Sintesi proteica priva di cellule da estratti cellulari carenti di esonucleasi utilizzando modelli di DNA lineare
Summary
Presentato qui un protocollo per la preparazione e la calibrazione tampone di estratti cellulari da ceppi knockout di esonucleasi V di Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD e ΔrecB). Questo è un approccio rapido, facile e diretto per l’espressione in sistemi di sintesi proteica privi di cellule utilizzando modelli lineari di DNA.
Abstract
La sintesi proteica priva di cellule (CFPS) è recentemente diventata molto popolare nel campo della biologia sintetica grazie ai suoi numerosi vantaggi. L’utilizzo di modelli di DNA lineare per CFPS consentirà inoltre alla tecnologia di raggiungere il suo pieno potenziale, riducendo il tempo sperimentale eliminando le fasi di clonazione, trasformazione ed estrazione del plasmide. Il DNA lineare può essere rapidamente e facilmente amplificato mediante PCR per ottenere alte concentrazioni del modello, evitando potenziali tossicità di espressione in vivo . Tuttavia, i modelli lineari di DNA sono rapidamente degradati dalle esonucleasi che sono naturalmente presenti negli estratti cellulari. Ci sono diverse strategie che sono state proposte per affrontare questo problema, come l’aggiunta di inibitori della nucleasi o la modifica chimica delle estremità lineari del DNA per la protezione. Tutte queste strategie costano tempo e risorse extra e devono ancora ottenere livelli di espressione proteica vicini al plasmide. Un protocollo dettagliato per una strategia alternativa è presentato qui per l’utilizzo di modelli di DNA lineare per CFPS. Utilizzando estratti cellulari da cellule knockout carenti di esonucleasi, i modelli lineari di DNA rimangono intatti senza richiedere alcuna modifica finale. Presentiamo le fasi di preparazione del lisato cellulare da Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD ceppo mediante lisi sonicazione e calibrazione tampone per Mg-glutammato (Mg-glu) e K-glutammato (K-glu) specificamente per DNA lineare. Questo metodo è in grado di raggiungere livelli di espressione proteica paragonabili a quelli del DNA plasmidico in E. coli CFPS.
Introduction
I sistemi di sintesi proteica priva di cellule (CFPS) sono sempre più utilizzati come metodo rapido, semplice ed efficiente per l’ingegneria dei biosensori, la produzione decentralizzata e la prototipazione di circuiti genetici1. Grazie al loro grande potenziale, i sistemi CFPS sono utilizzati regolarmente nel campo della biologia sintetica. Tuttavia, finora i sistemi CFPS si basano su plasmidi circolari che possono limitare la tecnologia dal raggiungere il suo pieno potenziale. La preparazione del DNA plasmidico dipende da molti passaggi che richiedono molto tempo durante la clonazione e grandi quantità di isolamento del DNA. D’altra parte, l’amplificazione PCR da un plasmide, o un modello di DNA sintetizzato, può essere utilizzata per preparare semplicemente modelli CFPS entro poche ore 2,3. Pertanto, l’applicazione del DNA lineare offre una soluzione promettente per la CFPS. Tuttavia, il DNA lineare viene rapidamente degradato dalle esonucleasi naturalmente presenti negli estratti cellulari4. Esistono soluzioni che affrontano questo problema, come l’uso della proteina GamS λ-fago5 o il DNA contenente siti Chi6 come agenti protettivi, o proteggere direttamente il DNA lineare modificando chimicamente le sue estremità 2,7,8,9. Tutti questi metodi richiedono integrazioni per l’estratto cellulare, che sono costosi e richiedono tempo. È noto da tempo che il complesso esonucleasi V (RecBCD) degrada il DNA lineare nei lisati cellulari4. Recentemente, abbiamo dimostrato che il DNA lineare può essere protetto molto meglio nei lisati da cellule eliminate per i geni esonucleasi (recBCD)10.
In questo protocollo, i passaggi per la preparazione di lisati privi di cellule dal ceppo E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD mediante lisi sonicazione sono descritti in dettaglio. La lisi sonicazione è una tecnica comune e conveniente impiegata da diversi laboratori11,12. Gli estratti prodotti da questo ceppo non hanno bisogno dell’aggiunta di alcun componente aggiuntivo o modifica del modello di DNA per supportare l’espressione da modelli lineari di DNA. Il metodo si basa sulla fase essenziale dell’ottimizzazione del tampone per gli estratti cellulari specificamente per l’espressione lineare del DNA da promotori nativi di E. coli. È stato dimostrato che questa specifica ottimizzazione del tampone per l’espressione lineare del DNA è la chiave per i promotori nativi σ70 per produrre un’elevata produzione di proteine senza l’integrazione di proteina GamS o DNA Chi, evitando anche la purificazione dei prodotti PCR10. La concentrazione ottimale di Mg-glu per l’espressione lineare del DNA è risultata simile a quella del DNA plasmide. Tuttavia, la concentrazione ottimale di K-glu ha mostrato una differenza sostanziale tra DNA lineare e plasmide, probabilmente a causa di un meccanismo correlato alla trascrizione10. La funzionalità delle proteine espresse con questo metodo è stata dimostrata per diverse applicazioni, come lo screening rapido degli interruttori e la valutazione dell’attività delle varianti enzimatiche10.
Questo protocollo fornisce una soluzione semplice, efficiente ed economica per l’utilizzo di modelli di DNA lineare in sistemi privi di cellule di E. coli semplicemente utilizzando estratti cellulari ΔrecBCD mutanti e calibrazione specifica per DNA lineare come modello.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, mostriamo che il lisato cellulare preparato da E. coli BL21 Rosetta2 con un knockout genomico per l’operone recB o recBCD supporta un’elevata espressione proteica da modelli lineari di DNA. Questo protocollo elabora una procedura di calibrazione del lisato passo-passo specifica per i modelli di DNA lineare (Figura 2), che è un passo critico che porta all’alta espressione da promotori σ70 nel DNA lineare, raggiungendo livelli vicini al plasmide per concentraz…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACB e JLF riconoscono il sostegno finanziario della sovvenzione ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF e JB riconoscono il sostegno finanziario della sovvenzione ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). MSA e JLF riconoscono il sostegno finanziario della sovvenzione ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). JB riconosce il sostegno del CER a partire da “COMPUCELL” (numero di sovvenzione 657579). Il Centre de Biochimie Structurale riconosce il sostegno dell’infrastruttura francese per la biologia strutturale integrata (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK riconosce il sostegno finanziario del dipartimento MICA dell’INRAe, dell’Université Paris-Saclay, della regione Ile-de-France (IdF) DIM-RFSI e di ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti attraverso il premio Consolidator Award (865973 to CLB) del Consiglio europeo della ricerca.
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
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