تخليق البروتين الخالي من الخلايا من المستخلصات الخلوية الناقصة Exonuclease باستخدام قوالب الحمض النووي الخطية
Summary
يظهر هنا بروتوكول لإعداد ومعايرة المخزن المؤقت لمستخلصات الخلايا من سلالات الضربة القاضية exonuclease V من الإشريكية القولونية BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD و ΔrecB). هذا نهج سريع وسهل ومباشر للتعبير في أنظمة تخليق البروتين الخالية من الخلايا باستخدام قوالب الحمض النووي الخطية.
Abstract
أصبح تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) مؤخرا شائعا جدا في مجال البيولوجيا التركيبية بسبب مزاياه العديدة. إن استخدام قوالب الحمض النووي الخطي ل CFPS سيمكن التكنولوجيا من الوصول إلى إمكاناتها الكاملة ، مما يقلل من الوقت التجريبي من خلال القضاء على خطوات الاستنساخ والتحويل واستخراج البلازميد. يمكن تضخيم الحمض النووي الخطي بسرعة وسهولة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للحصول على تركيزات عالية من القالب ، وتجنب سمية التعبير المحتملة في الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن قوالب الحمض النووي الخطية تتحلل بسرعة بواسطة exonucleases الموجودة بشكل طبيعي في مستخلصات الخلايا. هناك العديد من الاستراتيجيات التي تم اقتراحها لمعالجة هذه المشكلة ، مثل إضافة مثبطات النوكليز أو التعديل الكيميائي لنهايات الحمض النووي الخطي للحماية. كل هذه الاستراتيجيات تكلف وقتا وموارد إضافية ولم تحصل بعد على مستويات قريبة من البلازميد من التعبير عن البروتين. يتم تقديم بروتوكول مفصل لاستراتيجية بديلة هنا لاستخدام قوالب الحمض النووي الخطي ل CFPS. باستخدام مستخلصات الخلايا من الخلايا القاضية التي تعاني من نقص exonuclease ، تظل قوالب الحمض النووي الخطية سليمة دون الحاجة إلى أي تعديلات نهائية. نقدم خطوات تحضير تحلل الخلايا من سلالة الإشريكية القولونية BL21 Rosetta2 ΔrecBCD عن طريق تحلل الصوتنة ومعايرة المخزن المؤقت ل Mg-glutamate (Mg-glu) و K-glutamate (K-glu) خصيصا للحمض النووي الخطي. هذه الطريقة قادرة على تحقيق مستويات تعبير البروتين مماثلة لتلك الموجودة في الحمض النووي البلازميد في E. coli CFPS.
Introduction
يتم استخدام أنظمة تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) بشكل متزايد كطريقة سريعة وبسيطة وفعالة لهندسة الاستشعار الحيوي والتصنيع اللامركزي والنماذج الأولية للدوائر الوراثية1. نظرا لإمكاناتها الكبيرة ، يتم استخدام أنظمة CFPS بانتظام في مجال البيولوجيا التركيبية. ومع ذلك ، تعتمد أنظمة CFPS حتى الآن على البلازميدات الدائرية التي يمكن أن تحد من وصول التكنولوجيا إلى إمكاناتها الكاملة. يعتمد إعداد الحمض النووي البلازميد على العديد من الخطوات التي تستغرق وقتا طويلا أثناء الاستنساخ وكميات كبيرة من عزل الحمض النووي. من ناحية أخرى ، يمكن استخدام تضخيم PCR من البلازميد ، أو قالب الحمض النووي المركب ، ببساطة لإعداد قوالب CFPS في غضون ساعات قليلة 2,3. لذلك ، يوفر تطبيق الحمض النووي الخطي حلا واعدا ل CFPS. ومع ذلك ، يتحلل الحمض النووي الخطي بسرعة بواسطة exonucleases الموجودة بشكل طبيعي في المستخلصات الخلوية4. هناك حلول تعالج هذه المشكلة ، مثل استخدام بروتين GamS5 أو الحمض النووي الذي يحتوي على مواقع Chi6 كعوامل واقية ، أو حماية الحمض النووي الخطي مباشرة عن طريق التعديل الكيميائي لنهاياته 2,7,8,9. كل هذه الطرق تتطلب مكملات لمستخلص الخلية ، وهي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. من المعروف منذ فترة طويلة أن مجمع exonuclease V (RecBCD) يحلل الحمض النووي الخطي في محللات الخلايا4. في الآونة الأخيرة ، أظهرنا أن الحمض النووي الخطي يمكن حمايته بشكل أفضل بكثير في lysates من الخلايا التي تم إخراجها لجينات exonuclease (recBCD)10.
في هذا البروتوكول ، يتم وصف خطوات تحضير التحلل الخالي من الخلايا من سلالة E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD بواسطة تحلل الصوتنة بالتفصيل. تحليل الصوتنة هو تقنية شائعة وبأسعار معقولة تستخدمها العديد من المختبرات11,12. لا تحتاج المستخلصات الناتجة عن هذه السلالة إلى إضافة أي مكون إضافي أو تعديل قالب الحمض النووي لدعم التعبير من قوالب الحمض النووي الخطية. تعتمد هذه الطريقة على الخطوة الأساسية المتمثلة في تحسين المخزن المؤقت لمستخلصات الخلايا خصيصا لتعبير الحمض النووي الخطي من مروجي E. coli الأصليين. وقد تبين أن هذا التحسين العازل المحدد للتعبير الخطي عن الحمض النووي هو المفتاح لمروجي σ70 الأصليين لإنتاج نسبة عالية من البروتين دون بروتين GamS أو مكملات Chi DNA ، حتى تجنب تنقية منتجات PCR10. تم العثور على التركيز الأمثل ل Mg-glu للتعبير الخطي عن الحمض النووي ليكون مشابها للحمض النووي البلازميد. ومع ذلك ، أظهر التركيز الأمثل ل K-glu فرقا كبيرا بين الحمض النووي الخطي والبلازميد ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى آلية متعلقة بالنسخ10. تم إثبات وظائف البروتينات المعبر عنها باستخدام هذه الطريقة للعديد من التطبيقات ، مثل الفحص السريع لمفاتيح تثبيت القدم وتقييم نشاط متغيرات الإنزيم10.
يوفر هذا البروتوكول حلا بسيطا وفعالا وفعالا من حيث التكلفة لاستخدام قوالب الحمض النووي الخطي في الأنظمة الخالية من خلايا E. coli ببساطة باستخدام مستخلصات خلايا ΔrecBCD المتحولة والمعايرة المحددة للحمض النووي الخطي كقالب.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، نظهر أن محللات الخلايا المحضرة من E. coli BL21 Rosetta2 مع ضربة قاضية جينومية إما ل recB أو recBCD operon تدعم التعبير عالي البروتين من قوالب الحمض النووي الخطية. يضع هذا البروتوكول إجراء معايرة محللة خطوة بخطوة خاص بقوالب الحمض النووي الخطية (الشكل 2) ، وهي خطوة حاسمة تؤ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تعترف ACB و JLF بدعم التمويل المقدم من منحة ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). تعترف JLF و JB بدعم التمويل المقدم من منحة ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). تعترف MSA و JLF بدعم التمويل من منحة ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). تعترف JB بالدعم المقدم من ERC بدءا من “COMPUCELL” (رقم المنحة 657579). يعترف مركز الكيمياء الحيوية الهيكلية بالدعم المقدم من البنية التحتية الفرنسية للبيولوجيا الهيكلية المتكاملة (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). تعترف MK بدعم التمويل المقدم من قسم MICA التابع ل INRAe ، وجامعة باريس ساكلاي ، و DIM-RFSI في منطقة Ile-de-France (IdF) ، و ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). تم دعم هذا العمل من خلال التمويل من خلال جائزة المجلس الأوروبي للبحوث الموحدة (865973 إلى CLB).
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
- McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328 (2021).
- Schinn, S. -. M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8 (2016).
- Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
- Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
- Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
- Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
- Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882 (2019).
- Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
