زراعة وتصوير شرائح الورم المخاطي الكاذب البريتوني خارج الجسم الحي من عينات الورم البشري المقطوعة
Summary
نحن نصف بروتوكولا لإنتاج وثقافة وتصور السرطانات البشرية ، والتي انتشرت إلى الأسطح البريتونية. يتم قطع عينات الورم المقطوعة باستخدام اهتزاز وزراعتها على إدخالات منفذة لزيادة الأوكسجين والقدرة على البقاء ، تليها تحليلات التصوير والمصب باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر وقياس التدفق الخلوي.
Abstract
الورم المخاطي الصفاق الكاذب (PMP) هو حالة نادرة تنتج عن انتشار ورم أولي مخاطي وما ينتج عن ذلك من تراكم الخلايا السرطانية التي تفرز الميوسين في التجويف البريتوني. يمكن أن ينشأ PMP من أنواع مختلفة من السرطانات ، بما في ذلك الزائدة الدودية والمبيض والقولون والمستقيم ، على الرغم من أن أورام الزائدة الدودية هي إلى حد بعيد المسببات الأكثر شيوعا. من الصعب دراسة PMP بسبب (1) ندرته ، (2) نماذج الفئران المحدودة ، و (3) الأنسجة المخاطية اللاخلوية. تسمح الطريقة المعروضة هنا بالتصور والاستجواب في الوقت الفعلي لأنواع الأورام هذه باستخدام شرائح النمط العضوي خارج الجسم الحي المشتقة من المريض في إعداد تظل فيه البيئة المكروية للورم (TME) سليمة. في هذا البروتوكول ، نصف أولا تحضير شرائح الورم باستخدام الاهتزاز والثقافة اللاحقة طويلة الأجل. ثانيا ، نصف التصوير البؤري لشرائح الورم وكيفية مراقبة القراءات الوظيفية للحياة وتصوير الكالسيوم والانتشار المحلي. باختصار ، يتم تحميل الشرائح بأصباغ التصوير ويتم وضعها في غرفة تصوير يمكن تركيبها على مجهر متحد البؤر. يتم استخدام مقاطع الفيديو ذات الفاصل الزمني والصور متحدة البؤر لتقييم الجدوى الأولية والوظائف الخلوية. يستكشف هذا الإجراء أيضا الحركة الخلوية الانتقالية ، وتفاعلات إشارات paracrine في TME. أخيرا ، وصفنا بروتوكول تفكك لشرائح الورم لاستخدامها في تحليل التدفق الخلوي. يمكن استخدام تحليل قياس التدفق الخلوي الكمي للاختبار العلاجي من مقاعد البدلاء إلى السرير لتحديد التغييرات التي تحدث داخل المشهد المناعي ومحتوى الخلايا الظهارية.
Introduction
الورم المخاطي الصفاق الكاذب (PMP) هو متلازمة نادرة بمعدل حدوث 1 لكل مليون شخص في السنة1. تحدث معظم حالات PMP بسبب النقائل من الأورام الزائدة الدودية. بالنظر إلى أن الفئران ليس لديها ملحق شبيه بالإنسان ، فإن نمذجة هذا النوع من السرطان تظل صعبة للغاية. في حين أن المرض الأساسي غالبا ما يكون قابلا للشفاء عن طريق الاستئصال الجراحي ، فإن خيارات العلاج للمرض النقيلي محدودة. لذلك ، فإن الأساس المنطقي لتطوير نموذج الشريحة العضوية الجديد هذا هو دراسة البيولوجيا المرضية ل PMP. حتى الآن ، لا توجد نماذج عضوية ملحقة يمكن استزراعها بشكل دائم. ومع ذلك ، فقد ثبت أن النموذج الحديث مفيد للاختبار الدوائي للعوامل العلاجية والعلاج المناعي2. على هذا النحو ، قمنا بتكييف نظام زراعة شرائح النمط العضوي ، والذي تم استخدامه في أنواع أخرى من السرطانات البشرية ، مثل الدماغ والثدي والبنكرياس والرئة والمبيض وغيرها3،4،5،6.
بالإضافة إلى الأورام الزائدة الدودية ، ينتج PMP أحيانا عن أنواع أخرى من الأورام ، بما في ذلك سرطانات المبيض7 ، وفي ظروف نادرة ، الأورام المخاطية الحليمية داخل القناة8 وسرطان القولون9. بالإضافة إلى ذلك ، تميل هذه الأورام إلى النمو ببطء ، مع معدلات نقش ضعيفة في نماذج xenograft المشتقة من المريض (PDX)10,11. بالنظر إلى هذه التحديات ، هناك حاجة غير ملباة لتطوير نماذج لدراسة هذا المرض للبدء في فهم البيولوجيا المرضية ل PMP ، وكيف يتم تجنيد هذه الخلايا السرطانية على الأسطح البريتونية ، وتتكاثر ، وتهرب من المراقبة المناعية.
بينما يتم قطع شرائح الورم من الدورة الدموية الوعائية الجهازية ، فإنها تحتوي على مكونات خلوية وغير خلوية ، بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية والخلايا اللحمية والخلايا المناعية والخلايا السرطانية والخلايا البطانية والأعصاب. تسمح هذه البيئة المكروية شبه السليمة بالتحقيق الوظيفي لأنواع الخلايا هذه ، وهو أمر مفيد بشكل فريد مقارنة بالثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد ، والتي تتكون فقط من الخلايا السرطانية12. في حين أن ثقافات الشرائح العضوية مفيدة في بعض النواحي ، إلا أنها بطبيعتها نهج قائم على الإنتاجية المنخفضة ، مقارنة بالمواد العضوية ثلاثية الأبعاد ، والتي يمكن توسيعها ، وهي مناسبة لفحص الأدوية العلاجية التجريبية المتعددة13،14،15. في حالة PMP ، لم تكن هناك تقارير توثق إنشاء موثوق وتمرير دائم للعضويات المشتقة من PMP16. من المحتمل أن يكون هذا بسبب الطبيعة البطيئة النمو للخلايا السرطانية المشتقة من PMP ، فضلا عن انخفاض عدد الخلايا الظهارية الخبيثة الموجودة داخل هذه الأورام المخاطية. نظرا للحاجة إلى تطوير نماذج لدراسة PMP ، فإن شرائح النمط العضوي مناسبة بشكل فريد لدراسة هذا المرض. نقدم بروتوكولا لإعداد وتصوير وتحليل PMP من العينات البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه المخطوطة تقنية يمكن استخدامها لاستزراع عينات الورم المخاطي الكاذب الصفاق (PMP) البشرية واستجوابها وتحليلها. لقد استخدمنا العديد من المقايسات الوظيفية النهائية لاستجواب البيئة المكروية المناعية للورم ومنصة للاختبار من مقاعد البدلاء إلى السرير.
في حين أن الطريقة عال…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا Kersi Pestonjamasp من المرفق الأساسي للتصوير في مركز مورس للسرطان للمساعدة في منح المجاهر مركز دعم السرطان المتخصص UCSD P30 2P30CA023100. تم دعم هذا العمل أيضا من خلال منحة نشر JoVE (JRW) ، بالإضافة إلى هدايا سخية من ملكية إليزابيث و Ad Creemers ، ومؤسسة Euske Family Foundation ، وصندوق أبحاث سرطان الجهاز الهضمي ، وصندوق أبحاث ورم خبيث بريتوني (AML).
Materials
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
References
- Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J. Pseudomyxoma peritonei. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2 (1), 44-50 (2010).
- Votanopoulos, K. I., et al. Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study. Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).
- Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture. Recherche en cancérologie. 58 (14), 2935-2940 (1998).
- Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases. The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).
- Mizuta, Y., et al. Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas. Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).
- Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review. Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).
- Fleten, K. G., et al. Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models. Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).
- Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment. Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Carr, N. J. New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy. Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).
- Votanopoulos, K. I., et al. Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy. Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).
- Weitz, J., et al. An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape. Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).
