Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyse af sult-induceret autofagi i Drosophila melanogaster Larve Fat Body

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64282
Automatic Translation
1, 1
1Ministry of Education Key Laboratory of Biosystems Homeostasis and Protection and Innovation Center for Cell Signaling Network, Life Sciences Institute, Zhejiang University

Summary

Denne protokol beskriver induktion af autofagi i Drosophila melanogaster larvefedtlegemet via næringsstofudtømning og analyserer ændringer i autofagi ved hjælp af transgene fluestammer.

Abstract

Autofagi er en cellulær selvfordøjelsesproces. Det leverer last til lysosomerne til nedbrydning som reaktion på forskellige belastninger, herunder sult. Fejlen i autofagi er forbundet med aldring og flere menneskelige sygdomme. Autofagimaskineriet er meget bevaret - fra gær til mennesker. Larvefedtlegemet af Drosophila melanogaster, en analog til hvirveldyrlever og fedtvæv, giver en unik model til overvågning af autofagi in vivo. Autofagi kan let induceres af næringsstof sult i larvefedtkroppen. De fleste autofagi-relaterede gener bevares i Drosophila. Mange transgene fluestammer, der udtrykker mærkede autofagimarkører, er blevet udviklet, hvilket letter overvågningen af forskellige trin i autofagiprocessen. Den klonale analyse muliggør en tæt sammenligning af autofagimarkører i celler med forskellige genotyper i samme stykke væv. Den nuværende protokol beskriver procedurer for (1) generering af somatiske kloner i larvefedtlegemet, (2) inducering af autofagi via aminosyresult og (3) dissekering af larvefedtlegemet med det formål at skabe en model til analyse af forskelle i autofagi ved hjælp af en autofagosommarkør (GFP-Atg8a) og klonal analyse.

Introduction

Autofagi er en "selvspisende" proces induceret af forskellige belastninger, herunder aminosyre sult1. Makroautofagi (i det følgende benævnt autofagi) er den mest velundersøgte type autofagi og spiller en uerstattelig rolle i opretholdelsen af cellulær homeostase2. Fejlen i autofagi er forbundet med flere menneskelige sygdomme3. Derudover er nogle autofagi-relaterede gener potentielle mål for behandling af forskellige sygdomme4.

Autofagi reguleres på en meget sofistikeret måde5. Ved sult sekvestrerer isolationsmembranerne cytoplasmatiske materialer til dannelse af dobbeltmembranerede autofagosomer6. Autofagosomer smelter derefter sammen med endosomer og lysosomer for at danne amfisomer og autolysosomer. Ved hjælp af lysosomale hydrolytiske enzymer nedbrydes det opslugte cytoplasmatiske indhold, og næringsstofferne genbruges7.

Autofagi er en evolutionært bevaret proces8. Drosophila melanogaster er en fantastisk model til at studere autofagiprocessen in vivo. Aminosyre sult inducerer let autofagi i fluefedt kropsvæv, en analog af humant lever og fedtvæv9. Defekter i autofagi forstyrrer de forskellige punktmønstre af flere autofagi-relaterede proteiner, såsom Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 og p62, blandt andre10. Derfor vil analyse af mønstrene af disse autofagimarkører hjælpe med at skelne forekomsten af autofagifejl og det defekte autofagitrin. For eksempel er det ubiquitinlignende protein Atg8 den mest almindeligt anvendte autofagimarkør11. I Drosophila melanogaster er transgene stammer med et grønt fluorescerende protein (GFP)-mærket Atg8a blevet udviklet med succes12. GFP-Atg8a diffunderes i cytosolen og kernerne i de fodrede celler. Ved sult behandles og modificeres GFP-Atg8a af phosphatidylethanolamin (PE) og danner puncta, som mærker isolationsmembranerne og fuldt udviklede autofagosomer13,14. Gennem direkte fluorescensmikroskopi kan autofagiinduktionen let observeres som en stigning i GFP-Atg8 punktdannelse15. Atg8a puncta ville ikke dannes som reaktion på sult i nærvær af en autofagi initieringsdefekt. Da GFP-Atg8a kan slukkes og fordøjes af den lave pH i autolysosomer, kan GFP-Atg8a punktik stige i antal, hvis autofagi blokeres i sene stadier16.

Da autofagi er meget følsom over for ernæringstilgængelighed17, fører små forskelle i dyrkningsforhold ofte til variationer i fænotyper. Derfor har klonal analyse, en metode, der analyserer mutante celler versus vildtypekontrolceller i samme væv, en stor fordel ved dissekering af autofagidefekter18. Ved at udnytte flippase/flippase-genkendelsesmål (FLP/FRT)-medieret stedspecifik rekombination mellem homologe kromosomer fremstilles fluer, der bærer mosaikvæv, let19,20. Vildtypecellerne omkring mutantcellerne danner en perfekt intern kontrol for at undgå individuelle forskelle21.

Denne undersøgelse beskriver, hvordan man inducerer autofagi ved aminosyresult og genererer GFP-Atg8a-ekspresserende mosaikfedt kropsvæv. Disse protokoller kan bruges til at analysere forskelle i autofagi blandt mutante kloner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Drosophila krydsning og æglægning

  1. Der indføres 3 hanfluer (genotype hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) og 15 hunner (genotype y' w* Mu FRT19A/FM7, Kr GFP ) voksne fluer (se materialetabellen) i et hætteglas med majsmel/melasse/agar Drosophila media ved 25 °C) til parring.
    BEMÆRK: Flere hætteglas med kultur af samme kryds skal opstilles for at sikre nok larver til yderligere forsøg. Den mandlige fluestamme med genotype hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a bærer et FRT-sted ved X-kromosomet nær centromeren (FRT19A). Det udtrykker også FLP ved varmechok ved 37 °C. Et transgen med allestedsnærværende RFP-ekspression indsættes på X-kromosomet. GFP-Atg8a udtrykkes under kontrol af cgGal4 i larvefedtlegemet22. Den kvindelige fluestamme med genotype y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP bærer en dødelig mutation (Mu) og FRT19A på X-kromosomet. Den detaljerede krydsningsplan er vist i figur 1.
  2. Til æglægning overføres fluerne til et nyt hætteglas. 48 timer efter introduktionen bankes hætteglasset "parring", indtil fluerne er bedøvede, og falder ned på mediet i bunden af hætteglasset.
    1. Tag stikket ud af hætteglasset med parring, og dæk munden med et omvendt hætteglas, der ikke er tilsluttet, med friske medier (hætteglas med frisk kultur). Overfør derefter fluerne til hætteglasset med frisk kultur ved at vende og banke på hætteglassene.
    2. Tilslut hætteglasset med frisk kultur (med de overførte fluer), og kassér det gamle hætteglas. Dette hætteglas med frisk kultur anbringes i en 25 °C inkubator til æglægning på det friske medie.
      BEMÆRK: Forvarmning af hætteglassene med frisk kultur til 25 °C i 15 minutter før flueoverførselsprocessen hjælper fluerne med hurtigt at tilpasse sig det nye miljø og fremskynde æglægningen.
  3. Fjern fluerne efter 6 timers æglægning. Hvis forsøgene skal gentages, overføres disse fluer til et andet hætteglas med kultur (som beskrevet i trin 1.2). Ellers kasseres fluerne ved at dumpe dem i en kolbe indeholdende 75% ethanol).
    1. Inkuber hætteglasset med embryoner i et 37 °C vandbad i 1 time for at fremkalde FLP-ekspression. Derefter anbringes de i en 25 °C inkubator og lader embryonerne fortsætte med at udvikle sig.
      BEMÆRK: Den vellykkede dannelse af mutante kloner kan bekræftes efterfølgende gennem billeddannelse. Fraværet af RFP-signaler markerer de mutante kloner.

2. Aminosyre sult inducerer autofagi

  1. Brug en laboratoriespatel til at øse mediet, der indeholder de udviklende larver, ud i en petriskål 75 timer efter æglægning. Tilsæt 3 ml 1x PBS til fadet og adskil forsigtigt kulturmediet og larverne med lange pincet. Vælg 10 til 15 tidlige tredje stjernelarver.
    BEMÆRK: Tidlige tredje stjernelarver skal vælges omhyggeligt. Larvernes udviklingstrin er afgørende for denne protokols succes. På grund af den begrænsede æglægningsvarighed forventes de fleste larver i kulturhætteglasset at være i det tidlige tredje instar-stadium ved 75 timers inkubation. Imidlertid kan forskellige kulturmedieopskrifter føre til variationer i larvernes udviklingstid. Kriterierne for at skelne mellem tidlige tredje instar larver er kropslængden, tilstedeværelsen af forreste og bageste spirakler samt mundapparatets mandibulære kroge23.
  2. Fyld brøndene på en 9-brønds glasfordybningsplade (se materialetabel) med 1x PBS. Placer de adskilte tredje stjernelarver i brøndene ved hjælp af lange tang og vask larverne grundigt for at fjerne alle medierester.
  3. Tag 5 ml 20% saccharose (i 1x PBS) opløsning i et tomt hætteglas og læg de rene tredje stjernelarver i denne opløsning med lange pincet. Inkuber hætteglasset i en 25 °C inkubator i 6 timer, før de høstes til dissektion.
    BEMÆRK: 20% saccharose (i 1x PBS) opløsning tjener som aminosyre-mangelfuld sultemedium.

3. Tredje instar larver dissektion og prøve vævsbehandling

  1. Skærp to par #5 tang (se materialetabel) jævnt på begge sider med en slibesten.
  2. Tilsæt 400 μL 1x PBS i hver brønd i 9-brønds glasfordybningspladen, og overfør larverne til brøndene med lange pincet. Placer en larve i en brønd med den dorsale side (siden med luftrøret) opad.
    1. Tag fat i larvens neglebånd med to #5 tang i midten af larvestammen og riv forsigtigt neglebåndene op. De udsatte fedtlegemer sammen med andre indre larvevæv vil stadig være fastgjort til larvens kroppe. Træk nok til at udsætte de indre organer så meget som muligt. Gentag dette trin for alle larverne.
      BEMÆRK: Hver larve har to store stykker fedtkrop langs kropsstammen. Fedt kropsvæv er et hvidt, uigennemsigtigt og fladt monolag, der let kan skelnes under dissektionsmikroskopet24.
  3. Overfør larvekroppen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 500 μL 4% paraformaldehyd (PFA). Der inkuberes i 30 minutter ved 25 °C uden at ryste glassene.
    FORSIGTIG: 4% PFA er giftigt. Brug handsker og masker til beskyttelse.
    BEMÆRK: Det anbefales at klargøre 4% PFA i 1x PBS-buffer. PFA-pulver opløses ikke øjeblikkeligt i 1x PBS. Blandingen skal derfor inkuberes ved 65 °C i en inkubator natten over eller omrystes periodisk i 45 minutter ved 25 °C.
  4. Efter 30 minutters inkubation af slagtekroppen med 4% PFA pipetteres PFA-opløsningen ud, tilsættes 500 μL 1x PBS i røret, og røret rystes forsigtigt på en flad rotator i 10 minutter, før 1x PBS-opløsningen kasseres (gentag 3x).
  5. Brug lange pincet til at overføre den faste og vaskede larvekrop til en brønd i 9-depression pletpladen fyldt med 1x PBS. Brug # 5 tang, fjerne alle de fedtfri kropsvæv.
  6. Brug # 5 tang til at montere stykkerne af fedtlegemet på et mikroskopglas ved hjælp af 80% glycerol som monteringsmedium og læg et dæksel ovenpå.
    BEMÆRK: Før montering skal du kontrollere pH-værdien af 80% glycerol (ved hjælp af pH-papir, pH = 7 er optimal) for at beskytte GFP-signalet. Monteringsmedier (se materialetabel) med DAPI i 80% glycerol hjælper med at billeddannelse af kernerne i fedtkropsceller. Disse dias er stabile i 1 uge, når de opbevares mørkt ved 4 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Under fodrede betingelser diffunderes det GFP-mærkede ubiquitinlignende protein, GFP-Atg8a, inde i cellerne. Ved sult danner den grøn punktering og mærker autofagosomer. Når autofagosomer smelter sammen med lysosomer, slukkes GFP i de sure autolysosomer, og den grønne punktik forsvinder. Hvis autofagi ikke induceres, eller autofagosommodningen accelereres, forventes antallet af GFP-punktering at være lavt. Men hvis fusionen mellem autofagosomer og lysosomer blokeres, eller autolysosomets pH bliver basisk, forventes antallet og/eller størrelsen af GFP-punktet at være højt.

I protokollen, der præsenteres her, inducerer FLP / FRT-systemet mitotisk rekombination og genererer væv med både vildtype- og mutantceller. Mens vildtypecellerne udtrykker RFP, mangler mutantcellerne RFP-udtryk. Ekspressionen af RFP i alle fedtkropsceller indikerer, at FLP / FRT-medieret mitotisk rekombination ikke blev induceret med succes, eller at mutationen er celledødelig. I sidstnævnte tilfælde (dvs. hvis mutationen er celledødelig), forventes larvefedtlegemet at have nogle få celler med RFP-signaler på højere niveau end de omgivende celler.

I figur 2 dannede GFP-Atg8a (grøn) puncta i vildtypeceller (rød), hvilket antyder, at autofagi blev induceret med succes. I de mutante kloner (RFP-negativ) var mønsteret af GFP-Atg8a puncta forskelligt fra det i de omgivende vildtypeceller, hvilket tyder på autofagifejl. Meget få GFP-ATG8a punkterede blev påvist i Mu1-mutante kloner (figur 2B), hvilket indikerer, at autofagi blev blokeret ved initieringstrinnene eller accelereret autolysosommodning. Antallet og størrelsen af GFP-Atg8a puncta blev stærkt øget i Mu2-mutante kloner (figur 2C), hvilket tyder på autofagosom-lysosomfusion eller autolysosomforsuringsdefekter. Yderligere eksperimenter er nødvendige for at skelne mellem disse muligheder. Desuden skal størrelsen og antallet af punkterede punkter kvantificeres for at afgøre, om de observerede forskelle er statistisk signifikante.

Figure 1
Figur 1: Skematisk gengivelse af de eksperimentelle procedurer til overvågning af autofagimarkøren GFP-Atg8a i et mosaiklarvefedtlegeme, der bærer mutante kloner. Krydsningsskemaet til generering af fluer, der udtrykker GFP-Atg8a i larvefedtets kropsvæv og bærer mutante kloner, er vist (en stamme med en dødelig punktmutation [Mu] på X-kromosomet tjener som et eksempel). Efter varmechok ved 37 °C i 1 time for at aktivere FLP-ekspression kan de homozygote mutantceller med GFP-Atg8a-ekspression genereres i y' w* Mu FRT19A / hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a / + larvefedtlegeme. Autofagi induceres i fedtlegemet ved at inkubere larverne i 20% saccharoseopløsning i 6 timer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Mønstrene af GFP-Atg8a puncta i Mu1- og Mu2-kloner adskilte sig fra dem i kontrolklonerne. Mu1 og Mu2 er to uafhængige dødelige mutanter på X-kromosomet. Isogeniseret y 'w *, FRT19A fluer tjener som kontrol. GFP-Atg8a (grønne) mønstre blev analyseret i kontrol-, Mu1- eller Mu2-mosaiklarvefedtlegemerne. De mutante kloner (eller kontrolkloner) blev negativt markeret af RFP (rød). (A) I kontrolklonerne (RFP-negativ) lignede mønstrene for GFP-Atg8a puncta dem i de omgivende RFP-positive celler. (B) I Mu1-mutantkloner (RFP-negative) blev GFP-Atg8a-punkteringen stærkt reduceret. (C) I Mu2-mutantkloner (RFP-negative) blev antallet og størrelsen af GFP-Atg8a-punktering øget. Skalabjælke: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver metoderne til (1) at generere fluer, der bærer mutante kloner i larvefedtlegemerne, (2) inducere autofagi gennem aminosyresult og (3) dissekere larvefedtlegemerne. For at generere kloner med succes i larvefedtlegemerne skal følgende kritiske trin udføres flittigt. (1) Timing af varmechokket nøjagtigt er afgørende, fordi mitotisk rekombination kun sker, når vævet gennemgår mitose, og (2) både varmechoktemperatur og varighed er kritiske for at inducere FLP-ekspression. Et standard 37 °C vandbad til 1 times varmechok anbefales. I betragtning af den øgede mulighed for embryon-/larvedød under varmechok og sult skal der etableres flere krydsninger for at generere tilstrækkelige vævsprøver til billeddannelse.

Derudover kan det være nødvendigt at ændre nogle trin i betragtning af de faktiske dyrkningsforhold. For eksempel kan forskellene i miljø og Drosophila-kulturmedier mellem laboratorier påvirke larvernes vækstrater. Derfor kan det være nødvendigt at standardisere den udviklingstid, der kræves for embryoner at nå det tidlige tredje instar-stadium, og varigheden af larvesult (dyrkning i 20% saccharose for at fremkalde autofagi) i hvert laboratorium separat.

GFP-Atg8a er den mest almindeligt anvendte markør til bestemmelse af autofagi. Ændringerne i GFP-Atg8a punktmønsteret undlader imidlertid at lokalisere den nøjagtige autofagifejl eller det berørte trin direkte. Derfor skal flere markører analyseres for at fortolke sådanne data nøjagtigt. Protokollen, der præsenteres her, kan tilpasses til andre autofagirelaterede proteiner med deres respektive transgene stammer25. Flere markører mærket med forskellige fluorescerende proteiner (såsom blåt fluorescensprotein [BFP]) kan analyseres samtidigt for at belyse initierings- eller fusionsprocesserne. Kontrolleret autofagimodifikation ved hjælp af kemikalier26 eller RNA-interferens af kritiske gener27 kan kombineres med den nuværende tilgang til at belyse autofagimekanismer yderligere. Derudover er det vigtigt at analysere endogene proteinmarkører for autofagi (ved anvendelse af immunhistokemi) i mosaikvæv for at bekræfte fænotyperne28.

Selvom autofagi oprindeligt blev anerkendt som en tilfældig, ikke-selektiv proces, indikerer stigende beviser, at den kan være selektiv og selektivt nedbryder cytoplasmatiske organeller såsom mitokondrier og det endoplasmatiske retikulum, blandt andre29. Endvidere kan proceduren beskrevet her anvendes til at udforske selektiv autofagi. For eksempel kan mitofagi overvåges i fluefedtlegemer ved at binde fluorescerende proteiner (såsom Keima eller GFP-RFP tandemtags) til en mitokondriel målretningssekvens30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for THFC og BDSC for at levere fluestammerne. Dr. Tong Chao støttes af National Natural Science Foundation of China (32030027, 91754103, 92157201) og grundlæggende forskningsmidler til de centrale universiteter. Vi takker kernefaciliteten i Life Sciences Institute (LSI) for at levere tjenester.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-150-C
#5 Forceps Dumont RS-5015
9 Dressions Spot plate PYREX 7220-85
Fluorescence Microscope Nikon SMZ1500
Glycerol Sangon Biotech A100854-0100
KCl Sangon Biotech A610440-0500 Composition of 1x PBS solution
KH2PO4 Sangon Biotech A600445-0500 Composition of 1x PBS solution
Laboratory spatula Fisher 14-375-10
Long forceps R' DEER RST-14
Microscope cover glass CITOTEST 80340-1130
Microscope slides CITOTEST 80302-2104
Na2HPO4 Sangon Biotech A501727-0500 Composition of 1x PBS solution
NaCl Sangon Biotech A610476-0005 Composition of 1x PBS solution
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Petri dish Corning 430166
Standard cornmeal/molasses/agar fly food Tong Lab-made
Stereo microscope Nikon SMZ745
Sucrose Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. 10021418
Vectashield antifade mounting medium with DAPI Vectorlabratory H-1200-10 Recommended mounting medium
Fly stocks
y'w* Iso FRT19A Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP Tong Lab's fly stocks
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a Tong Lab's fly stocks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
  2. Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
  3. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  4. Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
  5. Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
  6. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
  7. Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
  8. Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
  9. Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
  10. Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
  11. Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
  12. Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
  13. Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
  14. Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
  15. Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
  16. Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
  17. Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
  18. Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
  19. Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
  20. Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
  21. Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
  22. Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
  23. Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. New York, NJ. (1965).
  24. Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
  25. Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
  26. Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
  27. Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
  28. Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
  29. Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
  30. Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 186
Analyse af sult-induceret autofagi i <em>Drosophila melanogaster</em> Larve Fat Body
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, K., Tong, C. Analyzing… More

Shi, K., Tong, C. Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body. J. Vis. Exp. (186), e64282, doi:10.3791/64282 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter