationer för avlivning. - Samla upp äggledarna och placera dem i en 20 μl droppe M2-medium innehållande 0,75 mg/ml hyaluronidas (se materialtabell) på locket på petriskålen. Plocka upp en ovidukt med pincett med fin spets och perfusera ca 50 μL M2-medium med hyaluronidas genom fimbrierna.
OBS: Vid denna tidpunkt är zygoterna löst omgivna av många cumulusceller. - Efter 30 s, plocka upp morfologiskt normala zygoter med en liten mängd medium med hjälp av en glaskapillär och tvätta dem genom att överföra dem till färska M16-medeldroppar. Överför de tvättade zygoterna till en petriskål (figur 2) för poolning.
OBS: Tidslinjen visas i figur 1. Morfologiskt normala zygoter har en manlig och kvinnlig prokärna och två polära kroppar som inte allvarligt har äventyrat den sfäriska formen15. Zygotens morfologi varierar avsevärt mellan stammar och arter. - Upprepa steg 3.3 och 3.4 tills alla zygoter har hämtats. Cirka 100 zygoter kan samlas i en M16-droppe i odlingsskålen. Förvara skålen i inkubatorn (37 °C, 5%CO2) tills mikroinjektion.
4. Beredning av mikroinjektionsnålen
- Dra några glaspipetter med den programmerbara pipettavdragaren (se Materialförteckning).
OBS: Mikroinjektionsnålar måste ha en tunn spets och lång avsmalning. Om dragaren har ett program för att göra nålar för intracytoplasmatisk spermieinjektion, kan samma program användas för att göra nålar för mikroinjektion. - Bryt spetsen på mikroinjektionsnålen genom att slå på glaskulan som är fäst vid mikrosmidesspetsen. Se till att mikroinjektionsnålens spetsstorlek är cirka 1 μm i diameter. Kontrollera spetsstorleken under ett mikroskop vid 1000x förstoring.
- Böj mikroinjektionsnålen ca 2-3 mm från spetsen med en mikrosmedja.
OBS: Böjningsvinkeln beror på mikromanipulatorns inställning. För mycket böjning minskar piezopulsens effektivitet.
5. Zygot mikroinjektion
- Injicera 1-1,5 cm av operationsvätskan (tröghetskropp som behövs för piezoeffekten för att göra hål som ett alternativ till kvicksilver, se materialtabell) i mitten av mikroinjektionsnålen och fäst den på den manuella mikroinjektorhållaren med piezoställdonet.
- Fäst dessutom hållnålen på den motsatta manuella mikroinjektorhållaren. Flytta operationsvätskan till mikroinjektionsnålspetsen med gradvis tryck. Fixa båda de manuella mikroinjektorhållarna på mikromanipulatorn.
OBS: Operationsvätskan som kommer ut ur spetsen på mikroinjektionsnålen kan observeras under ett mikroskop vid 50x förstoring. Efter justering av mängden vätska som emitteras kan vätskestänk observeras när piezopulserna appliceras, vilket bekräftar att piezopulserna är effektiva. Om detta inte kan bekräftas, förbered mikroinjektionsnålen igen.
- Fäst dessutom hållnålen på den motsatta manuella mikroinjektorhållaren. Flytta operationsvätskan till mikroinjektionsnålspetsen med gradvis tryck. Fixa båda de manuella mikroinjektorhållarna på mikromanipulatorn.
- Bered en injektionskammare med tre droppar: (1) 10 μL M2-medium; (2) 5 μL 12% polyvinylpyrrolidon (PVP) i M2-medium; och (3) en 5 μL blandning av crRNA, tracrRNA, Cas9-protein och donator-DNA-lösningen (RNPD). Täck dropparna med mineralolja på samma sätt som steg 3.2 och sätt injektionskammaren på det inverterade mikroskopsteget.
- Under det inverterade mikroskopet vid en 50x förstoring, sänk mikroinjektionspipetten i 12% PVP-droppen. Aspirera och dosera 12% PVP för att rengöra insidan av mikroinjektionsnålspetsen och överför den till RNPD-droppen.
- Sätt den manuella mikroinjektorn under negativt tryck och sug upp RNPD-lösningen i mikroinjektionsnålen. Vänta några minuter tills en tillräcklig volym aspireras; Under ett mikroskop förstorat 50x, fyll hela insidan av mikroinjektionsnålen med vätska.
- Stoppa intaget och låt RNPD-lösningen avlägsnas gradvis genom att ställa in den manuella mikroinjektorn på övertryck. Flytta spetsen på mikroinjektionsnålen in i oljan.
OBS: Vrid ratten på den manuella mikroinjektorn moturs för inandning. För att stoppa inandningen, vrid ratten medurs och öka gradvis trycket medan du observerar under ett mikroskop. RNPD-lösningen kommer gradvis att tömmas. Vätskenivårörelse i mikroinjektionsnålen möjliggör bekräftelse av utflödet.
- Stoppa intaget och låt RNPD-lösningen avlägsnas gradvis genom att ställa in den manuella mikroinjektorn på övertryck. Flytta spetsen på mikroinjektionsnålen in i oljan.
- Lägg 50 zygoter i M2-droppen och sänk försiktigt hållpipetten i samma droppe. Överför mikroinjektionsnålen till M2-droppen som innehåller zygoter. Byt till ett 20x-mål och fokusera på spetsen på mikroinjektionspipetten.
OBS: Sätt så många zygoter som kan injiceras på 10 minuter. - Håll en zygot och fokusera på pronucleus genom att flytta mikromanipulatorn. Sätt in mikroinjektionsnålen i zygoten och bringa spetsen nära pronucleus. När spetsen når pronucleusmembranet, applicera piezopulsen (intensitet: 6-10, hastighet: 1) för att genomborra.
- När mikroinjektionsnålen punkterar pronucleus, injicera RNPD-lösningen och observera svullnaden i pronucleus. När pronucleus är helt uppblåst, dra snabbt ut nålen. Utför samma procedur på både kvinnliga och manliga pronuclei.
OBS: Inflationen av prokärnan genom injektion kan tydligt ses under mikroskopet. Graden av denna inflation är svår att verbalisera men kan bekräftas genom att hänvisa till tidigare rapporter15.
- När mikroinjektionsnålen punkterar pronucleus, injicera RNPD-lösningen och observera svullnaden i pronucleus. När pronucleus är helt uppblåst, dra snabbt ut nålen. Utför samma procedur på både kvinnliga och manliga pronuclei.
- Flytta den injicerade zygoten till en annan plats i M2-droppen för att identifiera zygoterna före och efter injektionen.
- Upprepa steg 5.5-5.6 tills alla zygoter i M2-droppen har injicerats. Efter injektionen, överför zygoterna till en ny M16-skål.
- Välj de överlevda zygoterna 10 min efter injektionen. Ta bort de lyserade zygoterna som skadats av injektionen och fördela överlevande zygoter till varje droppe i M16-skålen. Varje droppe måste innehålla 20-24 zygoter för en pseudogravid kvinna. Detta minskar tiden M16-skålen utsätts för miljön utanför inkubatorn under embryoöverföring.
OBS: Under optimala injektionsförhållanden är överlevnaden 90% -95%. Detta beror på nålspetsens storlek, piezopulsens styrka och RNPD-lösningens utflödestryck.
6. Embryoöverföring till äggledaren
- För att erhålla pseudogravida möss, para varje kvinnlig ICR-mus i proestrusfasen med en vasoligerad manlig ICR-mus. Kontrollera pluggarna följande dag.
OBS: Cirka 15 pseudogravida möss erhålls från 20 parande par. - Administrera tre typer av blandade anestesimedel (0,2 mg/kg medetomidin, 4,0 mg/kg midazolam och 2,5 mg/kg butorfanol, se Materialförteckning) subkutant till pseudogravida honmöss. Bekräfta lämplig anestesi genom en minskning av andningsfrekvensen och försvinnande av svansklämman och bakbenspedalens abstinensreflexer. Applicera oftalmisk salva för att smörja ögonen enligt lokala djurförsöksetiska kommittéers rekommendationer.
- Efter rakhyvelrakning av musens dorsala region i benägen position och desinficering av operationsområdet tre gånger, alternerande mellan en jod- eller klorhexidinbaserad skrubb och alkohol, skär dorsalhuden ca 1 cm längs ryggraden med en liten dissekerande sax.
- Flytta dorsala snittet såret till ena sidan ventralt, snitta muskelskiktet genom vilket äggstocken kan ses, ta tag i fettet ovanför äggstocken med pincett och dra tillbaka äggstocken, äggledaren och livmodern.
- Säkra fettet med en serraffineringsklämma (se Materialförteckning). Placera reproduktionsvävnaderna på steril gasbindning för att undvika direktkontakt med pälsen.
- I följande ordning, placera en liten mängd odlingsmedium (M2 eller M16), några luftbubblor som markör och zygoterna i en pipett för överföring.
OBS: Överför cirka 10-12 zygoter per ovidukt. - Gör ett snitt med en mikroskjuvning (se materialtabell) mellan oviduktens ampulla och fimbrier (bara tillräckligt länge för att glaspipetten ska kunna komma in), införa zygoterna i snittet och bekräfta samtidigt att luftbubblan har införts.
- Utför implantationen i den andra äggledaren på samma sätt (steg 6.6).
- Suturera det yttre skalet med autoclips (se Materialförteckning).
OBS: Suturera inte det snittade muskelskiktet om inte snittsåret är oundvikligen stort. Den ideala storleken på det snittade muskelskiktet bör vara mindre än 2-3 mm. Om snittet är större än 5 mm ska muskelskiktet sys med en steriliserad suturnål och tråd (se materialförteckning).
7. Återhämtning av djur
- Administrera atipamezolhydroklorid (0,3 mg/kg) subkutant till möss.
OBS: Följ lokala djurförsöksetiska kommittéers rekommendationer för postoperativ analgesi. - Placera sedan mössen i burar och håll dem varma på en värmeplatta vid 37 °C.
- När mössen har väckts, håll dem varma i ca 2 timmar. Efter att ha bekräftat att mössen inte har onormalt beteende, återför burarna till avelsstället.
Representative Results
Produktionsresultaten för genkassettknock-in och flokade möss som använder detta protokoll visas i tabell 1 och tabell 2. Målgenerna angavs inte eftersom varje genomredigerad muslinje för närvarande används i ett oberoende, opublicerat projekt. Istället beskrevs målkromosomregionerna.
Genotypningsanalyserna utfördes med en tidigare rapporterad metod18. I denna genotypningsmetod räknas inte möss där donator-DNA sätts in i oavsiktliga kromosomala platser som positiva individer, även om den önskade genomredigeringen induceras. Därför visades produktionseffektiviteten hos grundmössen som verkligen är användbara för faktiska ändamål, snarare än effektiviteten hos själva genomredigeringen.
Medianproduktionseffektiviteten för 13 oberoende genkassettknock-in-möss var 20,8%, med högst 39,5% och minst 7,9% (tabell 1). Denna effektivitet ansågs vara tillräckligt praktisk. Eventuella dödliga embryonala gener var inte riktade under genkassettens knock-in. Medianvärdet för födelsetal under detta icke-dödliga målsökande tillstånd var 34,0 % (maximalt 43,3 % och minst 15,9 %). Eftersom detta är jämförbart med födelsetalen vid embryoöverföring utan genetisk manipulation, ansåg vi att toxiciteten hos de införda genomredigeringselementen och den fysiska skadan av zygotmikroinjektion sannolikt inte skulle påverka embryonal utveckling.
Medianproduktionseffektiviteten för de 10 oberoende flokade mössen var 7,7 %, med högst 20,7 % och minst 2,1 % (tabell 2). Även om funktionerna hos flera målgener var okända var medianfödelsetalen 30,2%, med högst 43,8% och minst 17,3%. Denna frekvens var jämförbar med den för genkassettknock-in-möss, vilket tyder på att mikroinjektionsoperationen har en försumbar effekt på den embryonala utvecklingen hos floxade möss.
Figur 1: Tidslinje för zygot mikroinjektion. Vit och mörk färg visar den ljusa respektive mörka cykeln. Mössen hölls under en 14 h ljus/10 h mörk cykel. PMSG: dräktigt stos serumgonadotropin; hCG: humant koriongonadotropin Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Beredning av kulturrätter . (A) Odlingsskål för zygoterna före injektionen. Lägg två droppar M16-medium (20-25 μL för varje) i en 35 mm petriskål av plast. (B) Odlingsskål för zygoterna efter injektionen. Placera 10 droppar (10-20 μL för varje droppe) M16 i en 35 mm petriskål av plast. Droppar är täckta med mineralolja (3 ml). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Riktad kromosomal region | Antal | Längd på infogning (kb) | Homologi armlängd (kb) | ||||||
| Embryon | Nyfödda | Undersökt (avvänjningar) | Knock-in utan rTG | rTGc | |||||
| Injiceras | Överförs | 5' arm | 3' arm | ||||||
| 2qE2 | 349 | 331 | 114 (34,4 %)a | 114 | 9 (7,9 %)b | 5 (4,4 %)d | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 2qE2 | 231 | 215 | 78 (36,3 %)a | 74 | 15 (20,3 %)b | 23 (31,1 %)d | 2.2 | 1.0 | 1.1 |
| 5qG2 | 288 | 262 | 90 (34,4 %)a | 81 | 19 (23,5 %)b | 18 (22,2 %)d | 1.6 | 2.0 | 2.0 |
| 6qB1 | 278 | 259 | 58 (22,4 %)a | 46 | 11 (23,9 %)b | 11 (23,9 %)d | 4.2 | 1.2 | 1.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 295 | 277 | 97 (35,0 %)en | 23 | 2 (8,7 %)b | 4 (17,4 %)d | 6.5 | 1.1 | 3.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 246 | 219 | 87 (39,7 %)a | 83 | 22 (26,5 %)b | 18 (21,7 %)d | 5.8 | 1.1 | 3.0 |
| 7qF5 | 279 | 268 | 116 (43,3 %)a | 114 | 45 (39,5 %)b | 44 (38,6 %)d | 1.4 | 3.1 | 1.0 |
| 11qB4 | 405 | 353 | 56 (15,9 %)a | 47 | 8 (17,0 %)b | 12 (25,5 %)d | 1.7 | 1.0 | 0.8 |
| 11qD | 310 | 294 | 100 (34,4 %)en | 98 | 15 (15,3 %)b | 76 (77,6 %) d | 1.0 | 1.8 | 2.4 |
| 12qE | 368 | 320 | 86 (26,9 %)a | 84 | 12 (14,3 %)b | 19 (22,6 %)d | 3.4 | 1.1 | 1.3 |
| 12qF1 | 315 | 265 | 76 (28,7 %)a | 72 | 17 (23,6 %)b | 28 (38,9 %)d | 1.0 | 1.1 | 1.1 |
| 14qE5 | 256 | 215 | 48 (22,3 %)a | 48 | 11 (22,9 %)b | 21 (43,8 %)d | 3.1 | 1.0 | 0.9 |
| 14qE5 | 287 | 285 | 85 (29,8 %)a | 72 | 15 (20,8 %)b | 19 (26,4 %)d | 2.6 | 1.0 | 0.9 |
Tabell 1: Produktion av knock-in-möss genom mikroinjektion. Tabellen visar födelsetal och effektiviteten hos att producera möss som bär den avsedda knock-in-allelen utan (W/O) slumpmässig integration (rTG) av donator-DNA. Det var möjligt att få möss med den avsedda knock-in-allelen i alla projekt. a: Antal nyfödda/antal överförda embryon. b: Antal knock-in-alleler som burits på möss/antal undersökta möss. c: det är inte säkert om det finns en avsedd allel; d: Antal rTG-alleler som transporteras på möss/antal undersökta möss. rTG: slumpmässig integration av givarvektor. W/O: utan.
| Riktad kromosomal region | Antal | Floxad längd (kb) | Homologi armlängd (kb) | |||||
| Embryon | Nyfödda | Undersökt (avvänjningar) | floxed W / O rTG | |||||
| Injiceras | Överförs | 5' arm | 3' arm | |||||
| 3qC | 325 | 313 | 93 (29,7 %)a | 87 | 9 (10,3 %)b | 1.3 | 1.2 | 1.1 |
| 4qB1 | 210 | 200 | 36 (18,0 %)a | 29 | 6 (20,7 %)b | 1.6 | 1.2 | 0.9 |
| 4qC4 | 272 | 256 | 112 (43,8 %)a | 100 | 5 (5,0 %)b | 2.4 | 1.0 | 1.4 |
| 5qF | 143 | 137 | 40 (29,2 %)a | 40 | 6 (15,0 %)b | 1.8 | 1.0 | 1.1 |
| 5qF | 255 | 227 | 80 (35,2 %)a | 76 | 2 (2,6 %)b | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 9qE3.1 | 289 | 261 | 80 (30,7 %)a | 77 | 9 (11,7 %)b | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| 10qB3 | 284 | 269 | 88 (32,7 %)a | 78 | 3 (3,8 %)b | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 10qC1 | 243 | 231 | 40 (17,3 %)a | 38 | 4 (10,5 %)b | 2.1 | 1.0 | 1.3 |
| 14qE5 | 390 | 372 | 139 (37,4 %)a | 135 | 5 (3,7 %)b | 1.1 | 0.8 | 0.9 |
| 17qA3.3 | 383 | 374 | 99 (26,5 %)a | 95 | 2 (2,1 %)b | 2.1 | 0.6 | 0.8 |
Tabell 2: Produktion av floxade möss genom mikroinjektion. Tabellen visar födelsetal och effektiviteten hos att producera möss som bär den avsedda flexallelen utan (W/O) slumpmässig integration (rTG) av donator-DNA. Det var möjligt att få möss med den avsedda floxallelen i alla projekt. a: Antal nyfödda/antal överförda embryon. B: Antal burna floxalleler/antal undersökta möss. rTG: slumpmässig integration av eller givarvektor. W/O: utan.
Discussion
I den aktuella studien användes färska (inte frysta) C57BL / 6J-muszygoter, erhållna från naturlig parning, för genomredigering av musproduktion. Genom att injicera crRNA-tracrRNA-Cas9 och donator-DNA (RNPD) i båda pronuclei av dessa zygoter i en cellcykelfas där knock-in är mest sannolikt att inträffa, genererades genkassettknock-in och floxed möss med hög födelsetal och tillräcklig genomredigeringseffektivitet. Den aktuella studien stärker utbyggbarheten av SPRINT-CRISPR-metod15, där den säkerställer tillräcklig knock-in-effektivitet även i C57BL/6J genetisk bakgrund, och kan tillämpas på produktion av floxade möss.
Elektroporering är en mycket generaliserad metod för att producera genomredigerade möss på grund av den låga kostnaden för experimentella enheter och lättheten att lära sig tekniken8. Dessutom kräver i-GONAD-metoden19, där genomredigering görs med preimplantatoriska embryon som finns i äggledaren, inte en mottagarmus. Jämfört med dessa metoder är den nuvarande metoden som presenteras här kostsam och tidskrävande när man förbereder och underhåller en experimentell miljö när det gäller både hårdvara och mjukvara. Men när experimentanläggningarna är inrättade kan komplexa genkassettknock-in och floxade möss produceras med endast kommersiellt tillgängliga CRISPR-element (crRNA, tracrRNA och Cas9-protein) och en enkel, liten mängd cirkulär plasmidvektor som ska användas som donator-DNA. Detta innebär att många komplexa genomredigerade muslinjer kan produceras utan att tidskrävande (eller relativt dyra) lsODN 5,6 eller adenoassocierade virusvektorer20 behöver prepareras.
Till skillnad från den ursprungliga SPRINT-CRISPR-metoden15 användes färska (frysta) zygoter. När man får färska zygoter genom naturlig parning kan de tekniska fel ignoreras som kan uppstå under in vitro-befruktning eller frysning och upptining. Dessutom kan embryomanipuleringsprocessen slutföras på ungefär en halv dag (figur 1) enligt det nuvarande tillvägagångssättet. Å andra sidan inkluderar vissa begränsningar av den nuvarande metoden kravet på många hanmöss, den lösa kontrollen av befruktningstidpunkten och den begränsade förmågan att helt förutsäga antalet zygoter för mikroinjektion. Jämfört med den ursprungliga SPRINT-CRISPR-metoden kan denna metod ha högre födelsetal (tabell 1). Trots detta kan man inte dra slutsatsen att den nuvarande metoden är bättre när det gäller födelsetal på grund av skillnaderna i experimentledare, målgener, genetisk bakgrund och tidpunkt för embryobekräftelse.
Som visas i tabell 1 hade ett stort antal möss i de flesta genkassettknock-in-projekten slumpmässiga integrationsalleler. Slumpmässig integration måste elimineras eftersom det kan leda till oavsiktlig störning av endogena gener och ektopiskt uttryck av transgener. Utmaningen för framtiden är att hitta experimentella förhållanden som minskar antalet slumpmässiga integrationshändelser samtidigt som tillräcklig knock-in-effektivitet bibehålls.
Nästan all muszygotgenomredigering med genomredigeringseffektorer som resulterar i DNA-dubbelsträngbrott kommer sannolikt att inducera oavsiktliga mutationer på målplatserna 9,21. Resultaten av dessa oavsiktliga on-target-mutationer beskrivs inte här eftersom vi inte befinner oss i en situation där nästa generation möss kan hanteras för att presentera tydliga bevis på dem. Det bästa sättet att utesluta oron för förvirring orsakad av oavsiktlig mutagenes på målet är att få nästa generation möss genom att para grundare med vildtypsmöss snarare än korsande grundare. I princip är N1-mössen som härrör från detta kors vildtyp (WT) på ena sidan av allelen, så om den avsedda knock-in (KI) allelen detekteras är de WT / KI heterozygota. Därför är mutagenesen på målet inte ett kritiskt problem i laboratoriemusen, som har en relativt snabb livscykel och är ett produktivt djur. Ytterligare förbättringar kommer dock att bli nödvändiga när denna teknik tillämpas på relativt stora däggdjur.
Det har bekräftats att denna teknik kan producera genkassettknock-in-möss i andra inavlade stammar än C57BL/6J, men ett tillräckligt antal projekt är inte säkrade och data är mycket varierande. Av denna anledning ingår inte denna information i den aktuella studien. Man tror att ytterligare studier om detta ämne kommer att behövas för att främja musgenetik och sjukdomsmodellforskning.
Disclosures
Författarna har inte redovisat några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av vetenskaplig forskning (B) (19H03142: till SM), vetenskaplig forskning (A) (20H00444: till FS), vetenskaplig forskning (A) (21H04838: till SM) och vetenskaplig forskning om innovativa områden "Platform of Advanced Animal Model Support" (16H06276: till ST) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om publicering eller manuskriptberedning. Vi är tacksamma mot Ryoichi Mori för hans hjälpsamma diskussion om genomredigeringsdesign.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | - | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | - | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | - | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | - | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | - | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | - | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | - | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | - | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | - |
References
- Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
- Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367 (2020).
- Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759 (2021).
- Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431 (2016).
- Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799 (2015).
- Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507 (2022).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171 (2019).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87 (2015).
- Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653 (2020).
- Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
- Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
- Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
- Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25 (2018).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).
