Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Beurteilung von Veränderungen in der synaptischen Plastizität unter Verwendung eines wachen geschlossenen Kopfverletzungsmodells für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64592
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Medical Sciences, University of Victoria, 2Island Medical Program, University of British Columbia

Summary

In dieser Arbeit wird gezeigt, wie ein waches geschlossenes Kopfverletzungsmodell verwendet werden kann, um die Auswirkungen eines wiederholten leichten Schädel-Hirn-Traumas (r-mSHT) auf die synaptische Plastizität im Hippocampus zu untersuchen. Das Modell repliziert wichtige Merkmale des r-mSHT bei Patienten und wird in Verbindung mit der in vitro Elektrophysiologie eingesetzt.

Abstract

Leichtes Schädel-Hirn-Trauma (mSHT) ist ein weit verbreitetes Gesundheitsproblem in Nordamerika. Es besteht ein zunehmender Druck, ökologisch valide Modelle von mSHT mit geschlossenem Kopf im präklinischen Umfeld zu verwenden, um die Übertragbarkeit auf die klinische Bevölkerung zu erhöhen. Das ACHI-Modell (Awake Closed-Head-Injury) verwendet einen modifizierten kontrollierten kortikalen Impaktor, um eine geschlossene Kopfverletzung zu verursachen und klinisch relevante Verhaltensdefizite zu induzieren, ohne dass eine Kraniotomie oder der Einsatz eines Anästhetikums erforderlich ist.

Diese Technik führt normalerweise nicht zu Todesfällen, Schädelbrüchen oder Hirnblutungen und ist eher mit einer leichten Verletzung vereinbar. Die milde Natur des ACHI-Verfahrens macht es ideal für Studien, die repetitive mSHT (r-mSHT) untersuchen. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass r-mSHT zu einer kumulativen Verletzung führen kann, die Verhaltenssymptome, neuropathologische Veränderungen und Neurodegeneration hervorruft. r-mSHT tritt häufig bei Jugendlichen auf, die Sport treiben, und diese Verletzungen treten während einer Phase robuster synaptischer Reorganisation und Myelinisierung auf, was die jüngere Bevölkerung besonders anfällig für die langfristigen Einflüsse von r-mSHT macht.

Darüber hinaus tritt r-mSHT in Fällen von Gewalt in der Partnerschaft auf, eine Erkrankung, für die es nur wenige objektive Screening-Maßnahmen gibt. In diesen Experimenten wurde die synaptische Funktion im Hippocampus von juvenilen Ratten, die ein r-mSHT erlebt hatten, mit Hilfe des ACHI-Modells untersucht. Nach den Verletzungen wurde ein Gewebeschneider verwendet, um Hippocampusschnitte zu machen, um die bidirektionale synaptische Plastizität im Hippocampus entweder 1 oder 7 Tage nach dem r-mSHT zu bewerten. Insgesamt bietet das ACHI-Modell den Forschern ein ökologisch valides Modell, um Veränderungen der synaptischen Plastizität nach mSHT und r-mSHT zu untersuchen.

Introduction

Schädel-Hirn-Trauma (SHT) ist ein bedeutendes Gesundheitsproblem, mit ~2 Millionen Fällen in Kanada und den Vereinigten Staaten pro Jahr 1,2. SHT betrifft alle Altersgruppen und Geschlechter und hat eine höhere Inzidenzrate als jede andere Erkrankung, insbesondere Brustkrebs, AIDS, Parkinson und Multiple Sklerose3. Trotz der Prävalenz des SHT ist die Pathophysiologie nach wie vor nur unzureichend verstanden, und die Behandlungsmöglichkeiten sind begrenzt. Dies liegt zum Teil daran, dass 85 % aller SHT als mild (mSHT) eingestuft werden und bisher angenommen wurde, dass mSHT nur begrenzte und vorübergehende Verhaltensänderungen ohne neuropsychiatrische Langzeitfolgen hervorruft 4,5. Es ist inzwischen bekannt, dass die Genesung von mSHT Wochen bis Jahredauern kann 5,6, schwerwiegendereneurologische Erkrankungen auslösen kann 4 und dass selbst wiederholte "sub-erschütternde" Stöße das Gehirn beeinträchtigen7. Dies ist alarmierend, da Sportler in Sportarten wie Hockey/Fußball >10 sub-erschütternde Stöße pro Spiel/Trainingseinheit haben 7,8,9,10.

Jugendliche haben die höchste Inzidenz von mSHT, und in Kanada wird jährlich etwa einer von 10 Teenagern wegen einer sportbedingten Gehirnerschütterung ärztliche Hilfe in Anspruch nehmen11,12. In der Realität kann jeder sub-erschütternde Kopfaufprall oder mSHT diffuse Schäden am Gehirn verursachen, was auch zu einem anfälligeren Zustand für nachfolgende Verletzungen und/oder schwerwiegendere neurologische Erkrankungen führen könnte 13,14,15,16,17. In Kanada ist es durch das Rowan'sche Gesetz rechtlich anerkannt, dass eine frühere Verletzung die Anfälligkeit des Gehirns für weitere Verletzungen erhöhen kann18, aber das mechanistische Verständnis von r-mSHT ist nach wie vor völlig unzureichend. Es ist jedoch klar, dass einzelne und r-mSHT die Lernfähigkeit während der Schulzeitbeeinflussen können 19,20, geschlechtsspezifische Ergebnissehaben 21,22,23,2 4 und die kognitive Leistungsfähigkeit im späteren Lebenbeeinträchtigen können 16,25,26. In der Tat assoziieren Kohortenanalysen r-mSHT früh im Leben stark mit einer späteren Demenz27,28. r-mSHT ist möglicherweise auch mit chronischer traumatischer Enzephalopathie (CTE) assoziiert, die durch die Akkumulation von hyperphosphoryliertem Tau-Protein und progressiver kortikaler Atrophie gekennzeichnet ist und durch eine signifikante Entzündung ausgelöst wird 27,29,30,31. Obwohl die Zusammenhänge zwischen r-mSHT und CTE derzeit umstritten sind32, wird dieses Modell es ermöglichen, sie in einem präklinischen Umfeld genauer zu untersuchen.

Ein mSHT wird oft als "unsichtbare Verletzung" bezeichnet, da es in einem geschlossenen Schädel auftritt und selbst mit modernen bildgebenden Verfahren schwer zu erkennen ist33,34. Ein genaues experimentelles Modell von mSHT sollte zwei Grundsätzen folgen. Zunächst sollten die biomechanischen Kräfte rekapituliert werden, die normalerweise in der klinischen Population beobachtet werden35. Zweitens sollte das Modell heterogene Verhaltensergebnisse induzieren, was auch in klinischen Populationen weit verbreitet ist36,37,38. Derzeit sind die meisten präklinischen Modelle tendenziell schwerwiegender und umfassen Kraniotomie, stereotaktische Kopfstütze, Anästhesie und kontrollierte kortikale Auswirkungen (CCI), die erhebliche strukturelle Schäden und umfangreichere Verhaltensdefizite verursachen, als normalerweise klinisch beobachtet werden33. Ein weiteres Problem bei vielen präklinischen Modellen von Gehirnerschütterungen, die Kraniotomien beinhalten, besteht darin, dass dieses Verfahren selbst eine Entzündung im Gehirn hervorruft, was die Symptome eines mSHT und die Neuropathologie durch eine spätere Verletzung verschlimmern kann39,40. Die Anästhesie führt auch zu mehreren komplexen Störfaktoren, darunter die Verringerung der Entzündung 41,42,43, die Modulation der Mikrogliafunktion 44, die Freisetzung von Glutamat45, den Eintritt von Ca2+ durch NMDA-Rezeptoren 46, den intrakraniellen Druck und den zerebralen Stoffwechsel 47. Die Anästhesie führt außerdem zu Störfaktoren, indem sie die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke (BHS), die Tau-Hyperphosphorylierung und den Kortikosteroidspiegel erhöht und gleichzeitig die kognitive Funktion verringert 48,49,50,51. Darüber hinaus machen diffuse, geschlossene Verletzungen die überwiegende Mehrheit der klinischen mSHT aus52. Sie ermöglichen es auch, die Vielzahl von Faktoren besser zu untersuchen, die Verhaltensergebnisse beeinflussen können, darunter Geschlecht21, Alter 53, Inter-Verletzungsintervall15, Schweregrad54 und die Anzahl der Verletzungen23.

Die Richtung der Beschleunigungs-/Verzögerungskräfte (vertikal oder horizontal) ist ebenfalls ein wichtiger Faktor für das Verhalten und die molekularen Ergebnisse. Untersuchungen von Mychasiuk und Kollegen haben zwei Modelle von diffusen mSHT mit geschlossenem Kopf verglichen: Gewichtsabfall (vertikale Kräfte) und seitlicher Aufprall (horizontale Kräfte)55. Sowohl die Verhaltens- als auch die molekularen Analysen zeigten heterogene modell- und geschlechtsabhängige Ergebnisse nach mSHT. Tiermodelle, die helfen, chirurgische Eingriffe zu vermeiden und gleichzeitig lineare und Rotationskräfte einzubeziehen, sind daher repräsentativer für die physiologischen Bedingungen, unter denen diese Verletzungen normalerweise auftreten33,56. Das ACHI-Modell wurde als Reaktion auf diesen Bedarf entwickelt und ermöglicht die schnelle und reproduzierbare Induktion von mSHT bei Ratten bei gleichzeitiger Vermeidung von Verfahren (d. h. Anästhesie), von denen bekannt ist, dass sie Geschlechtsunterschiede verzerren57.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Die Genehmigung für alle Tierverfahren wurde vom Tierpflegeausschuss der University of Victoria in Übereinstimmung mit den Standards des Canadian Council on Animal Care (CCAC) erteilt. Alle männlichen Long-Evans-Ratten wurden im eigenen Haus gezüchtet oder gekauft (siehe Materialtabelle).

1. Haltungs- und Zuchtbedingungen

  1. Lassen Sie die Tiere 1 Woche lang an ihre Haltungsumgebung gewöhnen, bevor sie am 21. Tag nach der Geburt (PND) entwöhnt werden.
  2. Halten Sie die Ratten in Standardkäfigen bei 22,5 °C ± 2,5 °C, mit Ad-libitum-Zugang zu Futter und Wasser, in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.
  3. Gruppieren und beherbergen Sie die Tiere mit zwei oder drei geschlechtsangepassten Wurfgeschwistern und ordnen Sie sie nach dem Zufallsprinzip entweder Schein- oder r-mSHT-Bedingungen zu.
  4. Führen Sie alle Verfahren zwischen 7:30 und 23:30 Uhr durch.

2. Einrichten des Verfahrens für eine geschlossene Kopfverletzung im Wachzustand

  1. Position a 2,75 Zoll. Schaumstoffpolster mit geringer Dichte (100 cm x 15 cm x 7 cm) unter dem Impaktor, um eine rotierende Kopfbewegung zu ermöglichen.
    HINWEIS: Das Schaumstoffpolster hatte eine Federkonstante von ~2.500 N/m, kann aber zwischen 3.100 und 5.600 N/mvariieren 58. Der Grad der Festigkeit (niedrig, mittel und hoch) hat sich nicht als prädiktiv für das Verletzungsergebnis erwiesen59. Das Schaumstoffpolster ist ein nicht verbrauchbares Material. Es wird normalerweise jährlich oder bei Verschmutzung oder Beschädigung ausgetauscht.
  2. Schalten Sie das modifizierte kortikale Aufprallgerät ein (Abbildung 1A) und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 6 m/s ein.
    HINWEIS: Diese Spezifikationen sind so konzipiert, dass sie akute neurologische Beeinträchtigungen bei juvenilen und jugendlichen Ratten hervorrufen, die den Merkmalen eines mSHT entsprechen, aber solche Parameter sind möglicherweise nicht für ältere Tiere oder andere Spezies (z. B. Mäuse oder Frettchen) geeignet. Eine Übersicht über gängige ACHI-Parameter finden Sie unter60.

3. Induktion von mSHT

  1. Wenn die Ratten PND 24 erreicht haben, bringen Sie sie in den Behandlungsraum, in dem die Eingriffe durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass dieser Raum von ihrer normalen Wohnumgebung getrennt ist.
  2. Legen Sie die Ratte vorsichtig in einen Fesselkegel und stellen Sie sicher, dass sich die Schnauze und die Nasenlöcher nahe an der kleinen Öffnung des Kegels befinden, um eine ausreichende Belüftung zu ermöglichen. Verwenden Sie eine Haarspange aus Kunststoff, um den Kegel am kaudalen Ende geschlossen zu halten, um eine Bewegung zu verhindern, sobald die Ratte in den Haltekegel gesetzt wird.
    1. Verwenden Sie Rückhaltewerte, um die Einhaltung oder Toleranz der Tiere mit dem Rückhaltekegel und dem ACHI-Verfahren zu erfassen.
      HINWEIS: Der Rückhaltewert kann als Bewertung des Stresses bei den Tieren verwendet werden. So können Ausschlusskriterien unter Verwendung des Restriktions-Scores entwickelt werden, um die Variabilität zwischen den Probanden zu reduzieren, die aufgrund einer übermäßigen Stressreaktion entsteht.
      1. Geben Sie eine Punktzahl von 0 bis 4, basierend auf der Bereitschaft des Tieres, den Kegel zu betreten, seinen Bewegungen und Lautäußerungen. Geben Sie eine Punktzahl von 0, wenn es keinen Widerstand gegen die Fesselung gibt, während eine Punktzahl von 1 entspricht, wenn sich das Tier 1-2x dreht und wenig bis gar keine Lautäußerungen oder Windungen aufweist. Geben Sie eine Punktzahl von 2, wenn das Tier 2-3x alt geworden ist und eine Lautäußerung oder Windung zeigt. Geben Sie einen Zurückhaltewert von 3, wenn das Tier 5-10x gedreht hat und mehr Lautäußerungen und Windungen zeigt. Geben Sie schließlich eine Punktzahl von 4 an, wenn sich das Tier mehr als 10x gedreht hat und sich häufig Lautäußerungen und Windungen vornimmt.
        HINWEIS: Diese Informationen befinden sich auch auf dem Bewertungsbogen selbst (Ergänzungstabelle S1 und Ergänzungstabelle S2).
  3. Während die Ratte gefesselt ist, positionieren Sie den Helm (Abbildung 1B) manuell über der Mittellinie, wobei die Zielscheibe über dem linken Parietallappen liegt (Abbildung 1C, D).
  4. Legen Sie die Ratte auf das Schaumstoffpolster und stellen Sie den Impaktor manuell in die Position Verlängern. Senken Sie die Impaktorspitze manuell ab, so dass sie mit der Zielscheibe am Helm in Kontakt kommt. Stellen Sie den Impaktor manuell in die Position "Einfahren", damit sich der Impaktor 10 mm über den Helm zurückzieht.
  5. Verwenden Sie das Einstellrad am stereotaktischen Arm, um die Aufprallspitze um 10 mm abzusenken, so dass sie wieder die Zielscheibe am Helm berührt. Legen Sie den Schlagschalter um, so dass der Kopf des Tieres schnell um 10 mm mit 6 m/s beschleunigt wird.
  6. Sobald das Gerät aktiviert wurde, nehmen Sie das Tier sofort aus dem Rückhaltekegel und führen Sie ein sofortiges neurologisches Untersuchungsprotokoll (NAP) durch.
    HINWEIS: Für die aktuellen Experimente wurde dieses Protokoll insgesamt achtmal im Abstand von 2 h wiederholt.

4. Induktion einer Scheinverletzung

  1. Befolgen Sie alle experimentellen Verfahren, wie oben in Abschnitt 3 beschrieben, aber platzieren Sie die Ratte neben dem Weg des Aufprallkolbens, damit keine Verletzungen auftreten.

5. Neurologisches Beurteilungsprotokoll

HINWEIS: Der NAP kann verwendet werden, um das Bewusstseinsniveau sowie die kognitiven und sensomotorischen Funktionen zu messen.

  1. Zu Studienbeginn und unmittelbar nach der Induktion des mSHT oder der Scheinverletzung sind die Ratten anhand des NAP zu beurteilen, wie in56,61 beschrieben. Stellen Sie den Hauskäfig der Ratten und einen Aufwachkäfig im Abstand von 100 cm auf einen Tisch. Zentrieren Sie den Schwebebalken gleichmäßig auf beiden Käfigen. Legen Sie zusätzlich ein gefaltetes Handtuch oder eine zusätzliche Polsterung unter den Schwebebalken.
  2. Beurteilen Sie bei Bedarf den Bewusstseinsstand. Wenn die Tiere nach dem mSHT nicht mehr ansprechbar sind, beurteilen Sie die Apnoe (Atemstillstand) und jede Verzögerung des Aufrichtungsreflexes , indem Sie mit einer Stoppuhr die Zeit aufzeichnen, die das Tier benötigt, um wieder zu atmen und/oder sich von der Rückenlage in die Bauchlage aufzurichten.
    HINWEIS: Der Verlust des Aufrichtungsreflexes und die Apnoe sind beim ACHI-Modell selten, können aber gelegentlich bei juvenilen Tieren beobachtet werden.
  3. Beurteilen Sie die kognitiven und sensomotorischen Funktionen der Ratte anhand der folgenden Testsequenz. Führen Sie diese Tests schnell nacheinander durch, nachdem Sie das Bewusstsein beurteilt haben.
    HINWEIS: Die Summe dieser vier Tests ergibt eine Gesamtpunktzahl von 12, wenn keine Verhaltensdefizite beobachtet werden. Defizite schmälern diesen Wert.
    1. Schreckhafte Reaktion
      1. Setzen Sie die Ratte in den leeren Aufwachkäfig und klatschen Sie laut (50 cm) über den Käfig. Zeichnen Sie die Reaktion des Tieres auf das Geräusch mit dem folgenden Bewertungssystem auf:
        3 = Schnelle Schreckreaktion auf Geräusche (z. B. Ohrbewegungen/-zuckungen, Springen, Erstarren des ganzen Körpers).
        2 = Langsame Reaktion oder leichte Gefrierreaktion auf Geräusche.
        1 = Es werden nur Ohrbewegungen beobachtet.
        0 = Keine Reaktion auf Geräusche.
    2. Streckung der Gliedmaßen
      1. Wenn der Balken (100 cm lang x 2 cm breit x 0,75 cm dick) horizontal über dem Zuhause und den Aufwachkäfigen der Ratte platziert ist, heben Sie die Ratte am Schwanzansatz auf und halten Sie sie in die Nähe des Balkens. Stellen Sie sicher, dass die Ratte nahe genug ist, um sie leicht greifen zu können. Beurteilen Sie die Fähigkeit der Ratte, beide Gliedmaßen bis zum Balken auszustrecken, mit dem folgenden Bewertungssystem:
        3 = Volle Streckung beider Vordergliedmaßen und Greifen des Balkens.
        2 = Es ist nur ein Glied gestreckt.
        1 = Intermittierende Streckung oder Retraktion der Vordergliedmaßen.
        0 = Die Vordergliedmaßen sind schlaff/nicht gestreckt.
    3. Balken-Walk
      1. Platzieren Sie das Tier in der Mitte des horizontalen Balkens an der 50-cm-Markierung mit Blick auf seinen Heimatkäfig. Stellen Sie sicher, dass der Balken gleichmäßig zwischen dem Hauskäfig und dem Aufwachkäfig der Ratte verteilt ist (~80 cm voneinander entfernt). Erlaube der Ratte, über den Balken zu laufen. Beurteilen Sie die Fähigkeit der Ratte, das Gleichgewicht zu halten und zu gehen, mit dem folgenden Bewertungssystem:
        3 = Geht innerhalb von 10 s erfolgreich über den Balken mit weniger als zwei Fuß Ausrutschen.
        2 = Geht erfolgreich über den Balken, aber es werden mehr als zwei Fuß Ausrutschen beobachtet.
        1 = Nicht-Lokomotiv-Bewegung, "schwimmende" Bewegung.
        0 = Unfähig, entlang des Balkens zu gehen oder sich innerhalb von 10 s zu bewegen.
    4. Drehbarer Balken
      1. Positionieren Sie die Ratte in der Mitte des Balkens und stellen Sie sicher, dass die Ratte ausbalanciert ist. Heben Sie den Balken 80 cm über ein Handtuch oder eine gepolsterte Oberfläche an und beginnen Sie, den Balken 4 s lang manuell mit einer Umdrehung pro Sekunde zu drehen (insgesamt vier Umdrehungen). Beurteilen Sie die Fähigkeit der Ratte, auf dem Strahl zu bleiben, während sie sich dreht, mit dem folgenden Bewertungssystem:
        3 = Ratte bleibt bei allen vier Umdrehungen auf dem Balken.
        2 = Ratte fällt bei der vierten Umdrehung.
        1 = Ratte fällt bei der zweiten oder dritten Umdrehung.
        0 = Ratte fällt bei der ersten Umdrehung.
  4. Nach Abschluss des NAP werden mSHT und Scheinratten in ihre heimischen Käfige zurückgebracht. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf für r-mSHT-Verfahren. Überwachen Sie das Wohlergehen der Tiere nach Verletzungen mit der Checkliste für die käfigseitige Überwachung (Ergänzungsdatei 1). Wenn es während der Überwachung auf der Käfigseite Hinweise auf eine Anomalie gibt (ein Wert, der nicht N ist), sollte ein vollständiger Schmerzwert mit der Schmerzskala und der Checkliste für die erweiterte Überwachung nach dem Kopfaufprall (Ergänzungsdatei 2) erstellt werden.

6. Vorbereitung der Scheiben

HINWEIS: In der aktuellen Studie wurde die synaptische Plastizität bei Tieren nach r-mSHT entweder 1 oder 7 Tage nach mSHT untersucht. An diesen Tagen wurden die Tiere vor der Tötung einzeln in überdachten Käfigen ins Labor gebracht.

  1. Kühlen Sie über Nacht (-20 °C) alle chirurgischen Instrumente (Abbildung 2A), die für die Herstellung von Hippocampus-Scheiben benötigt werden: Standardschere, Präparierschere, Pinzette, Rongeur, Spatel und Kühlblock.
    Anmerkungen: Der Gewebekleber und die Inkubationskammer sollten nicht gekühlt werden.
  2. Präparation von künstlichem Liquor cerebrospinalis (aCSF) mit 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO 4, 25 mM NaHCO 3, 2 mM CaCl 2,1,3 mM MgCl 2 und 10 mM Dextrose (300 ± 10 mOsm; pH 7,2-7,4).
    HINWEIS: Die Hauptlösung von aCSF muss für die Dauer des Protokolls kontinuierlich mit Carbogen (95% O 2/5% CO2) geblasen werden.
  3. Vor dem Einschläfern des Tieres (Schritt 6.8) sind 12,5 ml Agarose vorzubereiten. Lösen Sie 0,25 g Agarose in 12,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) durch Mikrowelle in einem konischen 50-ml-Röhrchen in 10-Sekunden-Schritten auf.
  4. Die Agarose warm halten (42 °C) und in einer Heizplatte schütteln, damit sie nicht fest wird.
  5. Stellen Sie eine Schneidestation auf Eis auf, bestehend aus einer Petrischale und einem kleinen Becherglas (50 ml), gefüllt mit eiskaltem aCSF (4 °C) und einer umgekippten Petrischale mit einem Stück angefeuchtetem Filterpapier darauf (Abbildung 2A). Den aCSF im kleinen Becherglas mit Carbogen kontinuierlich aufblasen.
  6. Das Wasserbad auf 32 °C erwärmen. Füllen Sie die Auffangkammer mit aCSF und blasen Sie kontinuierlich mit Carbogen (Abbildung 2B).
  7. Transportieren Sie das Tier in den Versuchsraum.
  8. Betäuben Sie das Tier mit 5%igem Isofluran als Inhalationsmittel (bis zum Ausbleiben eines Entzugsreflexes) und enthaupten Sie es dann schnell mit einer kleinen Guillotine.
  9. Sezieren Sie das Gehirn vom Schädel in der Petrischale, die mit eiskaltem (4 °C) aCSF gefüllt ist, und halten Sie den Schädel in den aCSF getaucht, um das Gewebe schnell abzukühlen.
    HINWEIS: Dieses Verfahren dauert normalerweise weniger als 5 Minuten, aber die Geschwindigkeit der Hirnentfernung ist kein kritischer Faktor, wenn das Gehirn in gekühltes aCSF getaucht ist.
  10. Geben Sie das Gehirn in das kleine Becherglas mit gekühltem und kariertem aCSF, um die Probe weiter zu reinigen und zu kühlen.
  11. Bewegen Sie das Gehirn in die umgedrehte Petrischale und legen Sie sie auf das Filterpapier. Verwenden Sie ein scharfes Skalpell, um das Kleinhirn und den präfrontalen Kortex zu entfernen, um das Gehirn zu "blockieren". Trennen Sie die beiden Hemisphären, indem Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie des Gehirns machen.
    HINWEIS: Das folgende Protokoll wird eine Hemisphäre nach der anderen durchgeführt. Es ist zwingend erforderlich, dass die Hemisphäre, die derzeit nicht präpariert wird, in das Becherglas mit eiskaltem (4 °C) karbogeniertem aCSF getaucht bleibt.
  12. Um transversale Hippocampusschnitte zu erstellen, legen Sie die Hemisphäre auf die mediale Oberfläche. Kippen Sie die Klinge eines Skalpells um ~30° nach innen und entfernen Sie eine dünne Scheibe von der dorsalen Oberfläche des Gehirns, um eine ebene Oberfläche für das Gehirn zu schaffen, das auf dem vom Slicer verwendeten Kolben montiert werden kann. Drehen Sie das Gehirn auf die dorsale Oberfläche und tupfen Sie das Gewebe vorsichtig auf trockenes Filterpapier, um überschüssiges aCSF zu entfernen. Befestigen Sie mit Cyanacrylatkleber die dorsale Oberfläche des Gehirns am Kolben und lassen Sie die ventrale Oberfläche aufrecht.
    Anmerkungen: Achten Sie darauf, dass der Kleber nicht über den Rand des Kolbens läuft, da er sonst an dem Metallrohr haftet, das die Agarose enthält, und die Bewegung des Kolbens verhindert.
  13. Verlängern Sie das äußere Rohr des Kolbens über das Gehirn und gießen Sie die flüssige Agarose in das Rohr, bis das Gehirn vollständig bedeckt ist. Verfestigen Sie die Agarose schnell, indem Sie einen Kühlblock über das Kolbenrohr klemmen (Abbildung 2A).
  14. Positionieren Sie den Kolben in der Kammer der Aufschnittmaschine und sichern Sie die Kammer mit einer Schraube. Befestigen Sie die Klinge und geben Sie eiskaltes, sauerstoffreiches aCSF in die Schneidekammer.
  15. Stellen Sie am Slicer (Abbildung 2B) die Schnittgeschwindigkeit auf 4 und die Oszillation auf 6 ein und schalten Sie den Schalter für kontinuierliches/einzelnes Schneiden auf kontinuierlich um. Drücken Sie den Start, um mit der Durchtrennung des Gehirns bei 400 μm zu beginnen.
  16. Wenn der Slicer das Gehirn durchtrennt, verwenden Sie eine Pasteurpipette mit großem Durchmesser, um jede Scheibe in das Auffangbad mit sauerstoffreichem aCSF zu übertragen, während sie geschnitten wird (Abbildung 2C).
    Anmerkungen: Wenn jede Scheibe geschnitten wird, kann sie nacheinander in die verschiedenen Vertiefungen des Rückgewinnungsbades gelegt werden. Dieses Protokoll ergibt in der Regel zwischen sechs und acht Schichten, die den Hippocampus für jede Hemisphäre enthalten. Mit einem Rattenatlas62 kann die dorsal-ventrale Position einzelner Schnitte im Rattengehirn identifiziert werden.
  17. Lassen Sie die Scheiben 30 Minuten bei 32 °C ruhen und lassen Sie sie dann weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur (23 °C) ruhen.
  18. Wiederholen Sie diese Schritte, um Scheiben aus der zweiten Hemisphäre zu erstellen.

7. Feld-Elektrophysiologie

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte aus, um extrazelluläre Feldaufnahmen vom Gyrus dentatus (DG) zu erhalten. Nach der 60-minütigen Genesung sind die einzelnen Schnitte des Hippocampus bereit für extrazelluläre Feldaufnahmen.

  1. Ziehen Sie mit einem handelsüblichen Mikropipettenzieher Aufzeichnungselektroden (1-2 MΩ) aus 10 cm Borosilikatglaskapillaren mit einem Außendurchmesser von 1,5 mm und einem Innendurchmesser von 1,1 mm.
    Anmerkungen: Die Aufzeichnungselektrode sollte einen Widerstand von ~1 MΩ haben und die Spitzen sollten ~1 mm groß sein. Die Konsistenz der Elektrodenparameter ist wichtig für gute Aufnahmen.
  2. Schalten Sie den Computer und die Geräte ein, die für die Aufnahmen verwendet werden sollen: Verstärker, Digitizer, Stimulator, Mikromanipulator, Temperaturregler, Mikroskoplicht und Vakuumpumpe.
  3. Füllen Sie ein Becherglas mit aCSF und schließen Sie es an ein schwerkraftgesteuertes Perfusionssystem an. Öffnen Sie das aCSF-Ventil am Perfusionssystem, um einen aCSF-Fluss durch die Perfusionskammer zu starten. Halten Sie eine Flussrate von etwa ein oder zwei Tropfen/s oder 2 ml/min ein. Kontinuierliches Carbogenat aCSF für die Dauer der elektrophysiologischen Ableitungen.
    HINWEIS: Es ist zwingend erforderlich, während der Feldaufnahmen eine konstante Tropfrate von karbogeniertem aCSF aufrechtzuerhalten. Es ist auch zwingend erforderlich, dass die Referenzelektrode vollständig in aCSF eingetaucht ist.
  4. Verwenden Sie eine Pasteurpipette, um eine Hippocampus-Scheibe aus dem Aufwachbad in die Perfusionskammer zu übertragen, die kontinuierlich mit karbogeniertem aCSF perfundiert und bei 30 ± 0,5 °C gehalten wird. Richten Sie den Hirnschnitt so aus, dass der Gyrus dentatus und die Körnerzellschicht im Sichtfeld sichtbar sind. Stabilisieren Sie die Scheibe mit gebogenen Drahtgewichten. Starten Sie die Computersoftware für die Datenerfassung.
    Anmerkungen: Es kann hilfreich sein, die Vakuumpumpe während dieses Schritts auszuschalten, um eine freie Manipulation des Gewebes zu ermöglichen. Dies sollte schnell geschehen, da zu viel Manipulation das Gewebe schädigen kann. Darüber hinaus kann die Perfusionskammer mit aCSF überlaufen, wenn dies zu viel Zeit in Anspruch nimmt. Sobald das Gewebe richtig ausgerichtet und stabilisiert ist, schalten Sie die Vakuumpumpe ein.
  5. Verwenden Sie ein aufrechtes Mikroskop, um die DG mit schräger Optik zu visualisieren. Positionieren Sie eine konzentrische bipolare Stimulationselektrode, um die Fasern des medialen Perforantenpfads (MPP) im mittleren Drittel der Molekülschicht zu aktivieren. Positionieren Sie dann eine mit aCSF gefüllte Glasmikropipette im MPP (Abbildung 3A,B). Beginnen Sie mit den Elektroden, die weiter voneinander entfernt sind (d. h. die Stimulationselektrode in der Nähe von CA3 und die Aufzeichnungselektrode direkt über dem Genu der DG), da das Berühren des Gewebes zu einer Schädigung der Fasern führt.
    HINWEIS: Optimalerweise sollten die Elektroden bei allen Aufnahmen in gleichem Abstand von der Zellschicht in einem Abstand von etwa 200 μm platziert sein.
  6. Sobald die Stimulations- und Aufzeichnungselektroden positioniert sind, visualisieren Sie die evozierten Feldantworten mit einem Verstärker, einem Digitizer und einer Aufzeichnungssoftware.
  7. Um ein geeignetes feldexzitatorisches postsynaptisches Potential (fEPSP) zu finden, stimulieren Sie das Gewebe mit 0,12 ms Stromimpulsen bei 0,2 Hz (alle 5 s), wenn der Benutzer in der Lage ist, Antworten zu finden, oder bei 0,067 Hz (alle 15 s) für weniger geübte Benutzer, um eine Überstimulation zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass der fEPSP eine Mindestamplitude von 0,7 mV mit einer klaren Fasersalve hat, die kleiner als der fEPSP ist.
    HINWEIS: Es ist wichtig, beide Elektroden in gleichem Abstand von der Zellschicht zu positionieren, um maximale Feldantworten zu erhalten, und weit genug voneinander entfernt (d. h. ~200 μm), um eine kleine Fasersalve zu erzeugen. Kleine Anpassungen in der Elektrodenposition können dazu beitragen, die Amplitude der Reaktion zu erhöhen, obwohl diese auf ein Minimum beschränkt werden sollten, um Gewebeschäden zu vermeiden.
  8. Bestimmen Sie die maximale fEPSP-Amplitude, indem Sie die Stimulationsintensität erhöhen, und stellen Sie dann die Simulationsintensität so ein, dass der fEPSP bei 70% der maximalen Amplitude liegt.
    HINWEIS: Die maximale Amplitude ist auf 70 % für Langzeitdepressionsstudien (LTD) und auf 50 % für Langzeitpotenzierungsstudien (LTP) eingestellt. Die maximale Amplitude wird durch Einstellen der Stimulationsstärke bestimmt, bis die Amplitude des fEPSP nicht mehr zunimmt. Bei einem fEPSP mit einer maximalen Amplitude von 2 mV würde die Ansprechgröße dann auf 1,4 mV für LTD-Studien und 1,0 mV für LTP-Studien angepasst werden, um dem fEPSP Raum zum Absenken bzw. Potenzieren zu geben.
  9. Legen Sie eine stabile Vorkonditionierungs-Baseline für 20 Minuten mit 0,12-ms-Impulsen bei 0,067 Hz fest. Damit Slices als stabil betrachtet werden können, achten Sie auf eine Variabilität von <10 % in der anfänglichen Steigung des fEPSP und darauf, dass die Steigung der Linie mit der besten Anpassung durch die gezeichneten fEPSP-Steigungen <0,5 beträgt. Fahren Sie mit den nächsten Schritten der Aufzeichnung fort, wenn die EPSPs 20 Minuten lang stabil sind.
    HINWEIS: Verschiedene Rezeptorantagonisten können dem aCSF zugesetzt werden, um LTD und LTP zu blockieren oder zu verstärken. Falls erforderlich, stellen Sie sicher, dass die Schichten während dieses Basiszeitraums diesen pharmakologischen Wirkstoffen ausgesetzt sind und dass die Anforderungen an stabile Aufzeichnungen erfüllt sind. Beispiele finden Sie unter63,64,65.
  10. Bestimmen Sie zunächst Änderungen der grundlegenden synaptischen Eigenschaften, indem Sie gepaarte Impulsstimuli verwenden und Stimulus-Antwort-Input-Output-Kurven konstruieren. Wenden Sie für den Paired-Pulse-Test eine Reihe von Paired-Puls-Pulsen mit einem Interpuls-Intervall von 50 ms bei 0,033 Hz an. Wenden Sie für die Eingangs-/Ausgangskurven eine Reihe (10) steigender Stimulusintensitäten (0,0-0,24 ms) bei 0,033 Hz an, um die Änderung der fEPSP-Antwortgröße darzustellen.
  11. Um LTD zu untersuchen, die in erster Linie von der Aktivierung der CB1-Rezeptorenabhängt 64,66, verwenden Sie ein 10-Hz-Protokoll (6.000 Impulse bei 10 Hz). Die Verwaltung dieses Protokolls dauert 10 Minuten.
  12. Setzen Sie bei der Nachkonditionierung die Einzelimpulsstimulation (0,12 ms bei einer Frequenz von 0,067 Hz) für weitere 60 Minuten fort.
  13. Im Anschluss an die Nachkonditionierungsaufzeichnung verabreichen Sie erneut die gepaarten Pulsstimuli, gefolgt von einer Eingangs-Ausgangs-Kurve. Vergleichen Sie diese mit Baseline-Aufzeichnungen, um Veränderungen in den präsynaptischen Freisetzungseigenschaften zu beobachten und den Zustand des Schnitts für Langzeitaufzeichnungen zu beurteilen.
  14. Seien Sie bei der Analyse konservativ und halten Sie sich an die Ausschlusskriterien, wenn Sie bestimmen, ob die Daten aus einzelnen Schichten im Datensatz zur synaptischen Plastizität beibehalten werden sollen. Schließen Sie Ausschnitte aus, die eine große Neigung in einer Linie der besten Anpassung der fEPSP-Steigungen während der Basislinie für die Vorkonditionierung (Steigung >0,5), Instabilität der Basislinie für die Vorkonditionierung (>10 % Änderung) und/oder Instabilität in der Nachkonditionierungsperiode (Steigung >1,5 in 50 bis 60 Minuten Nachkonditionierung) aufweisen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Das Awake Closed-Head-Verletzungsmodell ist eine praktikable Methode zur Induktion von r-mSHT bei juvenilen Ratten. Ratten, die mit dem ACHI-Modell r-mSHT ausgesetzt waren, zeigten keine offensichtlichen Verhaltensdefizite. Die Probanden in diesen Experimenten zeigten zu keinem Zeitpunkt während des r-mSHT-Verfahrens eine Latenz nach rechts oder Apnoe, was darauf hindeutet, dass es sich tatsächlich um ein mildes SHT-Verfahren handelte. Im NAP zeigten sich subtile Verhaltensunterschiede; Wie oben beschrieben, wurden die Ratten bei vier sensomotorischen Aufgaben (Schreckreaktion, Streckung der Gliedmaßen, Strahlgang und rotierender Strahl) auf einer Skala von 0 bis 3 bewertet, wobei 3 keine Beeinträchtigung der Aufgabe darstellte. Je niedriger der NAP-Wert war, desto stärker war das Tier beeinträchtigt. Zu Studienbeginn gab es keine Unterschiede in den NAP-Werten zwischen Schein- und r-mSHT-Ratten. Nach allen ACHI-Sitzungen zeigten die r-mTBI-Ratten signifikante Beeinträchtigungen innerhalb der NAP-Aufgaben im Vergleich zu den Schein-Ratten (Abbildung 4). Wie bereits für Stöße über mehrere Tage (d. h. 2 oder 4 Tage) berichtet, führte die anschließende Hinzufügung von Verletzungen im Laufe des Tages jedoch nicht zu zusätzlichen Verhaltensdefiziten. Somit erzeugt das ACHI-Modell von r-mSHT subtile, aber signifikante Verhaltensdefizite während dieser akuten Zeitpunkte nach der Verletzung.

Im Anschluss an das Verletzungsprotokoll wurden evozierte Feldantworten und synaptische Plastizität in der MPP-Eingabe an die DG des Hippocampus am Tag 1 nach der Verletzung (PID1) und PID7 untersucht. Der Zustand der Schichten wurde mit fEPSPs als Reaktion auf eine aufsteigende Reihe von Pulsbreiten in jeder Schicht untersucht. Wie in Abbildung 3C dargestellt ist, gab es keinen Unterschied in den Input-Output-Kurven, die in Schichten erzeugt wurden, die von Schein- und r-mTBI-Ratten erhalten wurden. Um die präsynaptische Transmitterfreisetzung zu untersuchen, wurde eine Reihe von gepaarten Pulsen (50 ms Interpulsintervall) verabreicht und das Verhältnis der Größe des zweiten fEPSP zum ersten fEPSP berechnet. Die Paired-Puls-Verhältnisse unterschieden sich nicht zwischen Schein- und r-mTBI-Ratten (Abbildung 3D). Diese Daten deuten somit darauf hin, dass r-mTBI die grundlegende synaptische Physiologie in der MPP-Eingabe an die DG nicht veränderte. Um LTD zu untersuchen, wurde ein 10-Hz-LTD-Protokoll verabreicht, um eine von Endocannabinoiden abhängige LTD zu induzieren64. Bei PID1 war eine signifikante Abnahme der Kapazität des MPP-Eingangs an die DG zur Aufrechterhaltung der LTD zu verzeichnen (Abbildung 3E). Diese Verringerung der LTD war jedoch vorübergehend, und bei PID7 zeigten Schnitte von Schein- und r-mSHT-Tieren eine äquivalente LTD (Abbildung 3F), obwohl es Hinweise auf einen leichten Trend gab, dass Schnitte von r-mSHT-Tieren einen Anstieg der LTD aufwiesen.

Figure 1
Abbildung 1: Der Aufbau des ACHI-Verfahrens zur Modellierung von r-mTBI . (A) Ein modifizierter kontrollierter kortikaler Impaktor wurde verwendet, um den Kopf des Tieres mit einer Geschwindigkeit von 6,0 m/s schnell um 10 mm zu verschieben. (B,C) Kundenspezifischer 3D-gedruckter Helm mit einer Zielstelle des linken parietalen Kortex. (D) Die Probanden wurden in einen Plastikrückhaltebeutel auf einer Schaumstoffplattform gelegt, wobei der Helm um den Rückhaltekegel gelegt und so positioniert wurde, dass sich die Zielstelle direkt unter der Impaktorspitze befindet. Abkürzungen: ACHI = awake closed-head injury; r-mSHT = wiederholtes leichtes Schädel-Hirn-Trauma. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Erforderliche Materialien und Aufbau für die Scheibenvorbereitung. (A) Werkzeuge für die Extraktion, Montage, Schneidung und Inkubation des Gehirns: a) Kulturschale mit Filterpapier; (b) verschiedene Sezierwerkzeuge, einschließlich Standardscheren, Präparierscheren, Pinzetten, Rongeur und Spatel; c) Gewebekleber; d) Druckkolben und Probenrohr; e) Federklinge und Klingenhalter; f) Kühlblock; (g) Scheiben-Inkubationskammer. (B) Compresstome-Gewebeschneidemaschine. (C) Scheiben, die in einem Bad inkubiert werden, das künstliches Liquor cerebrospinalis enthält, das kontinuierlich mit 95 % O 2/5 % CO2 angereichert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Akute Beeinträchtigungen der synaptischen Plastizität bei juvenilen männlichen Ratten durch r-mSHT unter Verwendung des ACHI-Modells . (A) Die wichtigsten Hippocampusbahnen. Die mediale perforante Bahn besteht aus dem Input aus dem entorhinalen Kortex in den Gyrus dentatus (blau). Der mediale perforante Pfad führt Synapsen in Körnerzellen im Gyrus dentatus (violett) ein. (B) Hellfeld-Mikrofotografie eines Hippocampus-Hirnschnitts (4-fache Vergrößerung), die die tatsächliche Platzierung einer bipolaren Stimulationselektrode (links) und einer Glas-Aufzeichnungselektrodenpipette (rechts) im medialen Performantenpfad des Gyrus dentatus zeigt. (C) Input-Output-Diagramm (fEPSP-Steigung) für verschiedene Simulationsintensitäten (10-300 μs) auf PID1 und PID7 für Schein- und r-mTBI-Ratten. (D) Paarige Pulsverhältnisse für Schein- und r-mSHT-Ratten (50 ms Interpulsintervall). (E) Der zeitliche Verlauf von fEPSP ändert sich vor und nach der Verabreichung eines LTD-Induktionsparadigmas in Hippocampusschnitten, die von Schein- und r-mTBI-Ratten bei PID1 gewonnen wurden. (F) Zeitlicher Verlauf von fEPSP-Änderungen vor und nach der Verabreichung eines LTD-Induktionsparadigmas in Hippocampusschnitten, die von Schein- und r-mTBI-Ratten bei PID7 gewonnen wurden. Abkürzungen: ACHI = awake closed-head injury; r-mSHT = wiederholtes leichtes Schädel-Hirn-Trauma; PID = Tag nach der Verletzung; fEPSP = Feld exzitatorisches postsynaptisches Potential. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Akute neurologische Beeinträchtigung bei juvenilen männlichen Ratten aufgrund von r-mSHT unter Verwendung des ACHI-Modells. Die Ratten unterzogen sich acht ACHI-Verfahren im Abstand von 2 Stunden über 1 Tag, wobei zu Beginn und nach jeder Verletzung ein neurologisches Bewertungsprotokoll durchgeführt wurde. Der NAP bestand aus vier Aufgaben: Schreckreaktion, Streckung der Gliedmaßen, Strahlgang und rotierender Strahl. Jede Aufgabe wurde mit 3 Punkten bewertet, was eine mögliche Gesamtpunktzahl von 12 für jede Sitzung ergibt. Die Daten, die als Mittelwert ± SEM dargestellt werden. (*) zeigt p < 0,05 an. Abkürzungen: ACHI = awake closed-head injury; r-mSHT = wiederholtes leichtes Schädel-Hirn-Trauma; NAP = neurologisches Beurteilungsprotokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Tabelle S1: Informationen zum ACHI-Verfahren zu Tieren und Auswirkungen. Abkürzung: ACHI = Awake Closed-Head Injury. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S2: Refixt-Scoring für mSHT im Wachzustand. Abkürzung: mSHT = leichtes Schädel-Hirn-Trauma. "In Zurückhaltung umdrehen" bezieht sich darauf, dass der Forscher das Tier in die Fessel legt, bevor er den Beutel um den Schwanz schließt. Nachdem der Beutel geschlossen ist, sollte sich das Tier nicht mehr umdrehen können. Lautäußerungen und Windungen sollten nach dem Schließen des Beutels bewertet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 1: Checkliste für die Überwachung am Käfig. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 2: Schmerzskala und Checkliste für die erweiterte Überwachung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In den meisten präklinischen Forschungen wurden Modelle von mSHT verwendet, die die biomechanischen Kräfte, die in der klinischen Population beobachtet wurden, nicht rekapitulieren. In dieser Arbeit wird gezeigt, wie das ACHI-Modell zur Induktion von r-mTBIs bei juvenilen Ratten eingesetzt werden kann. Dieses geschlossene Modell des r-mSHT hat erhebliche Vorteile gegenüber invasiveren Verfahren. Erstens verursacht das ACHI normalerweise keine Schädelfrakturen, Hirnblutungen oder Todesfälle, die alle Kontraindikationen für ein "mildes" SHT in klinischen Populationen darstellen würden61. Zweitens erfordert das ACHI keine Kraniotomien, was von Bedeutung ist, da bekannt ist, dass sie Entzündungsreaktionen hervorrufen, die Symptome und Neuropathologien verschlimmern können67. Drittens erfordert das ACHI keine Anästhesie. Dies ist auch deshalb von Bedeutung, da die Anästhesie neuroprotektive Eigenschaften haben und neben der Lern- und Gedächtnisleistung auch die synaptische Plastizität beeinträchtigen kann 48,49,50,51,68. Schließlich kann der ACHI subtile vorübergehende Veränderungen der neurologischen Funktion hervorrufen, die sofort nach der Verletzung beurteilt werden können.

Da das ACHI normalerweise keinen Bewusstseinsverlust oder Apnoe induziert, ahmt dieses Modell ein mSHT bei einem signifikanten Teil der klinischen Population nach 69,70,71. Trotzdem führte das ACHI-Modell zu einer signifikanten Reduktion der NAP-Scores. Diese Reduktion hielt auch bei wiederholter Verabreichung des ACHI-Verfahrens an, verschlimmerte aber die sensomotorischen Beeinträchtigungen in der r-mSHT-Gruppe nicht. Dies deutet darauf hin, dass das ACHI-Modell eine leichte Verletzung induziert, die derjenigen entspricht, die nach einem erschütternden oder sub-erschütternden Kopfaufprall in klinischen Populationen beobachtet wurde72,73. Ein Hauptvorteil des NAP ist die Detektion subtiler Verhaltensdefizite, die im akuten Zeitrahmen nach r-mSHT beobachtet werden. Diese schnelle Untersuchung könnte es Forschern ermöglichen, Ratten anhand ihrer Verhaltensreaktionen zu kategorisieren. Die Verwendung robusterer Verhaltenstests zu subakuten und chronischen Zeitpunkten kann jedoch erforderlich sein, um motorische, kognitive und affektive Symptome zu erkennen74,75,76. Es ist wichtig anzumerken, dass es zwar keine Unterschiede in den NAP-Werten über die acht Verletzungen gab, das Verhalten der Nagetiere jedoch durch Veränderungen in der Umgebung und die Vertrautheit mit dem Experimentator beeinflusst werden kann77,78. Ratten sollten sich vor der Verabreichung von r-mSHT oder Scheinverletzungen an den Behandlungsraum gewöhnen können. Darüber hinaus ist es wichtig, dass eine Person für die Verwaltung der Auswirkungen verantwortlich ist, um die Konsistenz zu gewährleisten.

Trotz der zuvor erwähnten Vorteile des ACHI-Modells ist es nicht ohne Einschränkungen. Erstens wurde das Paradigma entwickelt, um die Kumulation von Stößen in einer einzigen Sitzung nachzuahmen und nicht wiederholte Verletzungen nach einer Erholungsphase. Nach einer Verletzung befindet sich das Gehirn in einem Fenster zerebraler Verwundbarkeit, das sich bei Nagetieren von 1 bis 5 Tagen nach der Verletzung erstreckt 15,79,80. Acht Verletzungen an einem einzigen Tag führen nicht dazu, dass sich akute und subakute Verletzungskaskaden entwickeln. Abhängig von der Forschungsfrage, die von Interesse ist, muss das Verletzungsparadigma daher möglicherweise innerhalb des Zeitfensters der Vulnerabilität angepasst werden. Zweitens ist es zwar von Vorteil, den Einsatz von Anästhetika einzuschränken, aber eine unbeabsichtigte Folge des ACHI-Modells besteht darin, dass die Ratten einem Fixierungsstress ausgesetzt werden. Es wurde gezeigt, dass die Exposition gegenüber akuten und chronischen Stressoren eine Entzündungsreaktion auslösen, eine Vielzahl von Verhaltensweisen beeinflussen und die synaptische Plastizität im Hippocampus verändernkann 81,82,83.

Das oben beschriebene Protokoll bietet eine eindeutige Methode zur Herstellung hochwertiger transversaler Hippocampusschnitte von Tieren, die mit r-mSHT verabreicht wurden, mit dem ACHI-Modell. Darüber hinaus ermöglicht das Protokoll stabile elektrophysiologische Ableitungen und zeigt, dass der Hippocampus nach r-mSHT immer noch in der Lage ist, synaptische Plastizität zu zeigen, obwohl es zu vorübergehenden Störungen kommen kann. Bei allen elektrophysiologischen Ableitungen ist die Schichtgesundheit von größter Bedeutung für die Fähigkeit, geeignete fEPSPs aufzuzeichnen. Um das Hirngewebe zu erhalten, ist es zwingend erforderlich, dass das Gehirn vor dem Schneiden eiskalt bleibt. Das Entfernen und Schneiden des Gehirns sollte schnell erfolgen, aber nicht, wenn dies auf Kosten der Pflege geht. Dieses Protokoll an juvenilen Tieren verwendet aCSF als Schneidlösung, aber je nach Alter des Tieres können schützende Schneidlösungen (wie Cholin-, Saccharose-, NMDG- oder Glycerin-basierte Lösungen) erforderlich sein84,85,86.

Elektrophysiologische Feldableitungen ermöglichen es den Forschern, die synaptische Plastizität des Hippocampus zu messen. Es gibt jedoch eine Reihe von Einschränkungen für die Technik. Es hat sich gezeigt, dass der Prozess des Schneidens des Gehirns Veränderungen in den Wirbelsäulennummern87 verursacht, die die synaptische Plastizität beeinträchtigen könnten. Die Verwendung von In-vivo-Ableitungen würde Signalwege erhalten und die Messung der synaptischen Plastizität bei anästhesierten oder lebenden Tieren ermöglichen88. Darüber hinaus untersucht die Verwendung von Feldaufzeichnungen die Eigenschaften von Gruppen von Neuronen, gibt aber keinen Aufschluss über Veränderungen in einzelnen Neuronen. Die Verwendung von Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitungen kann zeitlich detaillierte Informationen über neuronale Eigenschaften als Reaktion auf pharmakologische oder optogenetische Manipulationen liefern89. Darüber hinaus würde die Kombination elektrophysiologischer Ableitungen mit komplementären Techniken wie Kalziumbildgebung, Western Blotting, Immunhistochemie oder Elektronenmikroskopie den Forschern einen Einblick in die Wirkmechanismen ermöglichen.

Kognitive Defizite werden häufig nach r-mSHT berichtet, und das aktuelle Protokoll kann helfen, einige der zugrunde liegenden physiologischen Prozesse zu untersuchen, die mit diesen Defiziten verbunden sind. Insbesondere die Milde des ACHI-Verfahrens eröffnet die Möglichkeit, Veränderungen in der synaptischen Physiologie über die Lebensspanne von Tieren zu untersuchen, die an r-mSHT erkrankt sind. Das ACHI-Modell scheint ein ökologisch valides Modell für mSHT zu sein, das zur Untersuchung von r-mSHT verwendet werden kann. Vorläufige Studien, die das ACHI-Modell verwendeten, zeigten eine akute neurologische Beeinträchtigung ohne offensichtliche strukturelle Schädigung, wobei ein, vier und acht wiederholte Verletzungsparadigmen verabreicht wurden61,90. Zukünftige Studien werden untersuchen, wie sich are-mSHT auf die synaptische Plastizität während der Entwicklungsphasen und im alternden Gehirn auswirken kann. Durch ein besseres Verständnis der Pathophysiologie von mSHT und r-mSHT für die synaptische Funktion besteht die Hoffnung, potenzielle therapeutische Interventionen besser zu steuern, um die kognitive Funktion zu reduzieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken allen ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Christie Laboratory an der University of Victoria für ihre Beiträge zur Entwicklung dieses Protokolls. Dieses Projekt wurde mit Mitteln der Canadian Institutes for Health Research (CIHR: FRN 175042) und des NSERC (RGPIN-06104-2019) unterstützt. Die Schädelgrafik von Abbildung 1 wurde mit BioRender erstellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printed helment  Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience) 
Agarose  Fisher Scientific (BioReagents) BP160500
Anesthesia chamber Home Made N/A Plexiglass Container
Automatic Heater Controller Warner Electric TC-324B
Axon Digidata Molecular Devices 1440A Low-noise Data Acquisition System
Balance beam  Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)
Calcium Chloride Bio Basic Canada Inc.  CD0050 For aCSF
Camera Dage MTI NC-70
Carbogen tank Praxair MM OXCD5C-K Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95%
Clampex Software Molecular Devices Clampex 10.5 Version
Compresstome Vibrating Microtome Precisionary VF 310-0Z
Concentric Bipolar Electrode FHC Inc. CBAPC75
Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific (Chemical) D16-3 aCSF
Digital Stimulus Isolation Amplifier   Getting Instruments, Inc.  Model 4D
Disodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S373-500 PBS
Dissection Tools
Feather Double Edge Blade Electron Microscopy Sciences 72002-10
Filter Paper Whatman 1 1001-055
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-1000
Hair Claw Clip Can be obtained from any department store
Home and Recovery Cages Normal rat cages from animal care unit.
Hum Bug Noise Eliminator Quest Scientific  726300
Isoflurane USP Fresenius Kabi CP0406V2
Isotemp 215 Digital Water Bath Fisher Scientific  15-462-15
Leica Impact One CCI unit Leica Biosystems Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip
Long-Evans rats, male Charles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Low-Density Foam Pad 3" polyurethane foam sheet 
Magnesium Chloride Fisher Scientific (Chemical) M33-500 aCSF
Male Long Evans Rats Charles River Laboratories Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria
MultiClamp 700B Amplifier Molecular Devices Model 700B
pH Test Strips VWR Chemicals BDH BDH83931.601
Potassium Chloride Fisher Scientific (Chemical) P217-500 aCSF, PBS
Potassium Phosphate Sigma P9791-500G PBS
Push Button Controller Siskiyou Corporation  MC1000e Four-axis Closed Loop Controller Push-Button
Sample Discs ELITechGroup SS-033 For use with Vapor Pressure Osmometer
Small towel
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific (Chemical) S233-500 aCSF
Sodium Chloride Fisher Scientific (Chemical) S271-3 For aCSF, PBS
Sodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S369-500 aCSF
Soft Plastic Restraint Cones Braintree Scientific model DC-200
Stopwatch Many lab members use their iPhone for this
Table or large cart with raised edges  For NAP and ACHI
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament) Sutter Instrument BF150-110-10 Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm
Upright Microscope Olympus Olympus BX5OWI 5x MPlan 0.10 NA Objective lens
Vapor Pressure Osmometer Vapro Model 5600 aCSF should be 300-310 mOSM
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vibraplane Vibration Isolation Table Kinetic Systems 9101-01-45

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fu, T. S., Jing, R., McFaull, S. R., Cusimano, M. D. Health & economic burden of traumatic brain injury in the emergency department. Canadian Journal of Neurological Sciences. 43 (2), 238-247 (2016).
  2. Chen, C., Peng, J., Sribnick, E., Zhu, M., Xiang, H. Trend of age-adjusted rates of pediatric traumatic brain injury in US emergency departments from 2006 to 2013. International journal of environmental research and public health. 15 (6), 1171 (2018).
  3. Prins, M., Greco, T., Alexander, D., Giza, C. C. The pathophysiology of traumatic brain injury at a glance. Disease Models & Mechanisms. 6 (6), 1307-1315 (2013).
  4. Mayer, A. R., Quinn, D. K., Master, C. L. The spectrum of mild traumatic brain injury: a review. Neurology. 89 (6), 623-632 (2017).
  5. Kara, S., et al. Less than half of patients recover within 2 weeks of injury after a sports-related mild traumatic brain injury: a 2-year prospective study. Clinical Journal of Sport Medicine. 30 (2), 96-101 (2020).
  6. Chung, A. W., Mannix, R., Feldman, H. A., Grant, P. E., Im, K. Longitudinal structural connectomic and rich-club analysis in adolescent mTBI reveals persistent, distributed brain alterations acutely through to one year post-injury. arXiv. , (2019).
  7. Crisco, J. J., et al. Frequency and location of head impact exposures in individual collegiate football players. Journal of Athletic Training. 45 (6), 549-559 (2010).
  8. Wilcox, B. J., et al. Head impact exposure in male and female collegiate ice hockey players. Journal of Biomechanics. 47 (1), 109-114 (2014).
  9. Daniel, R. W., Rowson, S., Duma, S. M. Head impact exposure in youth football. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 976-981 (2012).
  10. Snowden, T., et al. Heading in the right direction: a critical review of studies examining the effects of heading in soccer players. Journal of Neurotrauma. 38 (2), 169-188 (2021).
  11. Zemek, R. L., et al. Annual and seasonal trends in ambulatory visits for pediatric concussion in Ontario between 2003 and 2013. The Journal of Pediatrics. 181, 222-228 (2017).
  12. Zhang, A. L., Sing, D. C., Rugg, C. M., Feeley, B. T., Senter, C. The rise of concussions in the adolescent population. Orthopaedic Journal of Sports Medicine. 4 (8), (2016).
  13. Broglio, S. P., Eckner, J. T., Paulson, H. L., Kutcher, J. S. Cognitive decline and aging: the role of concussive and subconcussive impacts. Exercise and Sport Sciences Reviews. 40 (3), 138 (2012).
  14. Greco, T., Ferguson, L., Giza, C., Prins, M. Mechanisms underlying vulnerabilities after repeat mild traumatic brain injuries. Experimental Neurology. 317, 206-213 (2019).
  15. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  16. Snowden, T. M., Hinde, A. K., Reid, H. M., Christie, B. R. Does mild traumatic brain injury increase the risk for dementia? A systematic review and meta-analysis. Journal of Alzheimer's Disease. 78 (2), 757-775 (2020).
  17. Guskiewicz, K. M., et al. Association between recurrent concussion and late-life cognitive impairment in retired professional football players. Neurosurgery. 57 (4), 719-726 (2005).
  18. McCradden, M. D., Cusimano, M. D. Staying true to Rowan's Law: how changing sport culture can realize the goal of the legislation. Canadian Journal of Public Health. 110 (2), 165-168 (2019).
  19. Carson, J. D., et al. Premature return to play and return to learn after a sport-related concussion: physician's chart review. Canadian Family Physician. 60 (6), 310-315 (2014).
  20. McClincy, M. P., Lovell, M. R., Pardini, J., Collins, M. W., Spore, M. K. Recovery from sports concussion in high school and collegiate athletes. Brain Injury. 20 (1), 33-39 (2006).
  21. Covassin, T., Savage, J. L., Bretzin, A. C., Fox, M. E. Sex differences in sport-related concussion long-term outcomes. International Journal of Psychophysiology. 132, 9-13 (2018).
  22. Frommer, L., et al. Sex differences in concussion symptoms of high school athletes. Journal of Athletic Training. 46 (1), 76-84 (2011).
  23. Wright, D., O'Brien, T., Shultz, S. R., Mychasiuk, R. Sex matters: Repetitive mild traumatic brain injury in adolescent rats. Annals of Clinical and Translational Neurology. 4 (9), 640-654 (2017).
  24. Stone, S., Lee, B., Garrison, J. C., Blueitt, D., Creed, K. Sex differences in time to return-to-play progression after sport-related concussion. Sports Health. 9 (1), 41-44 (2017).
  25. Cunningham, J., Broglio, S. P., O'Grady, M., Wilson, F. History of sport-related concussion and long-term clinical cognitive health outcomes in retired athletes: a systematic review. Journal of Athletic Training. 55 (2), 132-158 (2020).
  26. Montenigro, P. H., et al. Cumulative head impact exposure predicts later-life depression, apathy, executive dysfunction, and cognitive impairment in former high school and college football players. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 328-340 (2017).
  27. Lee, E. B., et al. Chronic traumatic encephalopathy is a common co-morbidity, but less frequent primary dementia in former soccer and rugby players. Acta Neuropathologica. 138 (3), 389-399 (2019).
  28. Di Virgilio, T. G., et al. Evidence for acute electrophysiological and cognitive changes following routine soccer heading. EBioMedicine. 13, 66-71 (2016).
  29. Cherry, J. D., et al. Microglial neuroinflammation contributes to tau accumulation in chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 1-9 (2016).
  30. Smith, D. H., Johnson, V. E., Stewart, W. Chronic neuropathologies of single and repetitive TBI: substrates of dementia. Nature Reviews Neurology. 9 (4), 211 (2013).
  31. Coughlin, J. M., et al. Neuroinflammation and brain atrophy in former NFL players: an in vivo multimodal imaging pilot study. Neurobiology of Disease. 74, 58-65 (2015).
  32. Wu, L., et al. Repetitive mild closed head injury in adolescent mice is associated with impaired proteostasis, neuroinflammation, and tauopathy. Journal of Neuroscience. 42 (12), 2418-2432 (2022).
  33. Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: translational challenges and strategies. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
  34. Sharp, D. J., Jenkins, P. O. Concussion is confusing us all. Practical Neurology. 15 (3), 172-186 (2015).
  35. Chen, Y., Huang, W., Constantini, S. The differences between blast-induced and sports-related brain injuries. Frontiers in Neurology. 4, 119 (2013).
  36. Collins, M. W., Kontos, A. P., Reynolds, E., Murawski, C. D., Fu, F. H. A comprehensive, targeted approach to the clinical care of athletes following sport-related concussion. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 22 (2), 235-246 (2014).
  37. Hiploylee, C., et al. Longitudinal study of postconcussion syndrome: not everyone recovers. Journal of Neurotrauma. 34 (8), 1511-1523 (2017).
  38. Rabinowitz, A. R., Fisher, A. J. Person-specific methods for characterizing the course and temporal dynamics of concussion symptomatology: a pilot study. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
  39. Shultz, S. R., et al. Tibial fracture exacerbates traumatic brain injury outcomes and neuroinflammation in a novel mouse model of multitrauma. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (8), 1339-1347 (2015).
  40. McDonald, S. J., Sun, M., Agoston, D. V., Shultz, S. R. The effect of concomitant peripheral injury on traumatic brain injury pathobiology and outcome. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 1-14 (2016).
  41. Statler, K. D., et al. Isoflurane exerts neuroprotective actions at or near the time of severe traumatic brain injury. Brain Research. 1076 (1), 216-224 (2006).
  42. Rowe, R. K., et al. Using anesthetics and analgesics in experimental traumatic brain injury. Lab Animal. 42 (8), 286-291 (2013).
  43. Luh, C., et al. Influence of a brief episode of anesthesia during the induction of experimental brain trauma on secondary brain damage and inflammation. PLoS One. 6 (5), 19948 (2011).
  44. Madry, C., et al. Microglial ramification, surveillance, and interleukin-1β release are regulated by the two-pore domain K+ channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
  45. Patel, P. M., Drummond, J. C., Cole, D. J., Goskowicz, R. L. Isoflurane reduces ischemia-induced glutamate release in rats subjected to forebrain ischemia. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 82 (4), 996-1003 (1995).
  46. Gray, J. J., Bickler, P. E., Fahlman, C. S., Zhan, X., Schuyler, J. A. Isoflurane neuroprotection in hypoxic hippocampal slice cultures involves increases in intracellular Ca2+ and mitogen-activated protein kinases. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 102 (3), 606-615 (2005).
  47. Flower, O., Hellings, S. Sedation in traumatic brain injury. Emergency Medicine International. 2012, 637171 (2012).
  48. Wagner, M., Ryu, Y. K., Smith, S. C., Mintz, C. D. Effects of anesthetics on brain circuit formation. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 26 (4), 358 (2014).
  49. Leikas, J. V., et al. Brief isoflurane anesthesia regulates striatal AKT-GSK3β signaling and ameliorates motor deficits in a rat model of early-stage Parkinson′ s disease. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 456-463 (2017).
  50. Turek, Z., Sykora, R., Matejovic, M., Cerny, V. Anesthesia and the microcirculation. in Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. , Sage CA. Los Angeles, CA. 249-258 (2009).
  51. Yang, S., et al. Anesthesia and surgery impair blood-brain barrier and cognitive function in mice. Frontiers in Immunology. 8, 902 (2017).
  52. Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. Journal of Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
  53. Mannix, R., et al. Adolescent mice demonstrate a distinct pattern of injury after repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 495-504 (2017).
  54. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Säljö, A. Evaluation of three animal models for concussion and serious brain injury. Annals of Biomedical Engineering. 40 (1), 213-226 (2012).
  55. Mychasiuk, R., Hehar, H., Candy, S., Ma, I., Esser, M. J. The direction of the acceleration and rotational forces associated with mild traumatic brain injury in rodents effect behavioural and molecular outcomes. Journal of Neuroscience Methods. 257, 168-178 (2016).
  56. Christie, B. R., et al. A rapid neurological assessment protocol for repeated mild traumatic brain injury in awake rats. Current Protocols in Neuroscience. 89 (1), 80 (2019).
  57. Buchanan, F. F., Myles, P. S., Leslie, K., Forbes, A., Cicuttini, F. Gender and recovery after general anesthesia combined with neuromuscular blocking drugs. Anesthesia & Analgesia. 102 (1), 291-297 (2006).
  58. Zhang, L., Gurao, M., Yang, K. H., King, A. I. Material characterization and computer model simulation of low density polyurethane foam used in a rodent traumatic brain injury model. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 93-98 (2011).
  59. Kikinis, Z., et al. Diffusion imaging of mild traumatic brain injury in the impact accelerated rodent model: A pilot study. Brain Injury. 31 (10), 1376-1381 (2017).
  60. Talty, C. -E., Norris, C., VandeVord, P. Defining experimental variability in actuator-driven closed head impact in rats. Annals of Biomedical Engineering. 50 (10), 1187-1202 (2022).
  61. Meconi, A., et al. Repeated mild traumatic brain injury can cause acute neurologic impairment without overt structural damage in juvenile rats. Plos One. 13 (5), (2018).
  62. Zilles, K. The Cortex of the Rat: a Stereotaxic Atlas. , Springer Science & Business Media. (2012).
  63. Fontaine, C. J., et al. Impaired bidirectional synaptic plasticity in juvenile offspring following prenatal ethanol exposure. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (10), 2153-2166 (2019).
  64. Fontaine, C. J., et al. Endocannabinoid receptors contribute significantly to multiple forms of long-term depression in the rat dentate gyrus. Learning & Memory. 27 (9), 380-389 (2020).
  65. Grafe, E. L., Wade, M. M., Hodson, C. E., Thomas, J. D., Christie, B. R. Postnatal choline supplementation rescues deficits in synaptic plasticity following prenatal ethanol exposure. Nutrients. 14 (10), 2004 (2022).
  66. Peñasco, S., et al. Intermittent ethanol exposure during adolescence impairs cannabinoid type 1 receptor-dependent long-term depression and recognition memory in adult mice. Neuropsychopharmacology. 45 (2), 309-318 (2020).
  67. Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
  68. Long, R. P., et al. Repeated isoflurane exposures impair long-term potentiation and increase basal GABAergic activity in the basolateral amygdala. Neural Plasticity. 2016, (2016).
  69. Meehan, W. P., Mannix, R. C., O'Brien, M. J., Collins, M. W. The prevalence of undiagnosed concussions in athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (5), 339 (2013).
  70. Moore, R. D., Lepine, J., Ellemberg, D. The independent influence of concussive and sub-concussive impacts on soccer players' neurophysiological and neuropsychological function. International Journal of Psychophysiology. 112, 22-30 (2017).
  71. Peltonen, K., et al. On-field signs of concussion predict deficits in cognitive functioning: Loss of consciousness, amnesia, and vacant look. Translational Sports Medicine. 3 (6), 565-573 (2020).
  72. Kontos, A. P., Sufrinko, A., Sandel, N., Emami, K., Collins, M. W. Sport-related concussion clinical profiles: clinical characteristics, targeted treatments, and preliminary evidence. Current Sports Medicine Reports. 18 (3), 82-92 (2019).
  73. Eisenberg, M. A., Meehan, W. P., Mannix, R. Duration and course of post-concussive symptoms. Pediatrics. 133 (6), 999-1006 (2014).
  74. Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 749-757 (2014).
  75. Malkesman, O., Tucker, L. B., Ozl, J., McCabe, J. T. Traumatic brain injury-modeling neuropsychiatric symptoms in rodents. Frontiers in Neurology. 4, 157 (2013).
  76. Shultz, S. R., MacFabe, D. F., Foley, K. A., Taylor, R., Cain, D. P. A single mild fluid percussion injury induces short-term behavioral and neuropathological changes in the Long-Evans rat: Support for an animal model of concussion. Behavioural Brain Research. 224 (2), 326-335 (2011).
  77. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  78. van Driel, K. S., Talling, J. C. Familiarity increases consistency in animal tests. Behavioural Brain Research. 159 (2), 243-245 (2005).
  79. Mouzon, B. C., et al. Chronic neuropathological and neurobehavioral changes in a repetitive mild traumatic brain injury model. Annals of Neurology. 75 (2), 241-254 (2014).
  80. Mannix, R., et al. Clinical correlates in an experimental model of repetitive mild brain injury. Annals of Neurology. 74 (1), 65-75 (2013).
  81. Bekhbat, M., et al. Chronic adolescent stress sex-specifically alters central and peripheral neuro-immune reactivity in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 76, 248-257 (2019).
  82. Pyter, L. M., Kelly, S. D., Harrell, C. S., Neigh, G. N. Sex differences in the effects of adolescent stress on adult brain inflammatory markers in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 30, 88-94 (2013).
  83. MacDougall, M. J., Howland, J. G. Acute stress, but not corticosterone, disrupts short-and long-term synaptic plasticity in rat dorsal subiculum via glucocorticoid receptor activation. Cerebral Cortex. 23 (11), 2611-2619 (2013).
  84. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-Clamp Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  85. Ting, J. T., Feng, G. Development of transgenic animals for optogenetic manipulation of mammalian nervous system function: progress and prospects for behavioral neuroscience. Behavioural Brain Research. 255, 3-18 (2013).
  86. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  87. Trivino-Paredes, J. S., Nahirney, P. C., Pinar, C., Grandes, P., Christie, B. R. Acute slice preparation for electrophysiology increases spine numbers equivalently in the male and female juvenile hippocampus: a DiI labeling study. Journal of Neurophysiology. 122 (3), 958-969 (2019).
  88. Bowden, J. B., Abraham, W. C., Harris, K. M. Differential effects of strain, circadian cycle, and stimulation pattern on LTP and concurrent LTD in the dentate gyrus of freely moving rats. Hippocampus. 22 (6), 1363-1370 (2012).
  89. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  90. Pham, L., et al. Mild closed-head injury in conscious rats causes transient neurobehavioral and glial disturbances: a novel experimental model of concussion. Journal of Neurotrauma. 36 (14), 2260-2271 (2019).

Tags

Neurowissenschaften Heft 191
Beurteilung von Veränderungen in der synaptischen Plastizität unter Verwendung eines wachen geschlossenen Kopfverletzungsmodells für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christie, B. R., Gross, A.,… More

Christie, B. R., Gross, A., Willoughby, A., Grafe, E., Brand, J., Bosdachin, E., Reid, H. M. O., Acosta, C., Eyolfson, E. Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (191), e64592, doi:10.3791/64592 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter