Ce protocole démontre la micro-injection de lipopolysaccharide dans la région ventriculaire du cerveau dans un modèle larvaire de poisson zèbre pour étudier la réponse neuroinflammatoire et la neurotoxicité qui en résultent.
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Article de méthode
Microinjections ventriculaires cérébrales de lipopolysaccharide dans des larves de poisson-zèbre pour évaluer la neuroinflammation et la neurotoxicité
Dans cet article
Résumé
Résumé
La neuroinflammation est un acteur clé dans divers troubles neurologiques, y compris les maladies neurodégénératives. Par conséquent, il est d’un grand intérêt de rechercher et de développer des modèles alternatifs de neuroinflammation in vivo pour comprendre le rôle de la neuroinflammation dans la neurodégénérescence. Dans cette étude, un modèle larvaire de poisson zèbre de neuroinflammation médiée par microinjection ventriculaire de lipopolysaccharide (LPS) pour induire une réponse immunitaire et une neurotoxicité a été développé et validé. Les lignées de poisson-zèbre transgénique elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP et mpo:EGFP ont été utilisées pour la quantification en temps réel de la viabilité des neurones cérébraux par imagerie en direct par fluorescence intégrée à l’analyse de l’intensité de fluorescence. Le comportement locomoteur des larves de poisson-zèbre a été enregistré automatiquement à l’aide d’un enregistreur de suivi vidéo. La teneur en oxyde nitrique (NO) et les niveaux d’expression de l’ARNm des cytokines inflammatoires, y compris l’interleukine-6 (IL-6), l’interleukine-1β (IL-1β) et le facteur de nécrose tumorale humaine α (TNF-α) ont été étudiés pour évaluer la réponse immunitaire induite par le LPS dans la tête larvaire du poisson zèbre. 24 h après l’injection ventriculaire cérébrale de LPS, une perte de neurones et un déficit de locomotion ont été observés chez les larves de poisson zèbre. De plus, la neuroinflammation induite par le LPS a augmenté la libération de NO et l’expression de l’ARNm de l’IL-6, de l’IL-1β et du TNF-α dans la tête des larves de poisson-zèbre 6 jours après la fécondation (dpf), et a entraîné le recrutement de neutrophiles dans le cerveau du poisson zèbre. Dans cette étude, l’injection de LPS chez le poisson zèbre à une concentration de 2,5 à 5 mg/mL à 5 dpf a été déterminée comme la condition optimale pour ce test pharmacologique de neuroinflammation. Ce protocole présente une nouvelle méthodologie rapide et efficace pour la microinjection de LPS dans le ventricule cérébral afin d’induire une neuroinflammation et une neurotoxicité médiées par le LPS chez une larve de poisson zèbre, ce qui est utile pour étudier la neuroinflammation et pourrait également être utilisé comme test de dépistage de médicaments in vivo à haut débit.
Introduction
La neuroinflammation a été décrite comme un facteur antineurogène crucial impliqué dans la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives du système nerveux central (SNC)1. Suite à des agressions pathologiques, la neuroinflammation peut entraîner diverses conséquences néfastes, notamment l’inhibition de la neurogenèse et l’induction de la mort cellulaire neuronale 2,3. Dans le processus sous-jacent à la réponse à l’induction de l’inflammation, de multiples cytokines inflammatoires (telles que le TNF-α, l’IL-1β et l’IL-6) sont sécrétées dans l’espace extracellulaire et agissent com....
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Protocole
Les lignées de poissons-zèbres de type sauvage AB et de poissons-zèbres transgéniques elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP et mpo:EGFP ont été obtenues auprès de l’Institut des sciences médicales chinoises (ICMS). L’approbation éthique (UMARE-030-2017) pour les expériences sur les animaux a été accordée par le Comité d’éthique de la recherche animale de l’Université de Macao, et le protocole suit les directives institutionnelles en matière de soins aux animaux.
1. Élevage d’embryons et de larves de poisson zèbre
- Générer des embryons de poisson-zèbre (200-300 embryons par accouplement) par accouplement naturel par paires, c....
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Résultats
Le flux de travail décrit ici présente une nouvelle méthodologie rapide et efficace pour induire une neuroinflammation et une neurotoxicité médiées par le LPS chez les larves de poisson zèbre. Dans ce protocole décrit, 5 poissons-zèbres dpf ont été injectés avec du LPS (Figure 1) dans les ventricules cérébraux à l’aide d’un micro-injecteur (Figure 2A-C). La réussite de l’injection dans le site ventricule cérébral a été vérifiée .......
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Discussion
Un nombre croissant de données épidémiologiques et expérimentales impliquent des infections bactériennes et virales chroniques comme facteurs de risque possibles de maladies neurodégénératives36. L’infection déclenche l’activation des processus inflammatoires et des réponses immunitaires de l’hôte37. Même si la réponse agit comme un mécanisme de défense, l’inflammation suractivée est préjudiciable à la neurogenèse, et l’environnement inflammatoire ne permet pas la survie de.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Remerciements
Cette étude a été financée par des subventions du Fonds de développement scientifique et technologique (FDCT) de la RAS de Macao (réf. No. FDCT0058/2019/A1 et 0016/2019/AKP), Comité de recherche, Université de Macao (MYRG2020-00183-ICMS et CPG2022-00023-ICMS) et Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81803398).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6361 | |
| Agarose, basse température de gélification | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Drummond Nanoject III Injecteur de nanolitre programmable | Drummond Scientific | 3-000-207 | |
| Stéréomicroscopes à fluorescence | Leica | M205 FA | |
| GraphPad Logiciel Prism | Logiciel | GraphPad Ver. 7.04 | |
| Lipopolysaccharides d’Escherichia coli O111 :B4 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
| Micromanipulateur manuel | World Precision Instruments | M3301 | |
| Huile minérale | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mx3005P Système qPCR | Agilent Technologies | Mx3005P | |
| Nanovue plus spectrophotomètre | Biochrom | 80-2140-46 | |
| Kit de dosage de concentration de nitrites | Beyotime Biotechnology | S0021M | |
| Solution saline tamponnée au phosphate | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Extracteur de pipette horizontale programmable | World Precision Instruments | PMP-102 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Amorces aléatoires | Takara | 3802 | |
| SuperScript II Transcriptase inverse | Invitrogen | 18064014 | |
| SYBR Premix Ex Taq II kit | Accurate Biology | AG11701 | |
| The 3rd Gen Tgrinder | Tiangen | OSE-Y30 | |
| Capillaires en verre à paroi mince (4") avec filament, OD 1,5 mm | World Precision Instruments | TW150F-4 | |
| Tricaïne (ester éthylique de l’acide 3-aminobenzoïque) | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| TRNzol Réactif universel | Tiangen | DP424 | |
| Boîte de suivi du poisson-zèbre | ViewPoint Behavior Technology |
Références
- Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
- Fan, L. W., Pang, Y.
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Réimpressions et autorisations
