Summary
Hittills är utvecklingen av bisköldkörteln (PG) identifieringsmetoder begränsad av bristen på djurmodeller i preklinisk forskning. Här etablerar vi en enkel och effektiv råttmodell för intraoperativ PG-avbildning och utvärderar dess effektivitet genom att använda järnoxidnanopartiklar som ett nytt PG-kontrastmedel.
Abstract
Bisköldkörteln (PG) identifiering är ett kritiskt ouppfyllt behov i tyreoidektomi. Identifieringen av PG är utmanande i sköldkörtelkirurgi eftersom den har samma färg som sköldkörteln. Bristen på effektiva djurmodeller i preklinisk forskning är en allvarlig begränsning för utvecklingen av PG-identifieringstekniker. Detta protokoll möjliggör upprättandet av en enkel och effektiv råttmodell för PG-identifiering. I denna modell injiceras svarta järnoxidnanopartiklar (IONP) lokalt i sköldkörteln och diffunderar snabbt i sköldkörteln men inte PG. En negativt färgad PG och en positivt färgad sköldkörtel kan lätt identifieras med blotta ögat utan att kräva externa mikroskop. PG: s position kan identifieras genom att öka färgkontrasten mellan sköldkörteln och PG, baserat på färgen på de svarta IONP: erna. Denna råttmodell är billig och bekväm för PG-identifiering, och IONP: erna är ett nytt PG-kontrastmedel.
Introduction
Bisköldkörteln (PG) är små, ovalformade endokrina körtlar som ligger i halsen hos människor och andra ryggradsdjur, som producerar och utsöndrar parathormoner för att reglera och balansera kalcium- och fosfornivåer i blodet och i ben1. Människor har vanligtvis två par PG som ligger bakom sköldkörtelloberna på varierande platser; storleken på human PG mäter vanligtvis 6 mm x 4 mm x 2 mm, med en vikt på cirka 35-40 mg2. Avlägsnande eller skada på PG orsakar hypoparatyreoidism (HP), en endokrin störning som kännetecknas av hypokalcemi och låga eller odetekterbara nivåer av parathormoner, vilket orsakar ett brett spektrum av symtom från krampliknande spasmer till missbildade tänder till kroniska njursjukdomar. Några av dessa komplikationer är dödliga (t.ex. hjärtsvikt och krampanfall)3,4,5; Således är PG viktigt för att reglera kroppens ämnesomsättning och upprätthålla livet.
HP är en av de vanligaste komplikationerna efter främre nackkirurgi, särskilt vid tyreoidektomi, en väletablerad botande behandling för sköldkörtelcancer, som är den vanligaste endokrina cancerformen i världen 6,7. Post-tyreoidektomi HP orsakas främst av direkt trauma, ischemi eller avlägsnande av PG vid kirurgi på grund av en allvarlig brist på förmåga att på ett tillförlitligt sätt diskriminera PG från sköldkörtellober och andra omgivande vävnader (t.ex. lymfkörtlar och perifera fettpartiklar) i realtid i operationssalen. År 2021 rapporterade Barrios et al. en genomsnittlig PG-felsektionsfrekvens på 22,4% inom 1 114 tyreoidektomifall, och till och med erfarna kirurger som hade en lägsta felfrekvens på 7,7%8. Sådana höga PG-felsektionsfrekvenser överensstämmer med andra liknande rapporter 9,10,11. Således är felaktig paratyreoidektomi en oberoende riskfaktor för övergående och permanent postoperativ HP.
Att utveckla effektiva intraoperativa PG-identifieringsmetoder är nyckeln till att ta itu med detta kritiska ouppfyllda medicinska behov; Det har dock begränsats kraftigt av bristen på djurmodeller i preklinisk forskning. Hittills har de flesta intraoperativa PG-identifieringsundersökningar utförts på mänskliga patienter och stora djur (t.ex. hundar)12, som är dyra och svåra att få etiskt godkännande, utöka antalet försökspersoner och upprepa tester. Samtidigt har musen, den vanligaste ryggradsdjurmodellen i biologisk forskning, extremt liten PG, med en storlek på mindre än 1 mm13. På grund av denna begränsning har PG-musmodeller sällan använts i intraoperativ PG-identifieringsforskning.
Detta dokument rapporterar upprättandet av en enkel, okomplicerad och effektiv råttmodell för intraoperativa PG-identifieringsstudier. Vi undersökte användningen av inhemska Sprague-Dawley (SD) råttor utan några kirurgiska modifieringar eller genteknik som en pålitlig djurmodell för att testa ett PG-bildkontrastmedel, IONP, i en tyreoidektomioperation. Denna råttmodell visar en mycket liknande fysiologisk struktur av PG och den omgivande mikromiljön som hos människor, och storleken på råtta PG är tillräckligt stor för att detekteras visuellt i jämförelse med möss. De flesta råttor har en PG på varje sida av sköldkörteln. Enkelheten och effektiviteten hos denna råttmodell har demonstrerats genom att utföra intraoperativ IONP-förbättrad PG-avbildning vid tyreoidektomikirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurstudier har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Institute of Basic Medicine and Cancer, Chinese Academy of Sciences. Detta är en icke-överlevnadsoperation.
1. Djur
- Använd en 6-8 veckor gammal kvinnlig SD-råtta, som väger 250 g, för intraoperativ PG-avbildning.
2. Bedövning
- Slå på anestesimaskinen.
- Innan du börjar, se till att isoflurannivån är full i anestesiförångaren. Slå sedan på syret och ställ in flödeshastigheten på 0,4-0,8 l / min. Inducera anestesi med 3-5% isofluran och bibehålla vid 2% isofluran (flödeshastighet: 0,4-0,8 l/min).
- Lägg SD-råttan i lådan på anestesimaskinen och välj kanalmodellen för att påbörja djurbedövning.
- Observera råttaktiviteten i lådan. När råttan faller i koma, flytta den till näskonen för att upprätthålla anestesi (medvetslös ryggläge utan smärtreflex och hornhinnereflex).
- Använd anestesimasken för att täcka råttans näsa och växla anestesimaskinen till maskläge för att hålla djuret under anestesi under operationen.
3. Hållning och fixering
- Överför den bedövade råttan till ett kirurgiskt draperi på ett operationsbord. Placera en förvärmd värmedyna under djuret för att upprätthålla djurets kroppstemperatur under operationen.
- Använd gummiband för att fixera råttans lemmar på operationsbordet. Placera en cylindrisk kudde av draperi under råttans axel för att luta huvudet bakåt och helt exponera nackområdet.
- Applicera konstgjorda tårar salva på båda ögonen på råttan för att förhindra torrhet under anestesi.
4. Hårborttagning
- Applicera hårborttagningskräm på nackområdet: upp till det submandibulära utrymmet, ner till xiphoidprocessen och på båda sidor på utsidan av sternocleidomastoidmuskeln.
- Efter 3 min, torka försiktigt håret och hårborttagningskräm med en vävnad.
5. Sterilisering
- Använd en jodofor bomullstuss för att desinficera operationsområdet 3 gånger från mitten av nacken till omgivningen. Desinficera endast det område från vilket håret togs bort.
6. Kirurgisk drapering
- Använd ett kirurgiskt draperi för att täcka operationsområdet på råttans hals. Håll hålet i det kirurgiska draperiet i linje med djurets desinfektionsområde.
7. Snitt
- Bekräfta det kirurgiska anestesiplanet via brist på en tånypreflex innan du gör snittet. Sätt sedan bladet i skalpellen och använd skalpellen för att göra ett längsgående snitt i den främre mittlinjen på råttans hals. Se till att snittlängden är cirka 5 cm och endast i dermis.
8. Dissektion av subkutan vävnad från den främre livmoderhalsmuskeln
- Lyft huden längs båda sidor av snittet.
- Använd en sax för att klippa längsgående längs linea alba cervicalis.
- Använd pincett för att separera sternohyoidmuskeln och sternothyroidmuskeln.
9. Fäst de främre nackmusklerna på båda sidor
- Använd vaskulära pincett för att klämma fast den separerade sternohyoidmuskeln och sternothyroidmuskeln framför nacken och dra den klämda vävnaden utanför.
- Använd en upprullare eller nålen för att föra suturen (3-0 #) genom den fastspända vävnaden, gör en knut och fixera suturen till operationsbordets kirurgiska drapering.
10. Lokalisering av sköldkörteln
- Leta reda på sköldkörtelbrosk och cricoidbrosk som den övre gränsen i operationsområdet. Identifiera sköldkörtelbrosket baserat på dess sköldform och cricoidbrosket baserat på dess ringform.
- Lokalisera luftstrupen som den nedre gränsen i operationsområdet. Leta efter luftstrupen på framsidan och mitten av nacken, baserat på dess rörformiga broskringform.
- Lokalisera sköldkörteln mellan de övre och nedre gränserna - en röd körtel i form av en fjäril på motsatt sida av luftstrupen.
11. Visuell identifiering av PG
- Leta reda på PG på övre och yttre sidan av sköldkörteln. Leta efter två PG i en fusiform form av ca 1,2-2 mm i längd och 1,0-1,5 mm i bredd som är rödaktiga men lättare än den omgivande sköldkörteln med en viss gräns.
- Ta ett frontfoto av PG med luftstrupen, sköldkörteln och struphuvudet för att kvantitativt jämföra effekterna av IONP före och efter injektion.
- Dissekera matstrupens baksida och använd sedan retraktorn för att exponera PG: s högra sida. Ta ett fotografi på höger sida av PG med sköldkörteln och luftstrupen.
- Byt upprullningsdonet för att exponera motsatt sida av PG och ta ett vänster foto av dem med sköldkörteln och luftstrupen.
12. Sköldkörtel injektion av jonp
- Använd en insulinspruta för att lokalt injicera 10 μL jonp-suspension (20 mg/ml i fosfatbuffrad saltlösning) i mitten av sköldkörteln. Tryck försiktigt på injektionsstället med gasväv i 5 sekunder.
13. Identifiering av PG efter injektion av jonprodukter
- Efter injektion, observera den snabba diffusionen av IONPs i sköldkörteln men inte PG, eftersom det negativt fläckar PG och skiljer dem från den omgivande sköldkörteln.
- Ta ett främre fotografi av den negativt färgade PG tillsammans med luftstrupen, sköldkörteln och struphuvudet.
- Ta vänster- och högerbilder av den negativt färgade PG med samma procedurer som nämnts ovan.
14. Resektion av halsen och luftstrupen med sköldkörteln och PG
- När råttorna har inhalerat överskott av isofluran (5% isofluran i mer än 5 min) och är under djup anestesi, avliva dem genom intrakardiell injektion av 0,5 ml mättad kaliumkloridlösning.
- Postmortem, ta bort halsen, luftstrupen, sköldkörteln och PG.
- Under en dragskåp, placera den borttagna halsen, luftstrupen, sköldkörteln och PG-proverna i 4% paraformaldehydlösning i 24 timmar.
15. Histopatologiska studier
- Dehydrera vävnaderna och bädda in dem i paraffin. Skär i 5 μm tjocka sektioner. Grädda sektionerna vid 37 ° C i en ugn över natten och vid 65 ° C i 1 timme.
- Färga sektionerna med hematoxylin och eosin (H&E) efter tvätt 3 x 5 min med 75%, 95%, 100% gradientalkohol och vattentvätt vid rumstemperatur.
- Låt patologer undersöka de H&E-färgade sektionerna under ett ljusmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna djurmodell snittade vi kirurgiskt halsen på en SD-råtta för att exponera luftstrupen, struphuvudet och omgivande vävnader. Därefter var sköldkörteln visuellt belägen på båda sidor av luftstrupen; Den är fjärilsformad och ca 3 mm x 5 mm stor. Ett par PG ligger vanligtvis i den övre delen av sköldkörteln, och deras färg är mycket lik den hos sköldkörtelloberna, vilket gör det extremt svårt att skilja dem med blotta ögat (Figur 1).
Efter injektionen diffunderar kontrastmedlet (figur 1 och figur 2), IONPs, lätt i sköldkörteln och färgar det svart, men kan inte infiltrera PG på grund av deras höga vävnadstäthet. Den obalanserade fördelningen av IONP mellan PG och sköldkörteln ger en slående kontrast, som lätt kan visualiseras med blotta ögat utan att kräva externa instrument. Figur 2 visar representativa bilder av PG negativt färgade av jonp i råttans vänstra sköldkörtel, där kontrasten mellan PG och sköldkörteln var anmärkningsvärd och storleken på råtta PG bestämdes till cirka 2 mm x 1 mm.
Postmortem, råttstruphuvudet och den intilliggande luftstrupen, matstrupen, sköldkörteln och PG resekterades för histopatologisk färgning. Seriella sektioner av vävnaden innehållande PG erhölls för att utföra H&E-färgning. Dessa H&E-färgade bilder (figur 3) avslöjade att PG är berikade med nära inriktade huvudceller, medan sköldkörteln har många lösa lumen som indikerar mycket lägre vävnadsdensitet.
Figur 1: Den fysiologiska strukturen hos PG och deras mikromiljö. Schematisk illustration av human PG och sköldkörtel vid pre- (A) och post-IONPs injektion (B). Representativa biopsibilder av råtta främre cervikala vävnader, inklusive PG, sköldkörteln, luftstrupen och struphuvudet vid injektion före (C) och efter IONP (D). Ytterligare bilder har publicerats i vår tidigare studie15. Förkortningar: PG = bisköldkörtlar; IONP = nanopartiklar av järnoxid; IONP10 = JONP med en diameter på 10 nm, Skalan är i centimeter (cm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Intraoperativ IONPs-förstärkt PG-identifiering. Representativa bilder av obehandlade (A) och IONPs-injicerade (B) sköldkörtellober på råtta vid injektion före och efter IONPs. Effekten av IONPs-förstärkt PG-identifiering är konsekvent i reproducerbar vid pre- (C) och post-IONPs injektion (D). Förkortningar: PG = bisköldkörteln; IONP = nanopartiklar av järnoxid; IONP10 = JONP med en diameter på 10 nm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Histologisk analys av en IONPs-injicerad sköldkörtel och dess mikromiljö . a) Representativa ex vivo-fotografier av främre cervikal råttvävnad efter injektion av jonp. (B) Representativa H&E-färgade bilder av råtta PG. Skalstapel = 50 μm. (C) Inzoomad bild av den streckade röda rutan i panel B. Skalstapel = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerar en IONPs-styrd negativ avbildningsteknik av råtta PG med hjälp av svarta IONP, som injicerades lokalt i mitten av sköldkörteln och diffunderades i sköldkörteln men inte PG. Det möjliggör tydlig identifiering av PG med blotta ögon utan hjälp av något mikroskop. Även om transgena möss med grönt fluorescerande protein selektivt uttryckt i PG har rapporterats13, är modellen som beskrivs i denna uppsats enklare att utföra. Det tar bara ~ 1 min per råtta efter injektion, och en tydlig skillnad mellan sköldkörteln och PG kan observeras med blotta ögon.
Dessutom är en annan fördel med denna modell att kostnaden och driftssvårigheten är betydligt lägre för denna råttmodell än för stora djurmodeller (t.ex. hundar12) som för närvarande används i prekliniska studier för att utvärdera nya PG-identifieringsmetoder. Den genomsnittliga kostnaden för en SD-råtta ligger nära den för en BALB / C-mus, vilket är över 30 gånger billigare än en hund. Denna billiga fördel med råttmodellen möjliggör att utöka antalet försökspersoner och upprepa tester i preklinisk forskning, vilket är svårt med stora djurmodeller. Under tiden är den typiska kroppsvikten hos en SD-råtta 300-350 g, vilket också är över 66 gånger lättare än hos en hund (22-23 kg)14.
En så stor kroppsviktskillnad minskar enormt operationssvårigheten i råttmodellen jämfört med stora djurmodeller, eftersom tyreoidektomi på stora djur som hundar kräver mer komplicerad anestesi och kirurgiska ingrepp, vilket gör det svårare och tekniskt utmanande. Kravet på kirurgi (grundläggande kirurgiska färdigheter krävs) utgör en begränsning för denna modell. IORP som används i denna studie har visat utmärkt biosäkerhet och biologisk nedbrytbarhet som tidigare rapporterats15. I slutändan hoppas vi att denna metod för negativ avbildning av råtta PG med hjälp av IONP kan ge en enkel och effektiv djurmodell för prekliniska studier som involverar PG-identifiering, vilket underlättar utvecklingen av nya PG-identifieringstekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
P.G. och W.Z. är meduppfinnare av en patentansökan som lämnats in av Cancer Hospital vid University of Chinese Academy of Sciences (Zhejiang Cancer Hospital) baserat på projektet. Övriga författare uppger inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (NSFC) (82172598), Natural Science Foundation of Zhejiang Province, Kina (LZ22H310001), 551 Health Talent Training Project of Health Commission of Zhejiang Province, Kina, och Medical and Health Science and Technology Project of Zhejiang Province, Kina (2021KY110).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alcohol | Li feng | 9400820067 | |
| anesthesia machine | RWD Company | R520IE | Machine number |
| blade | Daopian | TB-JZ-10# | |
| cylindrical pillow | made by ourselves | ||
| depilatory cream | Nair | TMG-001 | |
| electronic scale | Hong xingda | CN-HXD2 | |
| eosin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-2 | |
| erythromycin | Shuang ji (Beijing, China) | 200409 | |
| gauze | Fulanns | YY0331-2006 | |
| heating pad | Johon (ShenZhen,China) | JH-36-2006 | |
| hematoxylin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-1 | |
| insulin injection needle | Jiangyin NanquanMacromolecule | 20170702 | |
| iodophor cotton ball | HOYON | 19-6007 | |
| iron oxide nanoparticle solution | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag9110-05 | |
| isoflurane | Sigma Aldrich (St Louis USA). | 21112801 | |
| needle holder | Meijun | MH0587 | |
| operation table | BioJane | BJ-P-M | |
| paraformaldehyde solution | Biosharp | 21269333 | |
| rubber | G-CLONE | XT41050 |
|
| scanning machine | Olympus | Slideview VS200 | |
| surgical forceps | Suping | SPHC-0676 | |
| surgical knife handle | Aladdin | S3052-06-1EA | |
| surgical retractor | TOCYTO | 18-4010 | |
| surgical scissors | Suping | SPHC-0795 | |
| surgical towel | Along technology | YCKJ-RJ-036205 | |
| suture | Ethicon | SA84G | |
| suture with needle | Jinhuan (Shanghai,China) | F301 | |
| vascular forceps | Along technology | YCKJ-RJ-016218 | |
| Water Bath-Slide Drier | Hua su (Jinhua, China) | HS-1145 |
References
- Cope, O., Donaldson, G. A. Relation of thyroid and parathyroid glands to calcium and phosphorus metabolism. Study of a case with coexistent hypoparathyroidism and hyperthyroidism. The Journal of Clinical Investigation. 16 (3), 329-341 (1937).
- Mansberger, A. R., Wei, J. P. Surgical embryology and anatomy of the thyroid and parathyroid glands. Surgical Clinics of North America. 73 (4), 727-746 (1993).
- Koch, A., Hofbeck, M., Dorr, H. G., Singer, H. Hypocalcemia-induced heart failure as the initial symptom of hypoparathyroidism. Zeitschrift für Kardiologie. 88 (1), 10-13 (1999).
- Shoback, D. M., et al. Presentation of hypoparathyroidism: etiologies and clinical features. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (6), 2300-2312 (2016).
- Arneiro, A. J., et al. Self-report of psychological symptoms in hypoparathyroidism patients on conventional therapy. Archives of Endocrinology Metabolism. 62 (3), 319-324 (2018).
- Olson, E., Wintheiser, G., Wolfe, K. M., Droessler, J., Silberstein, P. T. Epidemiology of thyroid cancer: a review of the national cancer database, 2000-2013. Cureus. 11 (2), 4127 (2019).
- Du, L., et al. Epidemiology of thyroid cancer: incidence and mortality in China, 2015. Frontiers in Oncology. 10, 1702 (2020).
- Barrios, L., et al. Incidental parathyroidectomy in thyroidectomy and central neck dissection. Surgery. 169 (5), 1145-1151 (2021).
- Sitges-Serra, A., et al. Inadvertent parathyroidectomy during total thyroidectomy and central neck dissection for papillary thyroid carcinoma. Surgery. 161 (3), 712-719 (2017).
- Sakorafas, G. H., et al. Incidental parathyroidectomy during thyroid surgery: an underappreciated complication of thyroidectomy. World Journal of Surgery. 29 (12), 1539-1543 (2005).
- Sahyouni, G., et al. Rate of incidental parathyroidectomy in a pediatric population. OTO Open. 5 (4), (2021).
- Erickson, A. K., et al. Incidence, survival time, and surgical treatment of parathyroid carcinomas in dogs: 100 cases (2010-2019). Journal of the American Veterinary Medical Association. 259 (11), 1309-1317 (2021).
- Bi, R., Fan, Y., Luo, E., Yuan, Q., Mannstadt, M. Two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using GFP glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation. Journal of Visualized Experiments. (121), e55010 (2017).
- Soulsby, S. N., Holland, M., Hudson, J. A., Behrend, E. N. Ultrasonographic evaluation of adrenal gland size compared to body weight in normal dogs. Veterinary Radiology & Ultrasound. 56 (3), 317-326 (2015).
- Zheng, W. H., et al. Biodegradable iron oxide nanoparticles for intraoperative parathyroid gland imaging in thyroidectomy. PNAS Nexus. 1 (3), 087 (2022).
