in vitroでのドラッグデリバリーシステムと細胞間の相互作用の実験的定量:前臨床ナノメディシン評価のためのガイド
Summary
フローサイトメトリーを使用して薬物キャリアと細胞間相互作用の絶対定量を行うためのワークフローが実証され、新しい薬物送達システムのより合理的な評価が可能になります。このワークフローは、あらゆるタイプの薬物キャリアに適用できます。
Abstract
ドラッグデリバリーシステムの設計の主要なコンポーネントは、特定の細胞タイプとの相互作用を増幅または減衰させる方法に関係しています。例えば、化学療法は、癌細胞への結合を増強するために抗体で機能化され(「ターゲティング」)、または免疫細胞の認識を回避するのを助けるためにポリエチレングリコールで機能化され得る(「ステルス」)。細胞レベルであっても、薬物キャリアの結合と取り込みを最適化することは、複雑な生物学的設計上の問題です。したがって、新しい運送業者がセルとどの程度強く相互作用するかを、そのセルに配送された運送業者の貨物の機能的有効性から分離することは価値があります。
化学療法の例を続けると、「がん細胞にどれだけうまく結合するか」は、「がん細胞をどれだけうまく殺すか」とは別の問題です。後者の定量的 in vitro アッセイは十分に確立されており、通常は生存率の測定に依存しています。ただし、細胞キャリア相互作用に関するほとんどの公開された研究は、定性的または半定量的です。一般に、これらの測定は担体の蛍光標識に依存しており、その結果、細胞との相互作用を相対的または任意の単位で報告します。ただし、この作業は標準化され、少数の特性評価実験で絶対的に定量化できます。このような絶対定量は、ナノ粒子、微粒子、ウイルス、抗体薬物複合体、操作された治療細胞、または細胞外小胞など、さまざまな薬物送達システムの合理的なクラス間およびクラス内の比較を容易にするため、価値があります。
さらに、定量化は、その後のメタアナリ シスまたはインシリコ モデリングアプローチの前提条件です。この記事では、キャリアサイズと標識モダリティの違いを考慮したビデオガイドと、キャリアドラッグデリバリーシステムの in vitro 定量を実現する方法の決定木を紹介します。さらに、高度なドラッグデリバリーシステムの定量的評価に関するさらなる考慮事項について説明します。これは、次世代の医療の合理的な評価と設計を改善するための貴重なリソースとして機能することを目的としています。
Introduction
遭遇する細胞タイプに応じて特異的に設計された挙動を示すドラッグデリバリーコンストラクトの設計は、大きな研究関心を集めています。潜在的な薬物送達構築物または「担体」には、脂質製剤、ナノ成長無機物、ポリマー集合体、細胞外小胞、機能化された細菌細胞、または修飾ウイルスが含まれる。これらはすべて、物理的特性、表面特性、または抗体付着などの操作された化学的機能化により、臓器、組織、または細胞の特異性を示す可能性があります1,2。
in vitro担体評価におけるほぼユビキタスなステップは、前記薬物担持担体を含む懸濁液と共に細胞をインキュベートすることである。インキュベーション後、キャリア性能は、トランスフェクション効率や毒性などの薬剤貨物の性能の機能的読み出しによって測定されます。機能読み出しは、キャリアの有効性の下流の尺度であるため、有用です。しかし、より複雑な薬物送達構築物の場合、機能的な読み出しを超えて、目的の細胞とのキャリア相互作用の程度を個別に定量することがますます重要になっています。これにはいくつかの理由があります。
第一に、さまざまな貨物を運ぶことができる「プラットフォーム」キャリア技術の発見(および反復的な改善)への関心が高まっています。例えば、RNAをカプセル化するように設計された脂質ナノ粒子(LNP)は、あるRNA配列を別のRNA配列と交換することができますが、いくつかの注意点があります3。したがって、運送業者の技術を反復的に改善するには、貨物の機能に関係なくその性能を定量化することが重要です。第二に、関心のある貨物にとって機能的な読み出しは単純ではない可能性があり、キャリアの処方を迅速に反復して評価する能力を損なう可能性があります。単純な機能読み出し(例えば、蛍光)を有するモデル貨物を用いてin vitro最適化を行うことができるが、貨物を変更すると、担体4に対する生物学的応答が変化する可能性があり、したがって、代表的な結果をもたらさない可能性がある。第三に、多くのキャリアは、特定の細胞型と相互作用し、取り込まれるように設計されています。運送業者のこのようなターゲティング能力は、その治療用貨物ポストターゲティングの性能と区別することができ、また区別されるべきである。LNPの例を続けると、RNAカーゴは非常に強力かもしれませんが、LNPが細胞に結合し、内在化され、RNAを放出できない場合、下流の機能的影響は観察されません。これは、T細胞5などのトランスフェクションが困難な細胞型を標的とすることを目的としたキャリアにとって特に問題になる可能性があります。逆に、LNPは非常に効果的に標的化することができますが、RNA貨物は機能しない可能性があります。貨物の機能を測定するだけのダウンストリームアッセイでは、これら2つの状況を区別できないため、キャリアドラッグデリバリーシステムの開発と最適化が複雑になります。
この作業では、キャリア の関連付け を絶対的に定量化する方法について説明します。会合は、担体と細胞との間の相互作用の実験的に測定された程度を指す用語である。会合は膜結合とインターナリゼーションを区別しない−担体は、それが細胞表面に結合しているため、または細胞がそれをインターナリゼーションしたために会合し得る。会合は、通常、細胞キャリアインキュベーション実験の一部として測定されます。歴史的に、関連性は任意の蛍光単位(典型的には「蛍光強度の中央値」またはMFI)または「パーセントアソシエーション」のいずれかで報告されており、その限界は以前に議論されている指標です6。要するに、これらの測定値は、実験プロトコル、フローサイトメーターの設定、および異なるキャリアの標識強度の違いにより、実験、実験室、および薬物キャリア間で比較できません。サイトメーターを較正し、それによってMFIの相対測定値を蛍光の絶対定量的測定値に変換することにより、前者を克服するための努力がなされてきました7。しかしながら、この方法は、様々なキャリアの標識強度の変動を考慮していないため、選択した標的細胞における様々なキャリア性能の合理的な比較はできない8。
ここで、相対的な任意の蛍光単位から「細胞当たりのキャリア数」の絶対定量的測定基準に実際的に変換する方法は、少数の追加の特性評価実験を行うことによって実証される。キャリア濃度の別のメトリック(例えば、細胞当たりのキャリア質量または細胞当たりのキャリア体積)が望まれる場合、キャリア特性評価が行われていれば、細胞当たりのキャリアから変換することは容易である。簡潔にするために、専門用語を避けるために、この作品では「キャリア」という言葉を使用して、膨大な品揃えのドラッグデリバリー構造を指します。これらの定量技術は、ナノエンジニアリングされた金粒子またはバイオエンジニアリングされた細菌に適用されるかどうかにかかわらず、等しく適用できます。
いくつかの事実により、任意の蛍光単位から細胞当たりの担体への変換が可能になります。まず、測定された蛍光強度は、蛍光が装置の検出限界内にあり、機器設定が同じであると仮定して、蛍光色素9 (または蛍光標識された担体)の濃度に比例します。したがって、担体の蛍光とサンプルの蛍光がわかっている場合、すべての測定が同じ設定および条件下で行われた場合、そのサンプルに存在するキャリアの数を決定できます。ただし、特に小型のキャリアの場合、キャリア蛍光、細胞自家蛍光、および細胞会合蛍光を同じ装置で同じ設定で測定できない場合があります。この場合、ある装置で測定された蛍光と別の装置で測定された蛍光の間で変換できるようにするという2番目の要件があります。そのために、蛍光色素濃度の標準曲線を確立して、当量可溶性蛍光色素分子(MESF)標準9を利用して、両方の機器の蛍光強度を測定することができます。これにより、次いで、非サイトメーター上でのキャリア蛍光のバルクの測定が可能になり、任意のサイズまたは特性のキャリア上で行うことができる測定が可能になります。このようなバルク定量が既知の濃度の担体懸濁液に対して行われる場合、サンプルの細胞当たりの担体の数を、もう一度計算することができる。
この研究は、キャリア会合(測定された蛍光強度によって決定される)を測定するプロセスを実証しているが、細胞-キャリア相互作用の他の測定(例えば、インターナライズドキャリアと膜結合キャリアを区別する実験プロトコル)についても同様のプロトコルを実行することができる。さらに、このプロトコルは、非蛍光アッセイ(例えば、マスサイトメトリー)によって関連が測定された場合、ほぼ同じであろう。
Protocol
Representative Results
Discussion
薬物キャリアと細胞の間の相互作用を特徴づけることは、新しい薬物送達システムの開発においてますます重要になっています。具体的には、様々な担体構築物の合理的な評価および比較を可能にするために、標的細胞およびオフ標的細胞と相互作用する前記担体の性能の絶対定量化が重要である。このプロトコルは、薬物キャリアを扱う研究者が、細胞キャリアの会合に関する相対的な半?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRC;プログラム助成金番号GNT1149990)、オーストラリアHIVおよび肝炎ウイルス学研究センター(ACH2)、およびレジェーンルイーズラングロワの不動産からの贈り物。FCは、国立保健医療研究評議会(NHMRC)のシニアプリンシパルリサーチフェローシップ(GNT1135806)の授与を認めています。図 1 と 図 2 は BioRender.com を使用して作成されました。
Materials
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Invitrogen | A20347 | pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies |
| Apogee A50 Microflow | Apogee | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting | |
| CytoFLEX S Flow Cytometer | Beckman Coulter | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments | |
| FCS Express | De Novo Software | Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python | |
| Infinite 200 PRO | Tecan Lifesciences | Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment | |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis | |
| Prism 8 | GraphPad | Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others | |
| Quantum MESF kits Alexa Fluor 647 | Bangs Laboratories | 647 | Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard |
References
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