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Neurosciences

Microinjeções ventriculares cerebrais de lipopolissacarídeo em peixe-zebra larval para avaliar a neuroinflamação e a neurotoxicidade

Published: August 23, 2022
doi:
10.3791/64313
,
1State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Health Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade

Summary

Este protocolo demonstra a microinjeção de lipopolissacarídeo na região ventricular cerebral em um modelo larval de peixe-zebra para estudar a resposta neuroinflamatória e a neurotoxicidade resultantes.

Abstract

A neuroinflamação é um jogador-chave em vários distúrbios neurológicos, incluindo doenças neurodegenerativas. Portanto, é de grande interesse pesquisar e desenvolver modelos alternativos de neuroinflamação in vivo para entender o papel da neuroinflamação na neurodegeneração. Neste estudo, um modelo larval de peixe-zebra de neuroinflamação mediado por microinjeção ventricular de lipopolissacarídeo (LPS) para induzir uma resposta imune e neurotoxicidade foi desenvolvido e validado. As linhagens transgênicas de peixe-zebra elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP e mpo:EGFP foram utilizadas para quantificação em tempo real da viabilidade dos neurônios cerebrais por imagem viva de fluorescência integrada com análise de intensidade de fluorescência. O comportamento locomotor das larvas de peixe-zebra foi registrado automaticamente por meio de um gravador de vídeo-rastreamento. O conteúdo de óxido nítrico (NO) e os níveis de expressão de mRNA de citocinas inflamatórias, incluindo interleucina-6 (IL-6), interleucina-1β (IL-1β) e fator de necrose tumoral humana α (TNF-α) foram investigados para avaliar a resposta imune induzida por LPS na cabeça larval de peixe-zebra. Às 24 h após a injeção ventricular cerebral de LPS, foram observadas perda de neurônios e deficiência de locomoção em larvas de peixe-zebra. Além disso, a neuroinflamação induzida por LPS aumentou a liberação de NO e a expressão de mRNA de IL-6, IL-1β e TNF-α na cabeça de larvas de peixe-zebra após 6 dias de fertilização (dpf) e resultou no recrutamento de neutrófilos no cérebro do peixe-zebra. Neste estudo, a injeção de peixe-zebra com LPS a uma concentração de 2,5-5 mg/mL a 5 dpf foi determinada como a condição ideal para este ensaio de neuroinflamação farmacológica. Este protocolo apresenta uma metodologia nova, rápida e eficiente para a microinjeção de LPS no ventrículo cerebral para induzir neuroinflamação e neurotoxicidade mediadas por LPS em uma larva de peixe-zebra, que é útil para o estudo da neuroinflamação e também pode ser usada como um ensaio de triagem de drogas in vivo de alto rendimento.

Introduction

A neuroinflamação tem sido descrita como um fator antineurogênico crucial envolvido na patogênese de várias doenças neurodegenerativas do sistema nervoso central (SNC)1. Após insultos patológicos, a neuroinflamação pode resultar em várias consequências adversas, incluindo inibição da neurogênese e indução da morte celular neuronal 2,3. No processo subjacente à resposta à indução da inflamação, múltiplas citocinas inflamatórias (como TNF-α, IL-1β e IL-6) são secretadas no espaço extracelular e atuam como componentes cruciais na morte dos neurônios e na supressão da neurogênese 4,5,6.

A microinjeção de mediadores inflamatórios (como IL-1β, L-arginina e endotoxinas) no cérebro pode causar redução das células neuronais e neuroinflamação 7,8,9. O lipopolissacarídeo (LPS, Figura 1), endotoxina patogênica presente na parede celular de bactérias Gram-negativas, pode induzir neuroinflamação, exacerbar a neurodegeneração e reduzir a neurogênese em animais10. A injeção de LPS diretamente no SNC do cérebro de camundongos aumentou os níveis de óxido nítrico, citocinas pró-inflamatórias e outros reguladores11. Além disso, a injeção estereotáxica de LPS no ambiente cerebral local pode induzir a produção excessiva de moléculas neurotóxicas, resultando em comprometimento da função neuronal e subsequente desenvolvimento de doenças neurodegenerativas 10,12,13,14,15. No campo da neurociência, observações microscópicas ao vivo e em curso temporal de processos celulares e biológicos em organismos vivos são cruciais para a compreensão dos mecanismos subjacentes à patogênese e à ação farmacológica16. No entanto, a imagem ao vivo de modelos de neuroinflamação e neurotoxicidade em camundongos é fundamentalmente limitada pela profundidade limitada de penetração óptica da microscopia, o que impede a imagem funcional e a observação ao vivo dos processos de desenvolvimento17,18,19. Portanto, o desenvolvimento de modelos alternativos de neuroinflamação é de grande interesse para facilitar o estudo do desenvolvimento patológico e do mecanismo subjacente à neuroinflamação e neurodegeneração, por meio de imagens ao vivo.

O peixe-zebra (Danio rerio) emergiu como um modelo promissor para estudar a neuroinflamação e a neurodegeneração devido ao seu sistema imunológico inato evolutivamente conservado, transparência óptica, grande tamanho da embreagem embrionária, tratabilidade genética e adequação para imagens in vivo 19,20,21,22,23 . Protocolos prévios injetaram diretamente LPS na gema e no ventrículo rombencéfalo de larvas de peixe-zebra sem avaliação mecanicista, ou simplesmente adicionaram LPS à água de peixes (meio de cultura) para induzir uma resposta imune sistêmica letal24,25,26,27. Neste trabalho, desenvolvemos um protocolo para microinjeção de LPS nos ventrículos cerebrais, para desencadear uma resposta imune inata ou neurotoxicidade nos 5 dias pós-fertilização (dpf) larvas de peixe-zebra. Essa resposta é evidenciada pela perda de células neuronais, déficit de comportamento locomotor, aumento da liberação de óxido de nitrito, ativação da expressão gênica inflamatória e recrutamento de neutrófilos no cérebro do peixe-zebra 24 h após a injeção.

Protocol

As linhagens AB de zebrafish do tipo selvagem e zebrafish transgênico elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP e mpo:EGFP foram obtidas do Instituto de Ciências Médicas Chinesas (ICMS). A aprovação ética (UMARE-030-2017) para as experiências com animais foi concedida pela Comissão de Ética em Investigação Animal da Universidade de Macau, e o protocolo segue as orientações institucionais de cuidados com os animais. 1. Embrião de peixe-zebra e criação larval Gerar e…

Representative Results

O fluxo de trabalho descrito aqui apresenta uma metodologia nova, rápida e eficiente para induzir neuroinflamação e neurotoxicidade mediadas por LPS em larvas de peixe-zebra. Neste protocolo descrito, 5 peixes-zebra dpf foram injetados com LPS (Figura 1) nos ventrículos cerebrais utilizando um microinjetor (Figura 2A-C). A injeção bem-sucedida no local do ventrículo cerebral foi verificada usando a coloração azul de Eva…

Discussion

Uma quantidade crescente de dados epidemiológicos e experimentais implica infecções bacterianas e virais crônicas como possíveis fatores de risco para doenças neurodegenerativas36. A infecção desencadeia a ativação de processos inflamatórios e respostas imunes do hospedeiro37. Mesmo que a resposta atue como um mecanismo de defesa, a inflamação superativada é prejudicial à neurogênese, e o ambiente inflamatório não permite a sobrevivência dos neurônios re…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado por subvenções do Fundo de Desenvolvimento da Ciência e Tecnologia (FDCT) da RAEM (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 e 0016/2019/AKP), Comissão de Investigação da Universidade de Macau (MYRG2020-00183-ICMS e CPG2022-00023-ICMS) e Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (n.º 81803398).

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A6361
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-207
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA
GraphPad Prism software GraphPad Software Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L3024
Manual micromanipulator World Precision Instruments M3301
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Mx3005P qPCR system Agilent Technologies Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer Biochrom 80-2140-46
Nitrite concentration assay kit Beyotime Biotechnology S0021M
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller World Precision Instruments PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7629
Random primers Takara 3802
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit Accurate Biology AG11701
The 3rd Gen Tgrinder Tiangen OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm World Precision Instruments TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) Sigma-Aldrich A-5040
TRNzol Universal reagent Tiangen DP424
Zebrafish tracking box ViewPoint Behavior Technology
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Keywords: Brain VentricleMicroinjectionLipopolysaccharideNeuroinflammationNeurotoxicityZebrafishIn Vivo ModelAnti-neuroinflammatory DrugsGlass CapillaryMicromanipulatorAgaroseAnesthesia
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Citer Cet Article
He, Y., Lee, S. M. Y. Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (186), e64313, doi:10.3791/64313 (2022).
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