מיקרו-הזרקות חדריות למוח של ליפופוליסכריד לדגי זברה זחליים להערכת דלקת עצבית ורעילות עצבית
Summary
פרוטוקול זה מדגים את המיקרו-הזרקה של ליפופוליסכריד לאזור חדר המוח במודל של זחל דג זברה כדי לחקור את התגובה הנוירו-דלקתית והרעילות העצבית המתקבלות כתוצאה מכך.
Abstract
דלקת עצבית היא שחקן מפתח בהפרעות נוירולוגיות שונות, כולל מחלות נוירודגנרטיביות. לכן, יש עניין רב לחקור ולפתח מודלים חלופיים של דלקת עצבית in vivo כדי להבין את התפקיד של דלקת עצבית בניוון עצבי. במחקר זה פותח מודל של דגי זברה זחליים של דלקת עצבית בתיווך מיקרו-הזרקה חדרית של ליפופוליסכריד (LPS) כדי לגרום לתגובה חיסונית ורעילות עצבית. קווי דגי הזברה המהונדסים elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP ו- mpo:EGFP שימשו לכימות בזמן אמת של כדאיות נוירונים במוח על ידי הדמיה חיה פלואורסצנטית המשולבת עם ניתוח עוצמת פלואורסצנטיות. ההתנהגות התנועתית של זחלי דגי זברה נרשמה באופן אוטומטי באמצעות מקליט מעקב וידאו. התוכן של תחמוצת החנקן (NO), ורמות ביטוי ה-mRNA של ציטוקינים דלקתיים, כולל אינטרלוקין-6 (IL-6), אינטרלוקין-1β (IL-1β) וגורם נמק של גידול אנושי α (TNF-α) נחקרו כדי להעריך את התגובה החיסונית הנגרמת על-ידי LPS בראש דג הזברה. ב 24 שעות לאחר הזרקת חדר המוח של LPS, אובדן של נוירונים וחוסר תנועה נצפו זחלי דגי זברה. בנוסף, דלקת עצבית הנגרמת על ידי LPS הגבירה את שחרור ה-NO ואת ביטוי ה-mRNA של IL-6, IL-1β ו-TNF-α בראש של זחלי דגי זברה לאחר ההפריה (dpf), והביאה לגיוס נויטרופילים במוח של דגי הזברה. במחקר זה, הזרקה של דגי זברה עם LPS בריכוז של 2.5-5 מ”ג/מ”ל ב-5 dpf נקבעה כתנאי האופטימלי לבדיקה פרמקולוגית זו של דלקת עצבית. פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה חדשה, מהירה ויעילה למיקרו-הזרקה של LPS בחדרי המוח כדי לגרום לדלקת עצבית בתיווך LPS ורעילות עצבית בזחל דג זברה, שהיא שימושית לחקר דלקת עצבית ויכולה לשמש גם כבדיקת סינון תרופות in vivo בתפוקה גבוהה.
Introduction
דלקת עצבית תוארה כגורם אנטי-נוירוגני חיוני המעורב בפתוגנזה של מספר מחלות נוירודגנרטיביות של מערכת העצבים המרכזית (CNS)1. בעקבות עלבונות פתולוגיים, דלקת עצבית עלולה לגרום לתוצאות שליליות שונות, כולל עיכוב של נוירוגנזה והשראת מוות של תאי עצב 2,3. בתהליך העומד בבסיס התגובה להשראת דלקת, ציטוקינים דלקתיים מרובים (כגון TNF-α, IL-1β ו-IL-6) מופרשים לחלל החוץ-תאי ופועלים כמרכיבים חיוניים במוות של תאי עצב ובדיכוי של נוירוגנזה 4,5,6.
מיקרו-הזרקה של מתווכי דלקת (כגון IL-1β, L-ארגינין ואנדוטוקסינים) למוח יכולה לגרום להפחתת תאי עצב ולדלקת עצבית 7,8,9. ליפופוליסכריד (LPS, איור 1), אנדוטוקסין פתוגני שנמצא בדופן התא של חיידקים גראם-שליליים, יכול לגרום לדלקת עצבית, להחמיר ניוון עצבי ולהפחית נוירוגנזה בבעלי חיים10. הזרקת LPS ישירות למערכת העצבים המרכזית של מוח העכבר העלתה את הרמות של תחמוצת החנקן, ציטוקינים מעודדי דלקת ומווסתים אחרים11. יתר על כן, הזרקה סטריאוטקסית של LPS לסביבת המוח המקומית עלולה לגרום לייצור מופרז של מולקולות נוירוטוקסיות, וכתוצאה מכך לתפקוד עצבי לקוי ולהתפתחות לאחר מכן של מחלות נוירודגנרטיביות 10,12,13,14,15. בתחום מדעי המוח, תצפיות מיקרוסקופיות חיות ומבוססות זמן על תהליכים תאיים וביולוגיים באורגניזמים חיים הן חיוניות להבנת המנגנונים העומדים בבסיס הפתוגנזה והפעולה הפרמקולוגית16. עם זאת, הדמיה חיה של מודלים עכבריים של דלקת עצבית ורעילות עצבית מוגבלת ביסודה על ידי עומק החדירה האופטי המוגבל של מיקרוסקופיה, המונעת הדמיה תפקודית ותצפית חיה על תהליכים התפתחותיים17,18,19. לכן, פיתוח מודלים חלופיים של דלקת עצבית הוא בעל עניין רב כדי להקל על המחקר של התפתחות פתולוגית, ואת המנגנון העומד בבסיס neuroinflammation ו ניוון עצבי, על ידי הדמיה חיה.
דג זברה (Danio rerio) התגלה כמודל מבטיח לחקר דלקת עצבית וניוון עצבי בשל מערכת החיסון המולדת השמורה אבולוציונית, שקיפות אופטית, גודל מצמד עובר גדול, אחיזה גנטית והתאמה להדמיית in vivo 19,20,21,22,23 . פרוטוקולים קודמים הזריקו LPS ישירות לחדר החלמון והמוח האחורי של דגי זברה זחליים ללא הערכה מכניסטית, או פשוט הוסיפו LPS למי דגים (מדיום תרבית) כדי לגרום לתגובה חיסונית מערכתית קטלנית24,25,26,27. כאן, פיתחנו פרוטוקול למיקרו-הזרקה של LPS לחדרי המוח, כדי לעורר תגובה חיסונית מולדת או רעילות עצבית ב-5 הימים שלאחר ההפריה (dpf) זחלי דגי הזברה. עדות לתגובה זו היא אובדן תאי עצב, גירעון בהתנהגות תנועתית, שחרור מוגבר של תחמוצת ניטריט, הפעלת ביטוי גנים דלקתיים וגיוס נויטרופילים במוח דגי הזברה 24 שעות לאחר ההזרקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמות הולכת וגדלה של נתונים אפידמיולוגיים וניסיוניים מצביעים על זיהומים חיידקיים ונגיפיים כרוניים כגורמי סיכון אפשריים למחלות נוירודגנרטיביות36. הזיהום מעורר את ההפעלה של תהליכים דלקתיים ותגובות חיסוניות מארח37. גם אם התגובה פועלת כמנגנון הגנה, דלקת מופעלת יתר ע…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן לפיתוח מדע וטכנולוגיה (FDCT) של מקאו SAR (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 ו- 0016/2019/AKP), ועדת מחקר, אוניברסיטת מקאו (MYRG2020-00183-ICMS ו- CPG2022-00023-ICMS), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘81803398).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6361 | |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-207 | |
| Fluorescence stereo microscopes | Leica | M205 FA | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | Ver. 7.04 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mx3005P qPCR system | Agilent Technologies | Mx3005P | |
| Nanovue plus spectrophotometer | Biochrom | 80-2140-46 | |
| Nitrite concentration assay kit | Beyotime Biotechnology | S0021M | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Programmable Horizontal Pipette Puller | World Precision Instruments | PMP-102 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Random primers | Takara | 3802 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | |
| SYBR Premix Ex Taq II kit | Accurate Biology | AG11701 | |
| The 3rd Gen Tgrinder | Tiangen | OSE-Y30 | |
| Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm | World Precision Instruments | TW150F-4 | |
| Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| TRNzol Universal reagent | Tiangen | DP424 | |
| Zebrafish tracking box | ViewPoint Behavior Technology |
References
- Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
- Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
- Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
- Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
- Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
- Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
- Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
- Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson’s disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
- Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
- Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson’s disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
- Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
- Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
- Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson’s disease. Parkinson’s Disease. 2011, 327089 (2011).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
- Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
- Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
- Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer’s disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
- Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
- Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
- Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
- Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
- Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9′-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
- He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
- Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- d’Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
- Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
- De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
- Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
- Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
- Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
- Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
- Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
- Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
- Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
- Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
- Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer’s disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer’s Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
- Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
- Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
- Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).
