利用线性DNA模板从核酸外切酶缺陷细胞提取物中合成无细胞蛋白
Summary
这里介绍的是用于制备和缓冲液校准大 肠杆菌 BL21 Rosetta2（ΔrecBCD 和 ΔrecB）核酸外切酶 V 敲除菌株细胞提取物的方案。这是一种使用线性DNA模板在无细胞蛋白质合成系统中表达的快速、简单和直接的方法。
Abstract
无细胞蛋白质合成（CFPS）由于其众多优点，最近在合成生物学领域变得非常流行。使用用于CFPS的线性DNA模板将进一步使该技术充分发挥其潜力，通过消除克隆，转化和质粒提取步骤来减少实验时间。线性DNA可以通过PCR快速轻松地扩增以获得高浓度的模板，避免潜在的 体内 表达毒性。然而，线性DNA模板被天然存在于细胞提取物中的核酸外切酶迅速降解。已经提出了几种策略来解决这个问题，例如添加核酸酶抑制剂或对线性DNA末端进行化学修饰以保护。所有这些策略都需要额外的时间和资源，并且尚未获得接近质粒水平的蛋白质表达。本文介绍了使用线性DNA模板进行CFPS的替代策略的详细方案。通过使用来自核酸外切酶缺陷敲除细胞的细胞提取物，线性DNA模板保持完整，无需任何末端修饰。我们介绍了来自 大肠杆菌 BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 菌株的细胞裂解物的制备步骤，通过超声裂解和缓冲液校准专门用于线性DNA的Mg-谷氨酸（Mg-glu）和K-谷氨酸（K-glu）。该方法能够达到与 大肠杆菌 CFPS中质粒DNA相当的蛋白质表达水平。
Introduction
无细胞蛋白质合成 （CFPS） 系统越来越多地被用作生物传感器工程、分散制造和遗传电路原型设计的快速、简单和高效的方法1。由于其巨大的潜力，CFPS系统经常用于合成生物学领域。然而，到目前为止，CFPS系统依赖于环状质粒，这可能会限制该技术充分发挥其潜力。质粒DNA的制备取决于克隆过程中许多耗时的步骤和大量的DNA分离。另一方面，质粒或合成的DNA模板的PCR扩增可用于在几个小时内简单地制备CFPS模板2，3。因此，线性DNA的应用为CFPS提供了有希望的解决方案。然而，线性DNA被天然存在于细胞提取物中的核酸外切酶迅速降解4。有一些解决方案可以解决这个问题，例如使用λ噬菌体GamS蛋白5或含有Chi位点6的DNA作为保护剂，或通过对其末端2，7，8，9进行化学修饰直接保护线性DNA。所有这些方法都需要补充细胞提取物，这是昂贵且耗时的。人们早就知道核酸外切酶V复合物（RecBCD）降解细胞裂解物中的线性DNA4。最近，我们发现线性DNA在核酸外切酶基因（recBCD）敲除细胞的裂解物中可以得到更好的保护10。
在该协议中，详细描述了通过超声裂解从 大肠杆菌 BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 菌株制备无细胞裂解物的步骤。超声裂解是几个实验室采用的常见且经济实惠的技术11，12。该菌株产生的提取物不需要添加任何额外的组分或DNA模板修饰来支持线性DNA模板的表达。该方法依赖于细胞提取物缓冲液优化的基本步骤，专门针对天然 大肠杆菌 启动子的线性DNA表达。已经表明，这种针对线性DNA表达的特异性缓冲液优化是天然σ70启动子在没有补充GamS蛋白或Chi DNA的情况下产生高蛋白产量的关键，即使避免了PCR产物的纯化10。发现线性DNA表达的最佳Mg-glu浓度与质粒DNA相似。然而，K-glu的最佳浓度显示线性DNA和质粒DNA之间存在显着差异，这可能是由于转录相关机制10。使用该方法表达的蛋白质的功能已在多种应用中得到证明，例如快速筛选脚趾开关和酶变体的活性评估10。
该协议提供了一种简单，高效且具有成本效益的解决方案，只需使用突变的ΔrecBCD细胞提取物和线性DNA的特异性校准作为模板，即可在大肠杆菌无细胞系统中使用线性DNA模板。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们表明由大肠杆菌BL21 Rosetta2制备的细胞裂解物具有recB或recBCD操纵子的基因组敲除，支持来自线性DNA模板的高蛋白表达。该协议详细阐述了特定于线性DNA模板的分步裂解物校准程序（图2），这是导致线性DNA中σ70启动子高表达的关键步骤，达到等摩尔DNA浓度的接近质粒水平。该协议强调了根据最终应用中使用的DNA（线性或质粒）类型进行缓冲液…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACB和JLF承认ANR SINAPUV赠款（ANR-17-CE07-0046）的资金支持。JLF和JB承认ANR SynBioDiag拨款（ANR-18-CE33-0015）的资金支持。MSA和JLF承认ANR iCFree拨款（ANR-20-BiopNSE）的资金支持。JB承认ERC的支持，从“COMPUCELL”（授权号657579）开始。生物化学结构中心感谢法国综合结构生物学基础设施（FRISBI）（ANR-10-INSB-05-01）的支持。MK感谢INRAe的MICA部门，巴黎萨克雷大学，法兰西岛（IdF）地区的DIM-RFSI和ANR DREAMY（ANR-21-CE48-003）的资金支持。这项工作得到了欧洲研究理事会整合者奖（CLB 865973）的资助。
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
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