Summary
迄今为止，甲状旁腺（PG）鉴定方法的发展受到临床前研究中缺乏动物模型的限制。在这里，我们建立了一个简单有效的术中PG成像大鼠模型，并使用氧化铁纳米颗粒作为新型PG造影剂来评估其有效性。
Abstract
甲状旁腺 （PG） 识别是甲状腺切除术中未满足的关键需求。PG的鉴定在甲状腺手术中具有挑战性，因为它的颜色与甲状腺相似。临床前研究中缺乏有效的动物模型是PG鉴定技术发展的严重限制。该协议允许建立用于PG鉴定的简单有效的大鼠模型。在该模型中，黑色氧化铁纳米颗粒（IONPs）被局部注射到甲状腺中，并在甲状腺内迅速扩散，而不是PG。阴性染色的PG和阳性染色的甲状腺可以通过肉眼轻松识别，而无需外部显微镜。PG的位置可以通过增加甲状腺和PG之间的颜色对比度来识别，基于黑色IOP的颜色。该大鼠模型成本低，便于PG鉴定，离子是一种新型PG造影剂。
Introduction
甲状旁腺（PG）是位于人类和其他脊椎动物颈部的椭圆形小内分泌腺，产生和分泌甲状旁腺激素，以调节和平衡血液和骨骼中的钙和磷水平1。人类通常有两对PG位于甲状腺叶后面的不同位置;人类PG的大小通常为6毫米x 4毫米x 2毫米，重量约为35-40毫克2。去除或损坏PG会导致甲状旁腺功能减退症（HP），这是一种内分泌疾病，其特征是低钙血症和甲状旁腺激素水平低或检测不到，可引起从痉挛样痉挛到畸形牙齿到慢性肾脏疾病的各种症状。其中一些并发症是致命的（例如，心力衰竭和癫痫发作）3，4，5;因此，PG对于调节身体的新陈代谢和维持生命至关重要。
HP是颈前路手术后最常见的并发症之一，特别是在甲状腺切除术中，甲状腺癌是一种公认的治疗方法，甲状腺癌是全球最常见的内分泌癌6，7。甲状腺切除术后HP主要是由手术中的直接创伤，缺血或PG切除引起的，因为在手术室中严重缺乏可靠地区分PG与甲状腺叶和其他周围组织（例如淋巴结和外周脂肪颗粒）的能力。2021 年，Barrios 等人报告说，在 1，114 例甲状腺切除术病例中，PG 误产率平均为 22.4%，甚至经验丰富的外科医生的最低错误率为 7.7%8。如此高的PG错误剖析率与其他类似报告一致9，10，11。因此，不正确的甲状旁腺切除术是术后短暂性和永久性HP的独立危险因素。
开发有效的术中PG识别方法是解决这一关键未满足的医疗需求的关键;然而，由于临床前研究中缺乏动物模型，它受到了严重限制。迄今为止，大多数术中PG鉴定研究都是在人类患者和大型动物（例如狗）12上进行的，这些研究昂贵且难以获得伦理批准，扩大受试者数量并重复测试。同时，小鼠是生物学研究中最常用的脊椎动物模型，其PG极小，尺寸小于1毫米13。由于这种限制，小鼠PG模型很少用于术中PG识别研究。
本文报道了为术中PG鉴定研究建立简单、直接、有效的大鼠模型。我们研究了在甲状腺切除术手术中测试PG成像造影剂IOPs的本地Sprague-Dawley（SD）大鼠在没有任何手术修改或基因工程的情况下作为可靠的动物模型的使用。该大鼠模型表现出与人类高度相似的PG和周围微环境的生理结构，并且与小鼠相比，大鼠PG的大小足以在视觉上检测到。大多数大鼠在甲状腺的每一侧都有一个PG。通过在甲状腺切除术中进行术中IONP增强PG成像，已经证明了该大鼠模型的简单性和有效性。
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Protocol
所有动物研究均已获得中国科学院基础医学与癌症研究所机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。 这是一种非生存性手术。
1. 动物
- 使用6-8周大的雌性SD大鼠，重250g，进行术中PG成像。
2. 麻醉
- 打开麻醉机。
- 在开始之前，确保麻醉蒸发器中的异氟醚水平已满。然后，打开氧气并将流速设置为 0.4-0.8 L/min。用3-5%异氟醚诱导麻醉，并保持在2%异氟烷（流速：0.4-0.8升/分钟）。
- 将SD大鼠放入麻醉机的盒子中，选择 通道 模型开始动物麻醉。
- 观察盒子里的老鼠活动。当大鼠陷入昏迷时，将其移至鼻锥以维持麻醉（无意识仰卧位，无疼痛反射和角膜反射）。
- 使用麻醉面罩遮住大鼠的鼻子，并将麻醉机切换到 面罩 模式，以使动物在手术过程中处于麻醉状态。
3. 姿势和固定
- 将麻醉的大鼠转移到手术台上的手术单上。在动物下方放置一个预热的加热垫，以在手术过程中维持动物的体温。
- 用橡皮筋将老鼠的四肢固定在手术台上。将一个由悬垂物制成的圆柱形枕头放在老鼠的肩膀下，使其头向后倾斜，完全露出颈部区域。
- 在大鼠的双眼上涂抹人工泪液软膏，以防止麻醉期间干燥。
4. 脱毛
- 在颈部区域涂抹脱毛膏：向上至下颌下间隙，向下至剑突，两侧至胸锁乳突外侧。
- 3分钟后，用纸巾轻轻擦拭头发和脱毛膏。
5. 灭菌
- 使用碘伏棉球对手术区域从颈部中部到周围区域进行3次消毒。仅对脱毛区域进行消毒。
6. 手术布垫
- 使用手术单覆盖大鼠颈部的手术区域。保持手术单的孔与动物的消毒区域对齐。
7. 切口
- 在切开之前，通过缺乏脚趾夹反射来确认麻醉的手术平面。然后，将刀片放入手术刀中，并使用手术刀在大鼠颈部的前中线做一个纵向切口。确保切口长度约为5厘米，并且仅在真皮中。
8.从颈前肌解剖皮下组织
- 沿着切口两侧提起皮肤。
- 用剪刀沿 白颈线纵向剪裁。
- 用镊子分离胸骨舌骨肌和胸骨肌。
9.将颈部前部肌肉固定在两侧
- 用血管钳将分离的胸舌骨肌和胸骨肌夹在颈部前面，并将夹紧的组织拉出。
- 使用牵开器或针头将缝合线（3-0#）穿过夹紧的组织，打结，并将缝合线固定在手术台的手术布上。
10. 甲状腺定位
- 将甲状腺软骨和环状软骨定位为手术区域的上边界。根据盾形识别甲状腺软骨，根据环形识别环状软骨。
- 将气管定位为操作区域的下边界。根据其管状软骨环形状，寻找颈部前部和中部的气管。
- 在上下边界之间定位甲状腺 - 气管另一侧的蝴蝶形状的红色腺体。
11. PG的视觉识别
- 将PG定位在甲状腺的上侧和外侧。寻找两个长约1.2-2毫米，宽约1.0-1.5毫米的梭形PG，它们红色但比周围的甲状腺轻，有一定的边界。
- 拍摄PG与气管，甲状腺和喉部的正面照片，以定量比较注射前后IONP的效果。
- 解剖食道后部，然后使用牵开器暴露PG的右侧。拍摄带有甲状腺和气管的PG的右侧照片。
- 交换牵开器以暴露PG的另一侧，并用甲状腺和气管拍摄它们的左侧照片。
12. 甲状腺注射 IONP
- 使用胰岛素注射器将 10 μL IOPPS 悬浮液（20 mg/mL 磷酸盐缓冲盐水）局部注射到甲状腺中心。用纱布轻轻按压注射部位5秒。
13. 离子注射后PG的鉴定
- 注射后，观察IOP在甲状腺内的快速扩散，而不是PG，因为它对PG产生负面影响并将它们与周围的甲状腺区分开来。
- 拍摄阴性染色的PG与气管，甲状腺和喉部的正面照片。
- 使用与上述相同的程序拍摄负染色PG的左侧和右侧照片。
14.用甲状腺和PG切除喉咙和气管
- 一旦大鼠吸入过量的异氟醚（5%异氟醚超过5分钟）并处于深度麻醉状态，通过心内注射0.5mL饱和氯化钾溶液对它们实施安乐死。
- 尸检后，切除喉咙、气管、甲状腺和 PG。
- 在通风橱下，将切除的喉咙，气管，甲状腺和PG标本放入4%多聚甲醛溶液中24小时。
15. 组织病理学研究
- 使组织脱水并将它们嵌入石蜡中。切成 5 μm 厚的切片。将切片在37°C的烤箱中烘烤过夜，并在65°C下烘烤1小时。
- 用75%，95%，100%梯度酒精洗涤3 x 5分钟后，用苏木精和伊红（H&E）染色切片，并在室温下水洗。
- 让病理学家在光学显微镜下检查H&E染色的部分。
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Representative Results
在这个动物模型中，我们通过手术切开了SD大鼠的颈部，以暴露气管，喉部和周围组织。然后，甲状腺在视觉上位于气管的两侧;它是蝴蝶形的，尺寸约为 3 毫米 x 5 毫米。一对PG通常位于甲状腺的上部，它们的颜色与甲状腺叶的颜色非常相似，因此用肉眼很难区分它们（图1）。
注射后，造影剂（图1 和 图2）IOPs很容易在甲状腺内扩散并将其染成黑色，但由于其高组织密度而不能浸润PG。PG和甲状腺之间IOP的不平衡分布产生了惊人的对比，肉眼可以很容易地看到，不需要外部仪器。 图2 显示了大鼠左侧甲状腺中被IOPS负染色的PG的代表性图像，其中PG和甲状腺之间的对比度显着，并且确定大鼠PG的大小约为2mm x 1mm。
尸检后，切除大鼠喉部及邻近气管、食道、甲状腺、PG进行组织病理学染色。获得含有PG的组织连续切片以进行H&E染色。这些H&E染色图像（图3）显示PG富含紧密排列的首席细胞，而甲状腺具有许多松散的管腔，表明组织密度要低得多。
图1：PG的生理结构及其微环境。 注射前（A）和离子注射后（B）时人PG和甲状腺的示意图。大鼠前颈部组织的代表性活检图像，包括 PG、甲状腺、气管和喉部在 IONP 注射前 （C） 和注射后 （D）。其他图像已在我们之前的研究15中发表。缩写：PG = 甲状旁腺;离子 = 氧化铁纳米颗粒;IONP10 = 直径为 10 nm 的 IONP;刻度以厘米 （cm） 为单位。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：术中 IONP 增强的 PG 识别。在注射 IONP 之前和之后未经处理的 （A） 和 IONP 注射 （B） 大鼠甲状腺叶的代表性图像。IONPs增强PG鉴定的功效在IONPs注射前（C）和注射后（D）的可重复性方面是一致的。缩写：PG = 甲状旁腺;离子 = 氧化铁纳米颗粒;IONP10 = 直径为 10 nm 的 IONP。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：IOP 注射甲状腺及其微环境的组织学分析 。 （A）注射后大鼠前宫颈组织的代表性 离体 照片。（B）大鼠PG的代表性H&E染色图像。 比例尺= 50μm。 （C）面板 B中红色虚线框的放大图像。比例尺 = 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
我们展示了使用黑色IOPPs的大鼠PG的IOPS引导阴性成像技术，黑色IOPs局部注射在甲状腺中心并在甲状腺内扩散，而不是PG。它可以在没有任何显微镜帮助的情况下用肉眼清晰地识别PG。尽管已经报道了在PG中选择性表达的绿色荧光蛋白的转基因小鼠13，但本文中描述的模型更易于执行。注射后每只大鼠只需~1分钟，肉眼可以观察到甲状腺和PG之间的明显差异。
此外，该模型的另一个优点是，该大鼠模型的成本和操作难度比目前用于评估新的PG鉴定方法的大型动物模型（例如，狗12）低得多。SD大鼠的平均成本接近BALB / C小鼠，比狗便宜30倍以上。大鼠模型的这种低成本优势允许在临床前研究中扩大受试者数量和重复测试，这对于大型动物模型来说是困难的。同时，SD大鼠的典型体重为300-350克，也比狗（22-23公斤）轻66倍以上14。
如此大的体重差异大大降低了大鼠模型与大型动物模型相比的操作难度，因为对狗等大型动物进行甲状腺切除术需要更复杂的麻醉和手术程序，使其更加困难和技术挑战。手术的要求（需要基本的手术技能）对这种模式构成了限制。本研究中使用的IOPs显示出优异的生物安全性和生物降解性，如之前报道的那样15。最终，我们希望这种使用IOPs对大鼠PG进行负成像的方法可以为涉及PG鉴定的临床前研究提供简单有效的动物模型，从而促进新型PG鉴定技术的发展。
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Disclosures
P.G.和W.Z.是中国科学院大学肿瘤医院（浙江省肿瘤医院）基于该项目提交的专利申请的共同发明人。其他作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
本研究得到了国家自然科学基金（NSFC）（82172598）、浙江省自然科学基金（LZ22H310001）、浙江省卫生健康委员会551卫生人才培养项目和中国浙江省医疗卫生科技项目（2021KY110）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alcohol | Li feng | 9400820067 | |
| anesthesia machine | RWD Company | R520IE | Machine number |
| blade | Daopian | TB-JZ-10# | |
| cylindrical pillow | made by ourselves | ||
| depilatory cream | Nair | TMG-001 | |
| electronic scale | Hong xingda | CN-HXD2 | |
| eosin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-2 | |
| erythromycin | Shuang ji (Beijing, China) | 200409 | |
| gauze | Fulanns | YY0331-2006 | |
| heating pad | Johon (ShenZhen,China) | JH-36-2006 | |
| hematoxylin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-1 | |
| insulin injection needle | Jiangyin NanquanMacromolecule | 20170702 | |
| iodophor cotton ball | HOYON | 19-6007 | |
| iron oxide nanoparticle solution | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag9110-05 | |
| isoflurane | Sigma Aldrich (St Louis USA). | 21112801 | |
| needle holder | Meijun | MH0587 | |
| operation table | BioJane | BJ-P-M | |
| paraformaldehyde solution | Biosharp | 21269333 | |
| rubber | G-CLONE | XT41050 |
|
| scanning machine | Olympus | Slideview VS200 | |
| surgical forceps | Suping | SPHC-0676 | |
| surgical knife handle | Aladdin | S3052-06-1EA | |
| surgical retractor | TOCYTO | 18-4010 | |
| surgical scissors | Suping | SPHC-0795 | |
| surgical towel | Along technology | YCKJ-RJ-036205 | |
| suture | Ethicon | SA84G | |
| suture with needle | Jinhuan (Shanghai,China) | F301 | |
| vascular forceps | Along technology | YCKJ-RJ-016218 | |
| Water Bath-Slide Drier | Hua su (Jinhua, China) | HS-1145 |
References
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