Experimentelle Quantifizierung von Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffabgabesystemen und Zellen in vitro: Ein Leitfaden für die präklinische Bewertung der Nanomedizin

Summary

Es wird ein Workflow für die absolute Quantifizierung von Wirkstoffträger-Zell-Interaktionen mittels Durchflusszytometrie demonstriert, um eine bessere rationale Bewertung neuartiger Wirkstoffabgabesysteme zu ermöglichen. Dieser Workflow gilt für Arzneimittelträger aller Art.

Abstract

Eine wichtige Komponente bei der Entwicklung von Medikamentenabgabesystemen betrifft die Verstärkung oder Abschwächung von Interaktionen mit bestimmten Zelltypen. Zum Beispiel könnte ein Chemotherapeutikum mit einem Antikörper funktionalisiert werden, um die Bindung an Krebszellen zu verbessern (“Targeting”) oder mit Polyethylenglykol funktionalisiert werden, um die Immunzellerkennung zu umgehen (“Stealth”). Selbst auf zellulärer Ebene ist die Optimierung der Bindung und Aufnahme eines Wirkstoffträgers ein komplexes biologisches Designproblem. Daher ist es wertvoll zu trennen, wie stark ein neuer Träger mit einer Zelle interagiert, von der funktionellen Wirksamkeit der Fracht eines Trägers, sobald er an diese Zelle geliefert wurde.

Um das chemotherapeutische Beispiel fortzusetzen, “wie gut es an eine Krebszelle bindet” ist ein separates Problem von “wie gut es eine Krebszelle tötet”. Quantitative In-vitro-Assays für letztere sind gut etabliert und beruhen in der Regel auf der Messung der Lebensfähigkeit. Die meisten veröffentlichten Forschungsergebnisse zu Zellträgerinteraktionen sind jedoch qualitativ oder semiquantitativ. Im Allgemeinen beruhen diese Messungen auf fluoreszierender Markierung des Trägers und berichten folglich über Wechselwirkungen mit Zellen in relativen oder beliebigen Einheiten. Diese Arbeit kann jedoch standardisiert und mit einer kleinen Anzahl von Charakterisierungsexperimenten absolut quantitativ gemacht werden. Eine solche absolute Quantifizierung ist wertvoll, da sie rationale, klassen- und klasseninterne Vergleiche verschiedener Wirkstoffabgabesysteme ermöglicht – Nanopartikel, Mikropartikel, Viren, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, technisch hergestellte therapeutische Zellen oder extrazelluläre Vesikel.

Darüber hinaus ist die Quantifizierung Voraussetzung für nachfolgende Metaanalysen oder In-silico-Modellierungsansätze . In diesem Artikel werden Videoanleitungen sowie ein Entscheidungsbaum für das Erreichen einer In-vitro-Quantifizierung für Trägerarzneimittelabgabesysteme vorgestellt, die Unterschiede in der Trägergröße und der Kennzeichnungsmodalität berücksichtigen. Darüber hinaus werden weitere Überlegungen zur quantitativen Bewertung fortgeschrittener Wirkstoffabgabesysteme diskutiert. Dies soll als wertvolle Ressource dienen, um die rationale Bewertung und das Design für die nächste Generation von Medikamenten zu verbessern.

Introduction

Das Design von Medikamentenabgabekonstrukten, die je nach Zelltyp ein spezifisches, entworfenes Verhalten aufweisen, hat erhebliches Forschungsinteresse geweckt. Potenzielle Wirkstoffabgabekonstrukte oder “Träger” umfassen Lipidformulierungen, nanogewachsene anorganische Substanzen, polymere Anordnungen, extrazelluläre Vesikel, funktionalisierte Bakterienzellen oder modifizierte Viren. Alle diese können Organ-, Gewebe- oder Zellspezifität aufgrund physikalischer Eigenschaften, Oberflächeneigenschaften oder technischer chemischer Funktionalisierungen wie Antikörperbindung ^1,2 aufweisen.

Ein fast allgegenwärtiger Schritt in der In-vitro-Trägerbewertung besteht darin, Zellen mit einer Suspension zu inkubieren, die den medikamentenbeladenen Träger enthält. Nach der Inkubation wird die Trägerleistung über eine funktionale Anzeige der Leistung der Arzneimittelladung gemessen, z. B. Transfektionseffizienz oder Toxizität. Funktionale Anzeigen sind nützlich, da sie ein nachgelagertes Maß für die Wirksamkeit des Trägers sind. Für komplexere Wirkstoffabgabekonstrukte wird es jedoch immer wichtiger, über funktionale Messwerte hinauszugehen und den Grad der Trägerinteraktion mit der interessierenden Zelle separat zu quantifizieren. Dafür gibt es mehrere Gründe.

Erstens besteht ein zunehmendes Interesse an der Entdeckung (und iterativen Verbesserung) von “Plattform”-Trägertechnologien, die eine Vielzahl von Fracht transportieren können. Zum Beispiel können Lipid-Nanopartikel (LNPs), die RNA verkapseln sollen, eine RNA-Sequenz mit wenigen Einschränkungen gegen eine andere austauschen³. Um die Trägertechnologie iterativ zu verbessern, ist es daher wichtig, ihre Leistung unabhängig von der Frachtfunktionalität zu quantifizieren. Zweitens sind funktionale Anzeigen für die Ladung von Interesse möglicherweise nicht einfach und beeinträchtigen die Fähigkeit, Trägerformulierungen schnell zu iterieren und zu bewerten. Während man eine In-vitro-Optimierung mit einer Modellladung mit einer einfachen funktionellen Anzeige (z. B. Fluoreszenz) durchführen könnte, kann das Ändern der Ladung die biologische Reaktion auf einen Träger⁴ verändern und daher möglicherweise keine repräsentativen Ergebnisse liefern. Drittens sind viele Träger so konzipiert, dass sie mit einem bestimmten Zelltyp interagieren und von ihm aufgenommen werden. Eine solche Zielerfassung eines Trägers kann und sollte von der Leistung seines therapeutischen Frachtpostenziels unterschieden werden. Um das LNP-Beispiel fortzusetzen, könnte eine RNA-Fracht extrem potent sein, aber wenn das LNP nicht in der Lage ist, an die Zelle zu binden, internalisiert zu werden und die RNA freizusetzen, wird kein nachgeschalteter funktioneller Effekt beobachtet. Dies kann insbesondere für Träger, die schwer zu transfizierende Zelltypen wie T-Zellen⁵ anvisieren sollen, ein Problem darstellen. Umgekehrt könnte ein LNP extrem effektiv angreifen, aber die RNA-Fracht funktioniert möglicherweise nicht. Ein nachgeschalteter Assay, der nur die Frachtfunktionalität misst, wird nicht in der Lage sein, zwischen diesen beiden Situationen zu unterscheiden, was die Entwicklung und Optimierung von Carrier-Drug-Delivery-Systemen erschwert.

In dieser Arbeit wird diskutiert, wie die Trägerassoziation absolut quantifiziert werden kann. Assoziation ist ein Begriff, der sich auf den experimentell gemessenen Grad der Interaktion zwischen einem Träger und einer Zelle bezieht. Die Assoziation unterscheidet nicht zwischen Membranbindung und Internalisierung – ein Träger kann assoziiert sein, weil er an die Zelloberfläche gebunden ist oder weil die Zelle ihn verinnerlicht hat. Die Assoziation wird häufig im Rahmen von Zellträger-Inkubationsexperimenten gemessen. In der Vergangenheit wurde die Assoziation entweder in beliebigen fluoreszierenden Einheiten (typischerweise “mediane Fluoreszenzintensität” oder MFI) oder als “prozentuale Assoziation” berichtet, Metriken, deren Einschränkungen zuvor diskutiert wurden⁶. Kurz gesagt, diese Messungen sind aufgrund von Unterschieden in den experimentellen Protokollen, Durchflusszytometereinstellungen und den Markierungsintensitäten verschiedener Träger nicht zwischen Experimenten, Laboratorien und Wirkstoffträgern vergleichbar. Ersteres wurde durch Kalibrierung des Zytometers überwunden, wodurch das relative Maß des MFI in ein absolut quantitatives Maß für Fluoreszenz umgewandelt^{wurde 7}. Diese Methode berücksichtigt jedoch nicht die Variabilität in der Markierungsintensität verschiedener Träger und erlaubt daher keinen rationalen Vergleich verschiedener Trägerleistungen in einer Zielzelle der Wahl⁸.

Hier wird gezeigt, wie man praktisch von relativen, beliebigen fluoreszierenden Einheiten in die absolute quantitative Metrik der “Anzahl der Träger pro Zelle” umrechnen kann, indem eine kleine Anzahl zusätzlicher Charakterisierungsexperimente durchgeführt wird. Wenn eine andere Metrik der Trägerkonzentration gewünscht wird (z. B. Trägermasse pro Zelle oder Trägervolumen pro Zelle), ist es einfach, von Trägern pro Zelle umzurechnen, sofern eine Trägercharakterisierung durchgeführt wurde. Aus Gründen der Kürze und um Jargon zu vermeiden, wird das Wort “Träger” in dieser Arbeit verwendet, um sich auf die große Auswahl an Medikamentenabgabekonstrukten zu beziehen. Diese Quantifizierungstechniken sind gleichermaßen anwendbar, unabhängig davon, ob sie auf ein nanotechnologisch hergestelltes Goldpartikel oder ein biotechnologisch hergestelltes Bakterium angewendet werden.

Einige wenige Fakten ermöglichen die Umwandlung von beliebigen fluoreszierenden Einheiten in Träger pro Zelle. Erstens ist die gemessene Fluoreszenzintensität proportional zur Konzentration eines Fluorophors⁹ (oder eines fluoreszenzmarkierten Trägers), vorausgesetzt, die Fluoreszenz liegt innerhalb der Nachweisgrenzen des Instruments und die Instrumentierungseinstellungen sind gleich. Wenn also die Fluoreszenz eines Trägers und die Fluoreszenz einer Probe bekannt sind, kann man bestimmen, wie viele Träger in dieser Probe vorhanden sind, wenn alle Messungen unter den gleichen Einstellungen und Bedingungen durchgeführt wurden. Insbesondere bei kleineren Trägern ist es jedoch möglicherweise nicht möglich, Trägerfluoreszenz, Zellautofluoreszenz und zellassoziierte Trägerfluoreszenz auf demselben Instrument mit den gleichen Einstellungen zu messen. In diesem Fall gibt es eine zweite Anforderung, um die Umrechnung zwischen gemessener Fluoreszenz auf einem Instrument und gemessener Fluoreszenz auf einem anderen Instrument zu ermöglichen. Zu diesem Zweck kann eine Standardkurve der Fluorophorkonzentration erstellt werden, um die Fluoreszenzintensität auf beiden Instrumenten zu messen, wobei der MESF-Standard⁹ (Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome) genutzt wird. Dies ermöglicht dann die Messung der Trägerfluoreszenz in großen Mengen auf einem Nicht-Zytometer, eine Messung, die an Trägern beliebiger Größe oder Eigenschaft durchgeführt werden kann. Wenn eine solche Massenquantifizierung an einer Trägersuspension bekannter Konzentration durchgeführt wird, kann die Anzahl der Träger pro Zelle einer Probe erneut berechnet werden.

Während diese Arbeit den Prozess zur Messung der Trägerassoziation (bestimmt durch die gemessene Fluoreszenzintensität) demonstriert, könnte ein analoges Protokoll für andere Messungen der Zell-Träger-Interaktion durchgeführt werden (z. B. ein experimentelles Protokoll, das internalisierte und membrangebundene Träger unterscheidet). Darüber hinaus wäre dieses Protokoll weitgehend gleich, wenn die Assoziation durch einen nicht-fluoreszierenden Assay (z. B. durch Massenzytometrie) gemessen würde.

Protocol

1. Auswahl des passenden Streams Befolgen Sie die in Abbildung 1 dargestellte Entscheidungsstruktur, um den besten Workflow (Stream) (Abbildung 2) für den verwendeten Versuchsaufbau zu ermitteln. Weitere Kommentare zu dieser Stream-Auswahl finden Sie in der Diskussion. Wenn Sie dem Zytometer-Stream folgen, fahren Sie mit den Schritten 2.1.1-2.2.7 fort. Wenn Sie dem Massenstream folgen, fahren Sie mit den Schritten 3.1.1.1-3….

Representative Results

Wie bereits erwähnt, erfordern verschiedene Wirkstoffträgertypen die Verwendung unterschiedlicher Techniken zur absoluten Quantifizierung der Zellträgerassoziation. Zum Beispiel sind 633 nm disulfidstabilisierte Poly(methacrylsäure) (PMA SH) Kernschalenpartikel groß und dicht genug für die Detektion mit einem empfindlichen Durchflusszytometer. Als solche wurden diese Partikel fluoreszierend markiert, dann mit Seitenwinkellichtstreuung (SALS, analog zu SSC) sowie dem entsprechenden Fluoreszenzkanal angegu…

Discussion

Die Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffträgern und Zellen gewinnt bei der Entwicklung neuartiger Wirkstoffabgabesysteme zunehmend an Bedeutung. Insbesondere um die rationale Bewertung und den Vergleich verschiedener Trägerkonstrukte zu ermöglichen, ist die absolute Quantifizierung der Leistung des Trägers bei der Interaktion mit Ziel- und Off-Target-Zellen von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt eine Zwei-Stream-Methodik, die es jedem Forscher, der mit einem Wirkstoffträger ar…

Materials

Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies
Apogee A50 Microflow	Apogee		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments
FCS Express	De Novo Software		Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis
Prism 8	GraphPad		Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard