Summary
Som svar på den alvorlige akutte respiratoriske syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) -pandemien ble det utviklet en laboratorieprotokoll for å teste viral desinfeksjonseffekt av hvitvasking av tøymunnbind, bomullskrubber og dongeribukser. Phi6-viruset (bakteriofag) ble brukt som organisme for å teste desinfeksjonseffekt.
Abstract
Denne protokollen gir et eksempel på en laboratorieprosess for å gjennomføre hvitvaskingsstudier som genererer data om virusdesinfeksjon. Mens protokollen ble utviklet for forskning under koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) pandemi, er den ment å være et rammeverk som kan tilpasses andre virusdesinfeksjonsstudier; Det demonstrerer trinnene for å forberede testviruset, inokulere testmaterialet, vurdere visuelle og integritetsendringer i de vasket elementene på grunn av hvitvaskingsprosessen, og kvantifisere reduksjonen i virusbelastning. I tillegg skisserer protokollen de nødvendige kvalitetskontrollprøvene for å sikre at eksperimentene ikke er partiske av forurensning og målinger / observasjoner som skal registreres for å spore materialintegriteten til personlig verneutstyr (PPE) -elementer etter flere hvitvaskingssykluser. De representative resultatene som presenteres med protokollen, bruker Phi6-bakteriofagen inokulert på bomullsskrubb, denim og bomullsdekkende materialer og indikerer at varmtvannsvaskings- og tørkeprosessen oppnådd over en 3-log (99,9%) reduksjon i virusbelastning for alle prøver (en 3-loggreduksjon er desinfeksjonsmiddelytelsesmetrisk i US Environmental Protection Agency's Product Performance Test Guideline 810.2200). Reduksjonen i virusmengden var jevn på tvers av forskjellige steder på PPE-elementene. Resultatene av denne virusdesinfeksjonseffektivitetstestingsprotokollen skal hjelpe det vitenskapelige samfunnet til å undersøke effektiviteten av hjemmevasking for andre typer testvirus og hvitvaskingsprosedyrer.
Introduction
Koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) -pandemien forårsaket enestående global forsyningskjedeforstyrrelse og førte til en kritisk mangel på mange varer, inkludert viktig personlig verneutstyr (PPE)1,2,3. De i høyrisikoyrker måtte tilpasse seg ved hjelp av anbefalte krisekapasitetsstrategier, og publikum vedtok bruk av ikke-spesialiserte gjenstander som ansiktsbelegg av tøymateriale primært for kildekontroll, men også for å gi noe åndedrettsvern for brukerne. I USA var spesialisert åndedrettsvern (dvs. filtrering av åndedrettsvern (FFR) som N95s) reservert for noen av disse høyrisikoyrkene (f.eks. Helsevesen) under forsyningsmangel4. Da man visste lite om overføring av alvorlig akutt luftveissyndrom coronavirus 2 (SARS-Cov-2), ble også en rekke andre typer klesmaterialer vurdert som barrierebeskyttelse tidlig i pandemien5. Med mangfoldet av stoffer som brukes til brukerbeskyttelse, oppstod spørsmål om bruk, gjenbruk og desinfeksjon / dekontaminering av disse elementene. Mens det i USA var allment akseptert at rutinemessig hvitvasking av ansiktsbelegg og andre klesplagg i hjemmet gjorde virus på disse overflatene ikke-smittsomme, eksisterte det lite data for å validere denne påstanden, og det manglet publiserte laboratorieprotokoller for testing. Formålet med forskningsprotokollen som presenteres her er å gi et eksempel på en laboratorieprosess for gjennomføring av hvitvaskingsstudier som genererer data om virusdesinfeksjon. Mens protokollen ble utviklet for forskning under COVID-19-pandemien, er den ment å være et rammeverk som kan tilpasses andre virusdesinfeksjonsstudier.
Klærnes rolle i sykdomsoverføring er et vanskelig konsept å kvantifisere. International Scientific Forum on Home Hygiene forsøkte denne utfordrende oppgaven ved å gjennomføre en gjennomgang av klærnes rolle i spredningen av smittsomme sykdommer kombinert med en risikovurdering av hjemmehygienepraksis6. Inkludert i dette arbeidet var gjennomgangen av flere vitenskapelige studier som undersøkte overlevelsen av forskjellige virusstammer på forskjellige typer stoffer som ull og bomull 7,8,9,10,11. Hver studie fokuserte på en annen type virus, inkludert vaccinia, poliovirus, respiratorisk syncytialt virus, herpesvirus og influensavirus. Overlevelsestidene for de forskjellige virusene på stoffene varierte fra 30 min til 5 måneder, avhengig av virus-materialkombinasjonen. Flere av studiene viste også overføring av viruskontaminering fra materialet til hendene. Som en del av publikasjonen ble effektiv hvitvasking diskutert som en viktig styringsteknikk for å redusere overføring, men anerkjente at størrelsen på virkningen av hvitvasking på å redusere sykdomsbyrden var avhengig av den spesifikke virusforurensningen og vanskelig å kvantifisere 7,8,9,10,11.
Hvitvaskingsprosessen ødelegger mikroorganismer ved hjelp av kjemiske, fysiske og termiske behandlingsprosesser. For eksempel kan såper og vaskemidler skille jord og kan gi noen kjemisk mediert antimikrobiell virkning. Fysisk kan fortynning og agitasjon hjelpe til med å redusere virusbelastningen. En studie som undersøkte utholdenheten til humant koronavirus HCoV-OC43 på bomullsprøver ved bruk av industrielle og innenlandske vaskesykluser med og uten temperatur og vaskemiddel, fant ikke noe påviselig virus ved vasking i uoppvarmet vann uten vaskemiddel, men at i nærvær av jordbelastning (kunstig spytt) krevde husholdningsvaskesykluser vaskemiddel for prøver å ha ikke-detekterte virusbelastninger12. Varmt vann i seg selv kan også gi et effektivt middel til å ødelegge noen mikroorganismer13,14.
I en nylig publikasjon som oppsummerer tilstanden til dagens vaskeripraksis, ble mange faktorer som stoffsammensetning, lagringsforhold, smussbelastning, vasketemperatur og tid og tørketemperatur identifisert som varierende i global hvitvaskingspraksis15. Mens hvitvasking er en vanlig rengjøringsmetode for en stor andel av befolkningen, gjør denne store variasjonen i eksisterende praksis å utstede detaljert veiledning for hvordan du gjør dette trygt og effektivt, når en vare kan være forurenset av et virus, utfordrende og sparsom. Under COVID-19-pandemien utstedte USAs sentre for sykdomskontroll og forebygging (CDC) veiledning om hvordan man vasker varer for huseiere16,17. Mye av denne hvitvaskingsveiledningen var basert på flere eldre studier om bakteriell desinfeksjon18,19 og støttet av flere benkestudier som har funnet innkapslede virus inaktivert i vann med vaskemidler20,21. Veiledningen kan oppsummeres som 1) følg produsentens instruksjoner for vaskemiddelet, 2) bruk den varmeste passende vanninnstillingen, og 3) tørk gjenstander helt. Begrunnelsen for disse anbefalingene var at vasking på varmest mulig syklus med vaskemiddel kombinert med fullstendig tørking (med varme om mulig) vil drepe SARS-CoV-2-viruset.
Det store antallet mulige variasjoner i hvitvaskingsprosessen nødvendiggjør en enhetlig protokoll, som presentert her, for å kunne isolere variabler og teste virusdesinfeksjonseffekten av spesifikke prosesser. Hensikten med denne protokollen kombinert med en instruksjonsvideo er å demonstrere en laboratoriebasert hvitvaskingsprosess for resirkulering i andre forskningsstudier. I tillegg bør resultatene av denne virusdesinfeksjonseffekttestingen bygge forbrukernes tillit til effektiviteten av hjemmevasking under virusbaserte pandemier.
Protocol
Phi6 ble mottatt fra et samarbeidslaboratorium som en ~1 ml frossen aliquot og ble lagret ved -80 °C til bruk. Det ble opprinnelig brukt til å forplante flere viruslagre som senere ble lagret ved -80 °C til bruk. Phi6 ble valgt som demonstrasjonsvirus fordi det ofte brukes som et modellinnhyllet virus, kan forplantes til høye titere, og krever et lavt biosikkerhetsnivå laboratorium for å utføre testingen22,23,24.
1. Forbered viruslagerløsning
- Forplante bakteriofag Phi6 i bakteriell vert Pseudomonas syringae ved hjelp av en modifisert Tryptic Soy Agar media forberedelse og myk agar overlegg metode som beskrevet nedenfor.
- Forbered modifisert Tryptic Soy Agar ved å veie ut og blande ingrediensene fra tabell 1 i avionisert vann.
- Forbered en nattkultur av P. syringae ved å legge til en 1 ml aliquot av P. syringae med en optisk tetthet (OD 600) mellom 0,9 og 1,5, til 100 ml modifisert tryptisk soyabuljong (tabell 1) og inkubere i en ristende inkubator ved ~ 260 o / min ved romtemperatur (20-26 ° C).
- Forbered myke agarrør ved å plassere modifisert Tryptic Soy Agar (~ 6 ml) i reagensrør og dekke med en autoklaverbar hette. Oppbevares ved 4 °C til bruk. Autoklav myke agarrør ved 121 °C i 15 minutter for å smelte agar. Hold ved 48 °C til plating. Likevekt ved 48 °C er viktig ellers kan viruset inaktiveres i analysen.
- Tilsett 1 ml ufortynnet konsentrert virus aliquot til myk agar og 100 μL av en loggfase (OD600 mellom 0,9 og 1,5) P. syringae kultur. Hell myk agar på overflaten av en størknet 100 mm diameter modifisert Tryptic Soy agar plate. For å forhindre bobler og/eller søl, virvle platene forsiktig for å fordele den myke agaren jevnt over den faste agaroverflaten og ruge over natten ved romtemperatur.
- Skrap forsiktig 25 innholdet i de tre platene med en steril cellespreder i et sterilt 50 ml konisk rør som inneholder15 ml SM-buffer. Vortexrør ved maksimal innstilling i 1-2 minutter for å bryte opp agar og deretter sentrifuge ved 7,000 x g i 15 minutter.
- Fjern supernatant og filtrer gjennom et 0,2 μm sprøytefilter. Oppbevar 1 ml aliquots i cryovials ved -80 °C til bruk.
2. Utfør visuell vurdering av PPE-element før testen
- Plasser hvert PPE-element på en ren, glatt overflate (f.eks. en laboratoriebenk dekket med en engangspapirforing). Vurder hvert PPE-element i tre eksemplarer.
- Sørg for riktig belysning under PPE-undersøkelsen. Mål og registrer lengden og bredden på de uvaskede gjenstandene på forskjellige steder (figur 1).
Figur 1. Målesteder for vurdering av PPE-pretest. Denim-, skrubbe- og ansiktsdekkende steder der lengden ble registrert for å spore vesentlige endringer fra hvitvaskingsprosessen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Forbered kuponger
- Lag 2 cm x 4 cm testkuponger ved å kutte PPE, forberede to kuponger per ansiktsdekning (tre ansiktsbelegg ble testet), fem kuponger per denimbukse (tre denimbukser ble testet) og tre kuponger per skrubbeskjorte (tre skrubber ble testet).
- Forbered et sett med 2 cm x 4 cm prosedyre blanke kuponger (et sett for ett PPE-element i full størrelse) for hver materialtype som ikke vil bli inokulert, men vil bli vasket. Forbered to kuponger for hver dag med ansiktsdekkende eksperimenter, fem kuponger for hver dag med denimeksperimenter og tre kuponger for hver dag med skrubbeeksperimenter.
- Forbered et sett med 2 cm x 4 cm positive kontrollkuponger som vil bli inokulert, men ikke hvitvasket. Forbered to kuponger for hver dag med ansiktsdekkende eksperimenter (tre ansiktsbelegg ble testet), fem kuponger for hver dag med denimeksperimenter (tre denimbukser ble testet) og tre kuponger for hver dag med skrubbeeksperimenter (tre skrubber ble testet) og tre kuponger i rustfritt stål.
MERK: Ulike antall replikasjoner ble valgt basert på størrelsen på elementet. For eksempel er det fysisk vanskelig å feste fem kuponger på munnbindet, og to kuponger vil representere et begrenset område av dongeribuksene. Stedene ble valgt for å maksimere dekningen og i soner som kan bli brettet under hvitvasking og være vanskeligere å rengjøre.
4. Utfør inokulasjon
- Forbered en 10% biffekstraktløsning ved å oppløse 1 g biffekstrakt i et totalt volum på 10 ml 1x fosfatbufret saltvann. Filter steriliser hele volumet ved hjelp av et 0,2 μm sprøytefilter.
- Tine virusstamløsningen tilberedt i avsnitt 1 ved romtemperatur. På bruksdagen tilsettes 100 μL av den tinte Phi6-bestanden til 900 μL av 10% biffekstraktløsningen.
- Inokuler testkuponger og positive kontrollkuponger med ~107 PFU/prøve ved å pipettere en 10 μL dråpe oppløsning på PPE-gjenstanden og spre dråpen ved hjelp av pipettespissen. Avhengig av PPE-materialet, vil dråpene skille seg og reaggregere annerledes.
- La inokulerte kuponger tørke i et biosikkerhetsskap. Bestemt tørr tid (er) via observasjon for dine spesifikke materialer. For resultatene som presenteres her, ble følgende tider brukt: skrubber = 30 min tørr tid; ansiktsdekkende = 60 min tørr tid; denim = 30 min tørr tid; rustfritt stål = 120 min tørr tid.
- Fest inokulerte kuponger til PPE-varer i full størrelse i henhold til figur 2 ved hjelp av sikkerhetsnåler og aseptiske teknikker.
Figur 2. Test kupongplasseringer på denim, skrubber og ansiktsbelegg. Bokstavene A-D tilsvarer de unike kupongidentifikatorene for alle hvitvaskingseksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. Utfør hvitvasking
- Forbered vaskemiddel som følger.
- Steriliser vann fra springen som skal brukes i vaskemaskinen og samle 10 ml autoklavert vann for en sterilitetskontroll. For denne protokollen, autoklav 7 L vann fra springen på en 60 min væskesyklus.
- Forbered hvitvaskingsløsning i henhold til produsentens fortynningsanvisninger. For denne protokollen oppløses 1,54 ml vaskemiddel i 3,5 liter sterilt vann fra springen. Varm vaskeløsningen til 50 °C med kokeplate og røre. Mål og registrer pH og temperatur i vaskeløsningen. Samle 10 ml oppløsning for sterilitetskontroll.
- Hell hvitvaskingsløsningen i en sterilisert vaskemaskin (3,25 L). Pre-steriliser skiver ved hjelp av en 250 ppm-4 timers syklus av dampholdig hydrogenperoksid mellom tester.
- Plasser PPE-element (er) i en sterilisert vaskemaskin. Legg til en denimbukse og en skrubbeskjorte per vaskemaskin. Legg til ett inokulert munnbind og fire ikke-forurensede fyllmasker per vaskemaskin; Fyllmasker hadde ikke kuponger vedlagt.
- Vask PPE-element i 18 min (to 9 min vaskesykluser med normal omrøring). Tøm vaskemaskinen og skyll tre ganger med romtemperert vann fra springen (5 l hver gang) for å fjerne skum. Tilsett romtemperatur sterilisert vann fra springen i vaskemaskinen (3,25 L) og utfør en 9 minutter lang skyllesyklus.
- Flytt PPE-gjenstanden(e) til vaskemaskinens spinnside og sentrifuger i 5 minutter. Flytt PPE-gjenstanden(e) til tørketrommelen og tørk i 80 minutter ved høy varmeinnstilling (93 °C).
- Flytt PPE fra tørketrommel til sterilt arbeidsområde og fjern kupongene aseptisk fra hvert element og legg dem i koniske rør. Fyll rørene på nytt med 10 ml 10 % Dey-Engley buljongekstraksjonsbuffer og dekk til med aluminiumsfolie.
6. Trekk ut og oppsummer virusbelastninger på kuponger
- Trekk ut kuponger i 10 ml 10% Dey-Engley nøytraliserende kjøttkraft ved å vortexing i 2 minutter ved maksimal innstilling av utstyret ditt.
- Plateekstrakter ved hjelp av en konvensjonell myk topp agaroverleggsmetode26.
- Klargjør rør av myk modifisert Tryptic Soy Agar og en P. syringae kultur som beskrevet i avsnitt 1. På testdagen autoklaver du de myke agarrørene ved 121 °C i 15 minutter for å smelte agaren. Hold den myke agaren ved 48 °C til den er plettert. Likevekt ved 48 °C er viktig ellers kan viruset inaktiveres termisk i analysen.
- Forbered en ti ganger fortynningsserie i 1x fosfatbufret saltvann for hver testprøve som ble brukt i hvitvaskingsstudien. Bruk både serielt fortynnede (100 μL) og ufortynnede (1 ml og 100 μL) aliquots for plating.
- Tilsett testprøvealiquoter til det myke agarrøret som inneholder 6 ml myk agar og 100 μL av loggfasen P. syringae-kultur (OD600 mellom 0,9-1,5). Hell den myke agar på overflaten av en størknet modifisert Tryptic Soy agar plate. Fordel den myke agaren jevnt over den faste agaroverflaten ved å virvle platen.
- Inkuber plater over natten ved romtemperatur og oppsummer manuelt neste dag ved å telle plakkdannende enheter på hver plate.
7. Utfør visuell vurdering etter test av PPE-element (er)
- Dokumenter følgende i de forskjellige PPE-elementene som brukes til testing: tegn på falming, misfarging og / eller skade (f.eks. rive, strekke seg); Lukt; små hull, kutt eller tårer (bruk en liten lommelykt for å se etter skade); separasjon av lag, manglende tråder, områder der bindingen er skadet; skade på sømmer eller glidelåser; måle og registrere strekkingen av elastikk.
Representative Results
Flere forskjellige typer kvalitetskontrolldata og resultater genereres etter fullføring av denne protokollen. Plakkdannende enhet (PFU) platetall sammen med det ekstraherte prøvevolumet gjør det mulig å beregne antall PFU per testkupong. Tabell 2 er et eksempel på et dataregistreringsark for serielle fortynnings-/pletteringsresultater. Ved bruk av fortynningsfaktor, prøvevolum og platetall fra tabell 1, viser tabell 3 representative virale restitusjonsresultater for en ansiktsdekkende test. Merk at disse dataene inkluderer testkuponger og kvalitetskontrollprøver for inokulum, kuponger og vaskevann (med og uten vaskemiddel). De prosessuelle blanke og sterile kvalitetskontrollprøvene er viktige for å bekrefte at vannløsningene og PPE-materialene ikke var forurenset med Phi6. Indikasjon på forurensning vil føre til feilaktige beregninger av desinfeksjonseffekt og kreve at testen gjentas. De positive kontrollprøvene er ment å verifisere at virusstamløsningen ikke ble miljømessig/naturlig nedbrutt under forsøkene, og dermed blåse opp effekten av hvitvaskingsprosessen i virusmengdereduksjon. Disse prøvene bør forbli innenfor 1 log PFU fra inokulumkontrollene for å godta testkupongresultatene. En stor reduksjon i PFU av de positive kontrollprøvene indikerer også at alle trinnene i kuponginokulasjonen bør gjennomgås nøye for å sikre at analytikeren utfører protokollen med riktig pipetterings- og spredningsteknikker.
Denne protokollen gir også informasjon for å vurdere endringer i materialegenskapene til klesplagg på grunn av hvitvasking og kvalitetskontrollinformasjon knyttet til protokollen (tabell 4 og figur 3). Disse dataene er nyttige av flere grunner. Registrering av trender i målinger av PPE-varene gjør det mulig å identifisere en vare med en produksjonsfeil. Denne identifikasjonen kan bidra til å forklare outlier mikrobielle data og kontekstualisere variasjonen i produktadferd. Å ta notater av lukt eller skade kan også gi en indikasjon på om vaskemaskinen eller tørketrommelen fungerte suboptimalt under et eksperiment, og om testene skal gjentas eller utstyret vedlikeholdes. I tillegg, hvis testplanen krever flere hvitvaskingssykluser av samme PPE-vare, kan dataene bidra til å bestemme hvor lenge PPE-elementene opprettholder sin integritet for bruk ved vasking. Å holde oversikt over pH-verdien til vaskemiddelløsningen gir et varsel om endringer i vannkilden eller vaskemiddelproduktet. Ved å opprettholde en tidslogg over hvitvaskingstrinnene sikrer du at tidtakeren på vaskemaskinen og tørketrommelen ikke forårsaker variasjoner i den eksperimentelle protokollen.
Til syvende og sist brukes disse dataene til å rapportere desinfeksjonseffekten av hvitvaskingsprosedyren for varmt vann mot et surrogat for virale patogener. Hvitvaskingsdesinfeksjonseffekt (Eqn. 1) beregnes ved subtraksjon av gjennomsnittlig log 10-virusgjenoppretting fra PPE-testkupong fra gjennomsnittlig log10-virusgjenoppretting fra PPE-positive kontrollresultater (figur 4). For testkupongresultater som ikke er detektert, brukes logg10 av deteksjonsgrensen i beregningen av desinfeksjonseffektivitet. Det er vanlig å rapportere desinfeksjonseffekt som loggverdier for sammenligning med andre virusdesinfeksjonsteknikker og standarder.
Desinfeksjonseffekt = Gjennomsnittlig logg 10 (Positive kontroller) - Gjennomsnittlig logg10 (Testkuponger) (Eqn. 1)
Figur 3. Endring i PPE-dimensjoner etter plassering. Δ = Pre-test måling - post-test måling. En negativ Δ-verdi tilsvarer strekkingen av varen på den angitte plasseringen, og en positiv verdi tilsvarer krymping. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Effekt av hvitvasking av varmt vann ved desinfisering av munnbind, denim og skrubbe PPE-materialer fra Phi6. Stjerner betegner full desinfeksjon skjedde (ikke detekterer på testkupongene). Feilfelt angir standardavvik (n = 3). Plasseringsbokstaver tilsvarer plasseringen som er avbildet i figur 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Løsning oppskrifter. Ingredienser og mengder som er nødvendige for å tilberede tryptisk soyaagar, tryptisk soyabuljong og biffekstraktløsninger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2. Et eksempel del av en seriell fortynning / plating resultatark. Mal for rapportering av rå mikrobielle data. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3. Ansiktsdekkende mikrobielle resultater. Eksempel på sammendragsark for bearbeidede plakkdannende enhetsdata (PFU). Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 4. Skrubber kvalitetskontroll og materialvurderingslogg. Mal for rapportering av kalibrering av pH-sonde, pH i vaskemiddelløsning, målinger før og etter vask og hvitvaskingssyklustider. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
Denne protokollen ble utviklet for å utføre systematisk laboratorietesting for å vurdere hvitvaskingseffektiviteten av virusdesinfeksjon fra PPE/klesplagg i full størrelse. Prosedyrene skisserer de kritiske trinnene for å forberede viruset, inokulere testmaterialet, vurdere endringene i elementene på grunn av hvitvaskingsprosessen og kvantifisere reduksjonen i virusbelastning som følge av hvitvasking (maskinvask og tørking) -prosessen. I tillegg skisserer protokollen de nødvendige kvalitetskontrollprøvene for å sikre at eksperimentene ikke er partiske av forurensning og målinger / observasjoner som skal registreres for å spore materialintegriteten til PPE-elementene etter flere hvitvaskingssykluser. Resultatene ved bruk av Phi6 indikerer at varmtvannsvaskingsprosessen som ble brukt i denne protokollen oppnådde en større enn 3-log reduksjon i virusbelastning for alle prøver (ansiktsdekning, skrubber og denimbukser). Virusbelastningsreduksjonen var også jevn på forskjellige steder på PPE / klesplaggene. For å demonstrere 3-log reduksjon krever denne protokollen bruk av høy virusbelastning og et stabiliseringsmiddel (biffekstrakt) som kanskje ikke er representativt for jordbelastningen for alle situasjoner.
Minivaskere og kompakte tørketromler ble valgt for å optimalisere antall replikeringseksperimenter som kunne utføres i en plassbegrenset setting og for å holde sterilisering av utstyr og vannvolum som ble brukt under forsøkene håndterbare for laboratoriepersonalet. Som et resultat av bruk av minivaskemaskinen ble skylletrinnene manuelle sammenlignet med de fleste applikasjoner for hvitvasking av hjemmet som er helautomatiserte. Det er også viktig å huske at maskinvask dominerer i utviklede land, men håndvask praktiseres fortsatt over hele verden15. I tillegg kan det hende at noen ikke har tilgang til varmt vann for vask, og andre lufttørker klær manuelt i stedet for maskintørking. Disse forskjellene i hvitvaskingspraksis ble ikke adressert i denne nåværende protokollen, men kan lett undersøkes med mindre modifikasjoner som å erstatte vaske- og tørketrinnene med å bruke en bøtte og en nær linje
Det har vært minimalt fokus på rengjøring/desinfisering av virusforurensede munnbind og gateklær i den vitenskapelige litteraturen i full skala. Mer vanlig er det at studier vurderer filtreringsytelsen til munnbind etter gjentatt vask og tørking, men evaluerer ikke effekten av virusdesinfeksjon27,28. For eksempel evaluerte Clapp og medarbeidere montert filtreringseffektivitet av tøymasker og modifiserte prosedyremasker og fant stor variasjon i ytelse, med enkle modifikasjoner som gir økt passform og filtreringseffektivitet29. En annen studie så på filtreringseffektiviteten til fire klutmasker av forskjellige materialer30, igjen med fokus på kildekontroll eller personlig beskyttelse. Dette kan skyldes manglende spesialisering for både den mikrobielle delen og mekanisk testing i samme laboratorium. Protokollen som presenteres her gir en evaluering av desinfeksjonseffekt samt vesentlig nedbrytning.
Det har vært en rekke dekontaminerings-/desinfeksjonsmetoder for engangs åndedrettsvern (primært N95s) som nylig er publisert i den vitenskapelige litteraturen31,32,33. Hovedfokuset på FFR (f.eks. N95s) skyldes den kritiske åndedrettsbeskyttelsen de gir for helsepersonell og andre frontlinjeyrker. Primære teknologier for respirasjonsdekontaminering involverte fordampet hydrogenperoksid (VHP), ultrafiolett bakteriedrepende stråling (UVGI) og fuktig varme (damp) for virusinaktivering. Viscusi og medarbeidere evaluerte fem dekontamineringsmetoder for FFR og UVGI; etylenoksid og VHP ble funnet å være de mest lovende dekontamineringsmetodene31. Fischer og medarbeidere evaluerte fire forskjellige dekontamineringsmetoder - UV-lys, tørr varme, 70% etanol og VHP - for deres evne til å redusere forurensning med SARS-CoV-2 og deres effekt på N95 respiratorfunksjon32. Det er mange tilleggsstudier om effektive dekontamineringsteknologier for FFR som ble oppsummert og publisert i 202033. Imidlertid er disse spesialiserte metodene ikke tilgjengelige eller designet for å brukes trygt av den gjennomsnittlige hjemme- eller småbedriftseieren.
Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av Phi6, en innhyllet bakteriofag som ligner på SARS-CoV-2, har piggproteiner, og er av tilsvarende størrelse (80-100 nm)34, for all testing. Siden Phi6 ikke er et kjent patogen, kan det manipuleres i et generelt mikrobiologisk biosikkerhetsnivå 1 (BSL-1) laboratorium. Effekt mot Phi6 kan indikere effekten av andre innkapslede virus, men empirisk verifisering for hvert virus av interesse er nødvendig35. Ved å bruke et lignende, ikke-patogent virusmiddel, er det håpet at denne protokollen kan gjentas andre steder og brukes til å studere fremtidige virusepidemier / pandemier. Fremtidig forskning kan omfatte bruk av desinfeksjonsmidler (f.eks. Blekemiddel) i tillegg til vaskemidler og en standardisert protokoll for håndvask og snortørking.
Disclosures
Det er ingen kjente interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Det amerikanske miljøvernbyrået (EPA) gjennom sitt kontor for forskning og utvikling ledet forskningen beskrevet her under EP-C-15-008 med Jacobs Technology Inc. Den er gjennomgått av byrået, men gjenspeiler ikke nødvendigvis byråets synspunkter. Ingen offisiell påtegning bør utledes. EPA støtter ikke kjøp eller salg av kommersielle produkter eller tjenester. Forfatterne vil gjerne takke EPA-entreprenører Denise Aslett for tilsynet med EPA RTP-mikrobiologi, Brian Ford, Rachael Baartmans og Lesley Mendez Sandoval for deres arbeid med dette prosjektet i EPA RTP mikrobiologilaboratoriet, Ramona Sherman for å gi EPA-kvalitetssikringsgjennomgangen, og Worth Calfee og Shannon Serre for å gi EPA tekniske vurderinger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freezer (- 80 °C) | ThermoFisher Scientific | FDE30086FA | |
| Hot Plate | VWR | 97042-714 | |
| Safety Pins (steel) | Singer | 319921 | |
| Shaker | Lab-Line Instruments, Inc. | 3525 | |
| SM buffer | Teknova, Hollister, CA | S0249 | |
| Syringe filter (0.2 μm) | Corning, Corning, NY | PES syringe filters, 431229 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Teknova, Hollister, CA | P0196, 10X PBS solution | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Autoclavable caps | DWK Life Sciences, Millville, NJ | KIM-KAP Caps, 73663-18 | |
| Autoclave | Steris | AMSCO 250LS Steam Sterilizer Model 20VS | |
| Beef Extract | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA | P/N B4888-100g | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 793639 | |
| Cell spreaders | Busse Hospital Disposables | 23600894 | |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004271 | Heraeus MegaFuge 16R Centrifuge |
| Certified Timer | https://nist.time.gov/ | Not Applicable | |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Life Sciences | 352098 | Falcon 50-mL high-clarity polypropylene conical centrifuge tubes |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AY509X33 | |
| Denim | Wrangler | Rustler Regular Fit Straight Leg Jean Four Pocket Jean with Scoop Front Pockets, PN:87619PW | |
| Detergent | Proctor and Gamble | Tide Original Scent Liquid Laundry Detergent Product Number (PN): 003700023068 | |
| Dextrose | Fisher | BP350 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Becton Dickinson | DF0819172 | |
| Dryer | Magic Chef | MCSDRY15W | |
| Face Coverings | Felina | Reusable Organic Cotton Face Masks, PN: 990121P4 | |
| Incubator (top agar) | Symphony | 414004-596 | |
| Laboratory Notebook | Scientific Notebook Company | 2001 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Media sterilization and dispensing system | Integra | Media Clave/Media Jet | |
| Petri Dishes (100 mm) | VWR | 25384-342 | |
| pH Meter | Orion/Oakton | STARA1110/EW-35634-35 | |
| pH Probe | Orion | 8157BNUMD | |
| pH Standards | Oakton | 00654-(00/04/08) | |
| Phi 6 and Pseudomonas syringae | Battelle Memorial Institute, Columbus, OH | Not Applicable | |
| Pipette & Tips | Rainin | (Pipettes) 17014391, 17002921; (Pipette Tips) 30389239, 17014382 | |
| Refrigerator | True Manufacturing Co., Inc. | GDM-33 | |
| Scrubs | Gogreen cool | PN: WS19100PT | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 57656 | |
| Stir Bar | Fisherbrand | 16-800-512 | |
| Tape Measure | Lufkin | PS3425 | |
| Test Tubes for Soft agar (14 mL) | Corning, Corning, NY | 352059 | |
| Thermometer | Fisherbrand | 14-983-19B | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T9410 | |
| Vaporous hydrogen peroxide sterilization bags | STERIS | 62020TW | |
| Vortex (during the plating process) | Daigger Scientific, Inc | 3030A | Vortex Genie 2 |
| Vortex (for sample extraction) | Branson Ultrasonics | 58816-115 | Multi-Tube vortexer |
| Washer | Kuppet | KP1040600A | |
| Washer Sterilization | Steris | STERIS VHP ED1000 generator | |
| Yeast extract | Gibco | 212750 |
References
- Emanuel, E. J., et al. Fair allocation of scarce medical resources in the time of Covid-19. The New England Journal of Medicine. 382 (21), 2049-2055 (2020).
- Cohen, J., van der Meulen Rodgers, Y. Contributing factors to personal protective equipment shortages during the COVID-19 pandemic. Preventive Medicine. 141, 106263 (2020).
- Burki, T. Global shortage of personal protective equipment. The Lancet Infectious Diseases. 20 (7), 785-786 (2020).
- Optimizing Personal Protective Equipment (PPE) Supplies. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/ppe-strategy/index.html (2020).
- Livingston, E., Desai, A., Berkwits, M. Sourcing personal protective equipment during the COVID-19 pandemic. Jama. 323 (19), 1912-1914 (2020).
- Bloomfield, S. F., Exner, M., Signorelli, C., Nath, K. J., Scott, E. A. The infection risks associated with clothing and household linens in home and everyday life settings, and the role of laundry. International Scientific Forum on Home Hygiene. , (2011).
- Hall, C. B., Douglas, R. G., Geiman, J. M. Possible transmission by fomites of respiratory syncytial virus. Journal of Infectious Diseases. 141 (1), 98-102 (1980).
- Turner, R., Shehab, Z., Osborne, K., Hendley, J. O. Shedding and survival of herpes simplex virus from 'fever blisters'. Pediatrics. 70 (4), 547-549 (1982).
- Bean, B., et al. Survival of influenza viruses on environmental surfaces. Journal of Infectious Diseases. 146 (1), 47-51 (1982).
- Brady, M. T., Evans, J., Cuartas, J. Survival and disinfection of parainfluenza viruses on environmental surfaces. American Journal of Infection Control. 18 (1), 18-23 (1990).
- Sidwell, R. W., Dixon, G. J., Mcneil, E. Quantitative studies on fabrics as disseminators of viruses: I. Persistence of vaccinia virus on cotton and wool fabrics. Applied Microbiology. 14 (1), 55-59 (1966).
- Owen, L., Shivkumar, M., Laird, K. The stability of model human coronaviruses on textiles in the environment and during health care laundering. Msphere. 6 (2), 00316-00321 (2021).
- Sehulster, L., et al. Guidelines for environmental infection control in health-care facilities. Recommendations from CDC and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (HICPAC). American Society for Healthcare Engineering/American Hospital Association. , (2004).
- Chen, H., et al. Influence of different inactivation methods on severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 RNA copy number. Journal of Clinical Microbiology. 58 (8), e00958 (2020).
- Abney, S. E., Ijaz, M. K., McKinney, J., Gerba, C. P. Laundry hygiene and odor control-state of the science. Applied and Environmental Microbiology. 87 (14), 0300220 (2021).
- COVID-19 Cleaning and Disinfecting Your Home. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/disinfecting-you-home.html (2021).
- COVID-19 Your Guide to Masks - How to select, properly wear, clean, and store masks. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/about-face-coverings.html (2021).
- Walter, W. G., Schillinger, J. E.
- Blaser, M. J., Smith, P. F., Cody, H. J., Wang, W. -L. L., LaForce, F. M. Killing of fabric-associated bacteria in hospital laundry by low-temperature washing. Journal of Infectious Diseases. 149 (1), 48-57 (1984).
- Gerhardts, A., et al. Testing of the adhesion of herpes simplex virus on textile substrates and its inactivation by household laundry processes. Journal of Biosciences and Medicines. 4 (12), 111 (2016).
- Heinzel, M., Kyas, A., Weide, M., Breves, R., Bockmühl, D. P. Evaluation of the virucidal performance of domestic laundry procedures. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 213 (5), 334-337 (2010).
- Casanova, L. M., Weaver, S. R. Inactivation of an enveloped surrogate virus in human sewage. Environmental Science & Technology Letters. 2 (3), 76-78 (2015).
- Aquino de Carvalho, N., Stachler, E. N., Cimabue, N., Bibby, K. Evaluation of Phi6 persistence and suitability as an enveloped virus surrogate. Environmental Science & Technology. 51 (15), 8692-8700 (2017).
- Ye, Y., Chang, P. H., Hartert, J., Wigginton, K. R. Reactivity of enveloped virus genome, proteins, and lipids with free chlorine and UV254. Environmental Science & Technology. 52 (14), 7698-7708 (2018).
- Bacteriology Culture Guide. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/resources/culture-guides/bacteriology-culture-guide (2022).
- Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Bacteriophages. , Springer. 69-76 (2009).
- Sankhyan, S., et al. Filtration performance of layering masks and face coverings and the reusability of cotton masks after repeated washing and drying. Aerosol and Air Quality Research. 21 (11), 210117 (2021).
- Kumar, A., Bhattacharjee, B., Sangeetha, D., Subramanian, V., Venkatraman, B. Evaluation of filtration effectiveness of various types of facemasks following with different sterilization methods. Journal of Industrial Textiles. , (2021).
- Clapp, P. W., et al. Evaluation of cloth masks and modified procedure masks as personal protective equipment for the public during the COVID-19 pandemic. JAMA Internal Medicine. 181 (4), 463-469 (2021).
- Lu, H., Yao, D., Yip, J., Kan, C. -W., Guo, H. Addressing COVID-19 spread: development of reliable testing system for mask reuse. Aerosol and air quality research. 20 (11), 2309-2317 (2020).
- Viscusi, D. J., Bergman, M. S., Eimer, B. C., Shaffer, R. E. Evaluation of five decontamination methods for filtering facepiece respirators. Annals of Occupational Hygiene. 53 (8), 815-827 (2009).
- Fischer, R. J., et al. Effectiveness of N95 respirator decontamination and reuse against SARS-CoV-2 virus. Emerging Infectious Diseases. 26 (9), 2253 (2020).
- Derraik, J. G., Anderson, W. A., Connelly, E. A., Anderson, Y. C. Rapid review of SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2 viability, susceptibility to treatment, and the disinfection and reuse of PPE, particularly filtering facepiece respirators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (17), 6117 (2020).
- Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T., Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (a surrogate for SARS-CoV-2) in evaporated saliva microdroplets deposited on glass surfaces. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Calfee, M. W., et al. Virucidal efficacy of antimicrobial surface coatings against the enveloped bacteriophage Φ6. Journal of Applied Microbiology. 132 (3), 1813-1824 (2022).
