Síntese de proteínas livres de células a partir de extratos celulares deficientes em exonicordes utilizando modelos lineares de DNA
Summary
Apresenta-se aqui um protocolo para a preparação e calibração tampão de extratos celulares de cepas knockout de exonuclease V de Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD e ΔrecB). Esta é uma abordagem rápida, fácil e direta para a expressão em sistemas de síntese de proteínas livres de células usando modelos lineares de DNA.
Abstract
A síntese de proteínas livres de células (CFPS) tornou-se recentemente muito popular no campo da biologia sintética devido às suas inúmeras vantagens. O uso de modelos lineares de DNA para CFPS permitirá que a tecnologia atinja todo o seu potencial, diminuindo o tempo experimental, eliminando as etapas de clonagem, transformação e extração de plasmídeos. O DNA linear pode ser rápida e facilmente amplificado por PCR para obter altas concentrações do molde, evitando potencial toxicidade de expressão in vivo. No entanto, os modelos lineares de DNA são rapidamente degradados por exonucleases que estão naturalmente presentes nos extratos celulares. Existem várias estratégias que têm sido propostas para enfrentar este problema, tais como a adição de inibidores de nuclease ou modificação química de extremidades lineares de DNA para proteção. Todas essas estratégias custam tempo e recursos extras e ainda não obtiveram níveis quase plasmídicos de expressão proteica. Um protocolo detalhado para uma estratégia alternativa é apresentado aqui para o uso de modelos de DNA linear para CFPS. Usando extratos celulares de células nocauteadoras deficientes em exonuclease, os modelos lineares de DNA permanecem intactos sem a necessidade de modificações finais. Apresentamos as etapas de preparação do lisado celular da cepa Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD por lise sonicação e calibração tampão para Mg-glutamato (Mg-glu) e K-glutamato (K-glu) especificamente para DNA linear. Este método é capaz de atingir níveis de expressão de proteínas comparáveis aos do DNA plasmídico em E. coli CFPS.
Introduction
Os sistemas de síntese proteica livre de células (CFPS) estão sendo cada vez mais utilizados como um método rápido, simples e eficiente para engenharia de biossensores, fabricação descentralizada e prototipagem de circuitos genéticos1. Devido ao seu grande potencial, os sistemas CFPS são utilizados regularmente no campo da biologia sintética. No entanto, até agora, os sistemas CFPS dependem de plasmídeos circulares que podem limitar a tecnologia de atingir todo o seu potencial. A preparação do DNA plasmídico depende de muitas etapas demoradas durante a clonagem e de grandes quantidades de isolamento de DNA. Por outro lado, a amplificação por PCR a partir de um plasmídeo, ou um molde de DNA sintetizado, pode ser usada para simplesmente preparar modelos de CFPS dentro de algumas horas 2,3. Portanto, a aplicação de DNA linear oferece uma solução promissora para a SFCP. No entanto, o DNA linear é rapidamente degradado pelas exonucleases naturalmente presentes nos extratos celulares4. Existem soluções que abordam esse problema, como o uso da proteína λ-fago GamS5 ou DNA contendo sítios Chi6 como agentes protetores, ou a proteção direta do DNA linear por modificação química de suas extremidades 2,7,8,9. Todos esses métodos requerem suplementações ao extrato celular, que são caros e demorados. Sabe-se há muito tempo que o complexo exonuclease V (RecBCD) degrada o DNA linear em lisados celulares4. Recentemente, mostramos que o DNA linear pode ser muito melhor protegido em lisados de células nocauteadas por genes exonuclease (recBCD)10.
Neste protocolo, as etapas para a preparação de lisados livres de células da cepa E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD por lise sonicação são descritas em detalhes. A lise sonicativa é uma técnica comum e acessível empregada por vários laboratórios11,12. Os extratos produzidos a partir desta estirpe não necessitam da adição de qualquer componente extra ou modificação do molde de ADN para suportar a expressão a partir de moldes de ADN lineares. O método baseia-se na etapa essencial de otimização de tampão para extratos celulares especificamente para a expressão linear de DNA de promotores nativos de E. coli. Demonstrou-se que essa otimização específica do tampão para a expressão linear do DNA é a chave para que os promotores nativos do σ70 produzam alta produção de proteínas sem suplementação de proteína GamS ou DNA Chi, evitando até mesmo a purificação dos produtos de PCR10. A concentração ótima de Mg-glu para a expressão linear do DNA foi semelhante à do DNA plasmídico. No entanto, a concentração ótima de K-glu mostrou uma diferença substancial entre o DNA linear e plasmídico, provavelmente devido a um mecanismo relacionado à transcrição10. A funcionalidade das proteínas expressas por esse método tem sido demonstrada para diversas aplicações, como a triagem rápida de interruptores de dedo do pé e a avaliação da atividade de variantes enzimáticas10.
Este protocolo fornece uma solução simples, eficiente e econômica para o uso de modelos lineares de DNA em sistemas livres de células de E. coli simplesmente usando extratos de células ΔrecBCD mutantes e calibração específica para DNA linear como modelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, mostramos que o lisado celular preparado a partir de E. coli BL21 Rosetta2 com um knockout genômico para o operon recB ou recBCD suporta alta expressão proteica a partir de modelos lineares de DNA. Este protocolo elabora um procedimento de calibração passo-a-passo de lisado específico para modelos lineares de DNA (Figura 2), que é uma etapa crítica que leva à alta expressão de promotores σ70 em DNA linear, atingindo níveis quase plasmídicos para c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACB e JLF reconhecem o apoio financeiro pela subvenção ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF e JB reconhecem o apoio financeiro da bolsa ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). A MSA e a JLF reconhecem o apoio financeiro da subvenção ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). O JB reconhece o apoio do ERC ao iniciar o “COMPUCELL” (número de concessão 657579). O Centre de Biochimie Structurale reconhece o apoio da Infraestrutura Francesa de Biologia Estrutural Integrada (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK reconhece o apoio financeiro do departamento MICA da INRAe, Université Paris-Saclay, DIM-RFSI da região de Ile-de-France (IdF) e ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Este trabalho foi apoiado por financiamento através do Prémio Consolidador do Conselho Europeu de Investigação (865973 ao CLB).
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
- McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328 (2021).
- Schinn, S. -. M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8 (2016).
- Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
- Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
- Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
- Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
- Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882 (2019).
- Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
