Quantificazione sperimentale delle interazioni tra sistemi di somministrazione di farmaci e cellule in vitro: una guida per la valutazione preclinica della nanomedicina

Summary

Viene dimostrato un flusso di lavoro per la quantificazione assoluta delle interazioni farmaco-cellula trasportatrice utilizzando la citometria a flusso per consentire una migliore valutazione razionale di nuovi sistemi di somministrazione di farmaci. Questo flusso di lavoro è applicabile ai vettori di droga di qualsiasi tipo.

Abstract

Una componente importante della progettazione di sistemi di somministrazione di farmaci riguarda come amplificare o attenuare le interazioni con specifici tipi di cellule. Ad esempio, un chemioterapico potrebbe essere funzionalizzato con un anticorpo per migliorare il legame alle cellule tumorali (“targeting”) o funzionalizzato con glicole polietilenico per aiutare a eludere il riconoscimento delle cellule immunitarie (“stealth”). Anche a livello cellulare, ottimizzare il legame e l’assorbimento di un vettore di farmaci è un problema di progettazione biologica complesso. Pertanto, è importante separare la forza con cui un nuovo vettore interagisce con una cella dall’efficacia funzionale del carico di un vettore una volta consegnato a quella cella.

Per continuare l’esempio chemioterapico, “quanto bene si lega a una cellula tumorale” è un problema separato da “quanto bene uccide una cellula tumorale”. I saggi quantitativi in vitro per questi ultimi sono ben consolidati e di solito si basano sulla misurazione della vitalità. Tuttavia, la maggior parte delle ricerche pubblicate sulle interazioni cellula-vettore è qualitativa o semiquantitativa. Generalmente, queste misurazioni si basano sull’etichettatura fluorescente del vettore e, di conseguenza, riportano interazioni con le cellule in unità relative o arbitrarie. Tuttavia, questo lavoro può essere standardizzato ed essere reso assolutamente quantitativo con un piccolo numero di esperimenti di caratterizzazione. Tale quantificazione assoluta è preziosa, in quanto facilita confronti razionali, inter- e intra-classe di vari sistemi di somministrazione di farmaci: nanoparticelle, microparticelle, virus, coniugati anticorpo-farmaco, cellule terapeutiche ingegnerizzate o vescicole extracellulari.

Inoltre, la quantificazione è un prerequisito per successive meta-analisi o approcci di modellazione in silico . In questo articolo vengono presentate le guide video e un albero decisionale su come ottenere la quantificazione in vitro per i sistemi di somministrazione di farmaci carrier, che tengono conto delle differenze nelle dimensioni del vettore e nella modalità di etichettatura. Inoltre, vengono discusse ulteriori considerazioni per la valutazione quantitativa dei sistemi avanzati di somministrazione di farmaci. Questo è destinato a servire come una risorsa preziosa per migliorare la valutazione razionale e la progettazione per la prossima generazione di medicina.

Introduction

La progettazione di costrutti di somministrazione di farmaci che mostrano un comportamento specifico e progettato a seconda del tipo di cellula che incontrano ha attirato un notevole interesse di ricerca. I potenziali costrutti di somministrazione di farmaci o “vettori” includono formulazioni lipidiche, inorganici nano-coltivati, assemblaggi polimerici, vescicole extracellulari, cellule batteriche funzionalizzate o virus modificati. Tutti questi possono mostrare specificità di organi, tessuti o cellule a causa di proprietà fisiche, proprietà superficiali o funzionalizzazioni chimiche ingegnerizzate come l’attacco anticorpale ^1,2.

Un passo quasi onnipresente nella valutazione del vettore in vitro è quello di incubare le cellule con una sospensione contenente detto vettore caricato di farmaco. Dopo l’incubazione, le prestazioni del vettore vengono misurate tramite una lettura funzionale delle prestazioni del carico di droga, ad esempio l’efficienza di trasfezione o la tossicità. Le letture funzionali sono utili, in quanto sono una misura a valle dell’efficacia del vettore. Tuttavia, per costrutti di somministrazione di farmaci più complessi, è sempre più importante andare oltre le letture funzionali e quantificare separatamente il grado di interazione del vettore con la cellula di interesse. Ci sono alcune ragioni per questo.

In primo luogo, c’è un crescente interesse nella scoperta (e nel miglioramento iterativo) di tecnologie di trasporto “piattaforma”, che possono trasportare una varietà di merci. Ad esempio, le nanoparticelle lipidiche (LNP) progettate per incapsulare l’RNA possono scambiare una sequenza di RNA con un’altra con pochi avvertimenti³. Pertanto, per migliorare iterativamente la tecnologia del vettore, è fondamentale quantificarne le prestazioni indipendentemente dalla funzionalità del carico. In secondo luogo, le letture funzionali potrebbero non essere semplici per il carico di interesse, compromettendo la capacità di iterare e valutare rapidamente le formulazioni del vettore. Mentre si potrebbe eseguire l’ottimizzazione in vitro utilizzando un modello di carico con una semplice lettura funzionale (ad esempio, fluorescenza), la modifica del carico può cambiare la risposta biologica a un vettore⁴ e può, quindi, non produrre risultati rappresentativi. In terzo luogo, molti portatori sono progettati per interagire ed essere assorbiti da un tipo di cellula specifico. Tale capacità di targeting di un vettore può e deve essere differenziata dalle prestazioni del suo targeting terapeutico del carico di carico. Per continuare l’esempio LNP, un carico di RNA potrebbe essere estremamente potente, ma se l’LNP non è in grado di legarsi alla cellula, essere internalizzato e rilasciare l’RNA, non si osserverà alcun effetto funzionale a valle. Questo può essere un problema in particolare per i portatori destinati a colpire tipi di cellule difficili da trasfettare, come le cellule T⁵. Al contrario, un LNP potrebbe colpire in modo estremamente efficace, ma il carico di RNA potrebbe non funzionare. Un test a valle che si limiti a misurare la funzionalità del carico non sarà in grado di distinguere tra queste due situazioni, complicando così lo sviluppo e l’ottimizzazione dei sistemi di somministrazione di farmaci carrier.

In questo lavoro, viene discusso come quantificare assolutamente l’associazione del vettore. Associazione è un termine che si riferisce al grado di interazione misurato sperimentalmente tra un vettore e una cellula. L’associazione non distingue tra legame di membrana e internalizzazione: un vettore può essere associato perché è legato alla superficie cellulare o perché la cellula l’ha interiorizzata. L’associazione è comunemente misurata come parte degli esperimenti di incubazione del vettore cellulare. Storicamente, l’associazione è stata riportata sia in unità fluorescenti arbitrarie (tipicamente “intensità di fluorescenza mediana” o MFI) o come “associazione percentuale”, metriche le cui limitazioni sono state precedentemente discusse⁶. In breve, queste misurazioni non sono comparabili tra esperimenti, laboratori e vettori di farmaci a causa delle differenze nei protocolli sperimentali, nelle impostazioni del citometro a flusso e nelle intensità di etichettatura dei diversi vettori. Sono stati fatti sforzi per superare il primo calibrando il citometro, convertendo così la misura relativa delle IFM in una misura assolutamente quantitativa della fluorescenza⁷. Tuttavia, questo metodo non tiene conto della variabilità dell’intensità di etichettatura dei vari vettori e, quindi, non consente il confronto razionale delle varie prestazioni del vettore in una cella target di scelta⁸.

Qui, come convertire praticamente da unità fluorescenti relative e arbitrarie alla metrica quantitativa assoluta del “numero di portatori per cella” è dimostrato eseguendo un piccolo numero di ulteriori esperimenti di caratterizzazione. Se si desidera un’altra metrica di concentrazione del vettore (ad esempio, massa portante per cella o volume portante per cella), è semplice convertire da portatori per cella, a condizione che sia stata eseguita la caratterizzazione del vettore. Per brevità e per evitare il gergo, la parola “vettore” è usata all’interno di questo lavoro per riferirsi al vasto assortimento di costrutti di somministrazione di farmaci. Queste tecniche di quantificazione sono ugualmente applicabili, sia applicate a una particella d’oro nano-ingegnerizzata o a un batterio bio-ingegnerizzato.

Alcuni fatti consentono la conversione da unità fluorescenti arbitrarie a vettori per cella. In primo luogo, l’intensità di fluorescenza misurata è proporzionale alla concentrazione di un fluoroforo⁹ (o di un vettore marcato con fluorescenza), supponendo che la fluorescenza rientri nei limiti di rilevazione dello strumento e che le impostazioni della strumentazione siano le stesse. Pertanto, se la fluorescenza di un vettore e la fluorescenza di un campione sono note, si può determinare quanti portatori sono presenti in quel campione se tutte le misurazioni sono state eseguite nelle stesse impostazioni e condizioni. Tuttavia, soprattutto per i vettori più piccoli, potrebbe non essere possibile misurare la fluorescenza del vettore, l’autofluorescenza cellulare e la fluorescenza associata alle cellule sullo stesso strumento con le stesse impostazioni. In questo caso, esiste un secondo requisito per rendere possibile la conversione tra fluorescenza misurata su uno strumento e fluorescenza misurata su un altro. Per fare ciò, è possibile stabilire una curva standard della concentrazione di fluorofori per misurare l’intensità della fluorescenza su entrambi gli strumenti, sfruttando lo standard MESF (Molecules of Equivalent Solubili Fluorochrome)⁹. Ciò consente quindi la misurazione della fluorescenza del vettore in massa su un non citometro, una misurazione che può essere eseguita su portatori di qualsiasi dimensione o caratteristica. Quando tale quantificazione di massa viene effettuata su una sospensione portante di concentrazione nota, il numero di portatori per cellula di un campione può, ancora una volta, essere calcolato.

Mentre questo lavoro dimostra il processo per misurare l’associazione dei portatori (come determinato dall’intensità di fluorescenza misurata), un protocollo analogo potrebbe essere eseguito per altre misure di interazione cellula-vettore (ad esempio, un protocollo sperimentale che differenzia i portatori internalizzati e legati alla membrana). Inoltre, questo protocollo sarebbe in gran parte lo stesso se l’associazione fosse misurata attraverso un saggio non fluorescente (ad esempio, attraverso la citometria di massa).

Protocol

1. Scegliere il flusso appropriato Seguire l’albero decisionale descritto nella Figura 1 per determinare il flusso di lavoro migliore (flusso) (Figura 2) per la configurazione sperimentale utilizzata. Fare riferimento alla discussione per ulteriori commenti su questa scelta di flusso. Se si segue il flusso del citometro, continuare con i passaggi 2.1.1-2.2.7. Se si segue il flusso di massa, continuare con i passaggi 3.1.1.1-3…

Representative Results

Come discusso in precedenza, diversi tipi di vettori di farmaci richiedono l’uso di tecniche diverse per la quantificazione assoluta dell’associazione cellula-vettore. Ad esempio, le particelle del guscio centrale di poli(acido metacrilico) (PMASH) stabilizzate con disolfuro a 633 nm sono abbastanza grandi e dense per il rilevamento utilizzando un citometro a flusso sensibile. Come tali, queste particelle sono state etichettate in modo fluorescente, quindi controllate e contate utilizzando la diffusione della …

Discussion

La caratterizzazione delle interazioni tra vettori di farmaci e cellule sta diventando sempre più importante nello sviluppo di nuovi sistemi di somministrazione di farmaci. In particolare, per consentire la valutazione razionale e il confronto di vari costrutti di portatori, è fondamentale quantificare in modo assoluto le prestazioni di detto vettore per interagire con cellule target e off-target. Questo protocollo descrive una metodologia a due flussi che consente a qualsiasi ricercatore che lavora con un vettore di f…

Materials

Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies
Apogee A50 Microflow	Apogee		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments
FCS Express	De Novo Software		Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis
Prism 8	GraphPad		Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard